PENUNTUN PRAKTIKUM

FARMASI
BIOMOLEKULER

Penyusun:
Dr. dr. Evi Kurniawaty, M. Sc.
Dr. Si. dr. Syazili Mustofa, M. Biomed.
dr. Giska Tri Putri, M. Ling
Nuriah, A. Md.
Suharyani, S.ST.

LABORATORIUM BIOKIMIA, BIOLOGI MOLEKULER DAN FISIOLOGI

FAKULTAS KEDOKTERAN

UNIVERSITAS LAMPUNG

2023
 PRAKATA

Puji syukur kami panjatkan kehadirat Illahi Robbi, atas segala rahmat dan karunia-Nya Buku Panduan
Praktikum Biomolekuler ini dapat tersusun dengan baik. Penyusunan buku panduan praktikum ini dimaksudkan
untuk membantu mahasiswa dalam menjalankan kegiatan praktikum, sehingga dapat memperoleh pemahaman
yang lebih baik dari teori yang telah dipelajari dalam kegiatan mini lecture maupun tutorial dalam Blok Elektif.

Buku penuntun praktikum ini disusun sejalan dengan pengembangan inovasi pembelajaran praktikum
Biomolekuler yang bertujuan untuk meningkatkan pemahaman ilmu biomolekuler melalui pembelajaran
praktikum berbasis permasalahan klinis. Dalam kegiatan praktikum ini mahasiswa juga akan dilatih untuk
mengidentifikasi permasalahan – mengumpulkan informasi melalui studi kepustakaan tentang hal-hal yang
berkaitan dengan permasalahan – melakukan pengukuran untuk mendapatkan data – mengevaluasi data yang
diperoleh – menarik kesimpulan – melaporkan hasil dan kesimpulan yang merupakan tambahan informasi untuk
lebih memahami teori yang mendasari atau berkaitan dengan permasalahan klinis yang dibahas.

Kepada semua pihak yang telah membantu penyusunan Penuntun Praktikum Biomolekuler ini kami
ucapkan terima kasih dan penghargaan.

Semoga Buku Penuntun Praktikum Biomolekuler ini dapat bermanfaat.

Bandar Lampung, Maret 2023

Penyusun
 PERATURAN TATA TERTIB LABORATORIUM BIOLOGI MOLEKULER

PERATURAN UMUM

1. Praktikan tidak boleh masuk ruangan laboratorium sebelum jam praktikum

2. Praktikan harus mengisi absensi sebelum melakukan praktikum
3. Sebelum praktikum dimulai sewaktu-waktu akan diadakan responsi/ pretest mengenai percobaan-
percobaan yang sudah/akan dilakukan, baik lisan atau tertulis.
4. Ketidakhadiran mahasiswa pada kegiatan praktikum harus disertai alasan yang sah. Selanjutnya
mahasiswa tersebut harus menyerahkan surat izin kepada Dosen Pembimbingnya sesegera mungkin.
Ketidakhadiran tanpa alasan yang sah menyebabkan mahasiswa tidak diperkenankan mengikuti ujian
praktikum Biomolekuler.
5. Hasil-hasil pekerjaan praktikum, keaktifan berdiskusi, responsi-responsi, pretest-posttest, akan
diperhitungkan dalam menentukan nilai akhir.
6. Setelah selesai melakukan percobaan praktikum, mahasiswa mendiskusikan topik bahasan dalam
kelompok masing-masing.
7. Mahasiswa diharuskan membuat laporan mengenai apa yang telah didiskusikan. Laporan diserahkan
minggu berikutnya.

PERATURAN KHUSUS

1. Jangan membuang kotoran/sampah ke dalam bak pencuci, buanglah ke tempat yang telah disediakan.
2. Jangan memindahkan/membawa botol-botol reagen dari tempatnya.
3. Pergunakan zat-zat seefisien mungkin sesuai dengan buku penuntun praktikum dan jagalah supaya
reagen tidak tercampur satu sama lain :
- Bila pada tiap botol reagen disediakan pipet, ambillah reagen dengan pipet tersebut, dan untuk
mengukurnya gunakanlah gelas ukur yang tersedia. Janganlah sekali-kali menuangkan reagen
dari botolnya, atau mempertukarkan pipet bersama tutupnya.
- Bila pada botol reagen tidak disediakan pipet khusus dapat digunakan pipet yang mempunyai
kalibrasi yang tersedia, tetapi tiap pengambilan zat haruslah pipet tersebut dibilas dengan air
terlebih dahulu.
4. Mikropipet yang Saudara pinjam, jika telah selesai dipergunakan agar dikembalikan ke tempat semula
yang telah disediakan
- Tips/ujung pipet bekas pakai agar disimpan pada tempat yang telah disediakan.
5. Hati-hatilah dengan zat-zat yang mudah terbakar, seperti : ether, benzen, alkohol. Jauhkan dari api.
6. Pemakaian bahan-bahan kimia yang uapnya beracun/berbau tidak enak, seperti : HCl pekat, asam sulfat
pekat, kloroform dan sebagainya, dikerjakan di lemari asam.
7. Membuang asam dan basa kuat harus dengan mengalirkan air yang banyak.
8. Semua alat harus bersih, jika perlu cucilah dengan campuran K-bichromat dan asam sulfat pekat
(terutama untuk biuret dan pipet)
9. Sekali-kali janganlah mempergunakan alat pusingan (sentrifugasi). Kalau belum mengetahui caranya :
- Tabung sentrifugasi harus selalu setimbang dan dipasang berhadapan
- Janganlah mencoba memanaskan tabung sentrifugasi
- Bersihkan tabung setiap kali sesudah memakai
10. Setiap kali sebelum dan sesudah praktikum, alat-alat harus diperiksa dahulu. Kalau ada yang
rusak/hilang segera laporkan.
11. Alat-alat yang rusak/hilang diganti oleh praktikan yang bersangkutan dalam waktu 1 minggu
12. Peminjaman alat-alat di luar inventaris sendiri, selalu memakai bon peminjaman. Kalau alat dikembalikan,
bon peminjaman alat harus diminta kembali.
13. Spesimen praktikum (darah, urin, air liur dan sebagainya) disiapkan oleh mahasiswa.

SANKSI-SANKSI

Praktikan-praktikan yang dianggap melanggar peraturan-peraturan di atas akan dikenakan sanksi sesuai dengan
berat ringannya pelanggaran, dan tidak diperkenankan mengikuti praktikum sampai tak diperkenan mengikuti
ujian.

Bandar Lampung, Maret 2023

Bagian Biomolekuler

Fakultas KedokteranUniversitas Lampung

 PEDOMAN PENGGUNAAN ALAT LABORATORIUM

BEKERJA TANPA KONTAMINASI

1. Bekerja di Biosafety Cabinet (BSC)

- Mencuci tangan
- Gunakan sandal/sepatu khusus
- Memakai jas lab, sarung tangan dan masker
- Buka penutup BSC sesuai tanda
- Kosongkan wadah tajam jika hampir penuh
- Bersihkan BSC dengan alcohol
- Siapkan semua alat yang sudah dibersihkan dengan alcohol
- Letakkan di dalam BSC kecuali kit/reagen
- Tutup BSC dan UV selama 15 menit

2. Bekerja dengan Bench

- Cuci tangan terlebih dahulu
- Gunakan sepatu tertutup, memakai jas lab, sarung tangan dan masker
- Kosongkan wadah benda tajam dan biohazard jika telah kira-kira 2/3 penuh
- Bersihkan bench dengan alcohol
- Siapkan semua alat dan bahan

PETUNJUK PENGGUNAAN DAN PERAWATAN ALAT-ALAT UMUM

1. Mikropipet
- Mikropipet yang ada di Biomolekuler adalah mikropipet dengan variable value yaitu volume
yang dapat diubah-ubah sesuai dengan kebutuhan.
- Saat mengambil mikropipet perhatikan jumlah larutan yang akan diambil dan rentang volume
mikropipet yang akan digunakan. Jika yang tertera hanya kapasitas maksimal (misal 1000 ul)
maka jumlah minimal yang dapat diambil adalah 10% dari jumlah maksimalnya.
- Jangan menggunakan mikropipet dengan volume di luar rentang kapasitas skalanya
- Jika selesai menggunakan mikropipet, kembalikan mikropipet pada skala tertinggi dan
letakkan pada tempat penyimpanan.

Metode Penggunaan Mikropipet

1. Forward : mengambil larutan dengan menekan first stop dan untuk mengeluarkan tekan
second stop

2. Reverse : digunakan untuk memipet zat yang mudah menguap atau kental. Mengambil larutan
dengan menekan second stop dan untuk mengeluarkan tekan first stop.

Cara Penggunaan mikropipet :

 1. Lihat manual pengoperasian yang disediakan dari pabriknya.
2. Putar kenop pengatur volume yang berlawanan arah jarum jam hingga volume yang
diinginkan.
3. Volume dapat dilihat pada digital indikator volume pada mikropipet.
4. Tekan kebawah volume yang diinginkan untuk mencegah udara masuk dan mempengaruhi
akurasi.
5. Pasang tip sekali pakai yang beru sesuai dengan ukuran mikropipet pada poros bawah
mikropipet dengan kekuatan yang cukup.
6. Pastikan tip tidak kendor.
7. Tekan kenop atas pengatur volume sampai terasa tahanan yang pertama
8. Pegang pipet secara vertical, masukkan ujung tip dalam cairan yang akan diambil.
9. Biarkan tombol untuk kembali perlahan ke posisi atas.
10. Berikan jeda sebentar untuk memastikan bahwa volume penuh, kemudian tarik ujung pipet
dari cairan.
11. Untuk mengeluarkan cairan, sentuhkan ujung tip pada dinding tabung sampel dan tekan
tombol dibagian atas mikropipet secara perlahan untuk mencegah terbentuknya aerosol.
12. Tunggu 1-2 detik, lalu tekan kenop ke tahanan kedua untuk mengeluarkan semua cairan.
13. Lepaskan secara perlahan tombol tekanan kenop.
14. Biarkan tombol kembali ke posisi atas.
15. Buang ujung tip pipet ke tempat sampah yang sesuai dengan menekan kenop tombol pelepas.
16. Jika melakukan pemipetan dengan bahan asam atau zat korosif, bongkar pipet pada saat
penyelesaian tugas untuk memeriksa dan (jika perlu) bersihkan piston, poros, dan rakitan seal
dengan aquadest atau alcohol isopropyl.
17. Untuk pemipetan cairan berpotensi menular, harus menggunakan benda tajam dan cabinet
keamanan biologis.
18. Kembalikan volume mikropipet ke volume tertinggi jika selesai digunakan.

2. Vortex Mix
Cara penggunaan :
1. Tekan tombol power
2. Atur kecepatan rpm yang dibutuhkan dengan memutar Dial Knop.
3. Letakkan tabung berisi sampel diatas rubber platform.
4. Campur sampel atau larutan sampai homogen.
5. Setelah selesai matikan alat dengan menekan tombol power on/off.

3. Spindown
Cara penggunaan :
1. Susun/letakkan tabung-tabung (tubes) di lubang spindown.
2. Pastikan keseimbangan peletakkan tubes tersebut.
3. Tekan ON, kemudian segera OFF.
4. Pastikan reagen atau kit sudah terspindown dengan benar.
PROSEDUR PEMBUANGAN SAMPAH/LIMBAH

Limbah padat medis : dibuang pada tempat sampah besar (untuk medis)
Limbah tajam : dibuang pada kontak limbah tajam yang diletakkan di bench.
Limbah Cair (sisa sampel darah, urin medium kultur, sel sisa reagen etanol, isopropanol, dl) :

- Limbah medis (sisa medium, darah, dll) sebelum dibuang, dekontaminasi dengan larutan klorin
(500 ml limbah + 1-2 tutup bayclin), diamkan overnight.
- Limbah kimia : masukkan ke dalam wadah jirigen terpisah sesuai bahan.
- Jika ada sampah padatnya, maka dibuang terlebih dahulu di plastik limbah padat.
 EKSTRAKSI DNA DARI DARAH

Bahan dan Alat yang dibutuhkan :

1. Kit QIAamp DNA Mini (Buffer AL, Buffer AW1, Buffer AW2, Buffer AE, Buffer ATL, Proteinase K)
2. Tabung mini sentrifus 1,5 ml
3. Tip 20 ul, 200 ul, 1000 ul.
4. Mikropipet
5. Sentrifus
6. Waterbath 56 0C
7. Spektrofotometer DNA/RNA
8. Sampel :Darah

Prosedur :

1. Campur darah dengan di bolak balik sampai homogeny

2. Pipet 20 ul Protease K, masukkan ke dalam tabung 1,5 ml
3. Tambahkan 200 ul darah, campur dengan membolak-balik sampai homogen.
4. Tambahkan 200 ul Buffer AL dan vortex for 15 detik.
5. Inkubasi di waterbath pada suhu 56 0C selama 10 menit dan setiap 3 menit sampel dibolak balik.
6. Spindown tube
7. Tambahkan 200 ul ethanol (96-100%) ke dalam tabung dan vortex selama 15 detik dan spindown
kembali.
8. Pindahkan semua larutan ke dalam Collection tube 2 ml
9. Sentrifus 8000 rpm selama 1 menit.
10. Supernatan dibuang dan ganti tabung 2 ml yang baru.
11. Masukkan 500 ul Buffer AW1 ke dalam Collection tube
12. Sentrifus 8.000 rpm selama 1 menit.
13. Buang supernatan dan pasang kembali tabung ke dalam collection tube.
14. Masukkan 500 ul Buffer AW2 ke dalam Collection tube
15. Sentrifus 14.000 rpm selama 3 menit.
16. Buang supernatan dan pasang kembali tabung ke dalam collection tube.
17. Sentrifus 14.000 rpm selama 1 menit untuk mengeringkan membrane matrik pada column.
18. Pindahkan column pada tabung 1,5 ml
19. Masukkan 200 ul Buffer AE atau akuabides.
20. Inkubasi pada suhu ruang selama 1 menit.
21. Sentrifus 8000 rpm selama 1 menit.
22. Simpan sampel larutan sebagai DNA pada suhu -20 0C
23. Buang limbah
24. Bersihkan meja kerja dan alat-alat yang akan digunakan dengan ethanol 70%.
Pemeriksaan Kadar DNA dengan Nanodrop

Bahan dan Alat :

1. Produk ekstraksi DNA

2. Blank
3. Tip filter
4. Micropipette
5. Alat Nanodrop

Prosedur :

1. Tekan tombol power dan tunggu sampai menu utama muncul

2. Pilih angka 1 untuk “DNA”
3. Path length pilih “automatic”
4. Dilution factor 1-9999, pipih sesuai pengenceran
5. Units ug/mL, ng/uL, pilih sesuai kebutuhan.
6. Factor ‘50” untuk DNA
7. Tekan tombol enter
8. Pengukuran Blank :
- Buka sampling head
- Pipet 2 ul nucleus free water ke bulatan sampel
- Tutup sampling head
- Tekan tombol kuvet kosong untuk mengukur reference.
- Buka sampling head, seka cairan pada plate atas dan bawah dengan kimwipes secara
pelan
9. Pengukuran sampel :
- Pipet 2 ul sampel ke bulatan sampel
- Tutup sampling head
- Tekan tombol kuvet untuk mengukur sample dan hasil absorbansi, kosentrasi dan rasio
DNA terhadap protein pada layar
- Buka sampling head, seka cairan pada plate atas dan bawah dengan kimwipes secara
pelan
10. Tekan tombol “Esc” sampai kembali ke menu awal
11. Tutup dan matikan alat.
PCR Konvensional

Bahan dan Alat :

1. Primer sequence :
- Forward : 5’ – AGG GAG AGA GAG AGT GGT G – 3’
- Reverse : 5’ – CTG TGG GTG AAA GTA GAA G – 3’
2. Template produk ekstraksi DNA
3. Kit PCR
4. Thermocycler Bioneer
5. Vortex
6. Mini sentrifus
7. Tip 10 ul, 20 ul, 200 ul
8. Micropipet
9. Tabung 0,2 ml
10. Tabung 1,5 ml

Prosedur :

1. Siapkan sampel hasil ekstraksi DNA

2. Keluarkan reagen dari -20 0C
3. Letakkan diatas ice box
4. Diamkan sampai mencair
5. Vortex dan spin semua reagen
6. Buat perhitungan mix PCR
Komponen 1 x reaksi (ul) ……..x reaksi (ul)

DDH2O 15

Kit PCR 20

Primer Forward (10 uM) 0,5

Primer Reverse 0,5

Template DNA 4

Total 40

7. Bagi campuran mix ke dalam tabung 0,2 ml

8. Tambahkan masing-masing 1 ul DN (100 ng/ul)
9. Campur dan dipipet secara naik turun menggunakan mikropipet
10. Sentrifus dengan cepat
11. Masukkan dalam mesin PCR dengan program suhu sebagai berikut :
 Tahapan PCR Suhu (0C) Waktu (detik) Keterangan

Pre Denaturasi 95 300

Denaturasi 95 60
Anneling 61 30 35 Siklus
Elongasi 72 60
Final Elongasi 72 300

Pendinginan 4 300

12. Simpan produk PCR di 4 0C untuk jangka waktu pendek atau -20 0C untuk jangka waktu panjang
atau langsung dilanjutkan ke elektroforesis

Visualisasi Hasil PCR dengan Gel Elektrophoresis

Bahan dan Alat :

1. Agarose
2. Buffer TAE
3. Sybergreen
4. DNA ladder
5. Loading dye
6. Neraca Analitik
7. Tabung Erlenmeyer
8. Microwave
9. Mesin Elektroforesis
10. Geldoc
11. Tip 10 ul, 20 ul, 200 ul
12. Micropipet

Prosedur :

1. Membuat gel agarose :

- Timbang agarose sebanyak 1 gr
- Masukkan ke dalam erlenmeyer
- Tambahkan 100 ml buffer TAE
- Campur dengan cara memutar
- Tutup Erlenmeyer dengan parafilm
- Panaskan di atas pemanas sampai agarose terbentuk Kristal dan homogeny
- Siapkan cetakan gel beserta sisirnya
- Diamkan gel di suhu ruang sampai hangat-hangat
- Tambahkan 5 ul sybergreen
 - Campur hingga homogen
- Tuang gel diatas cetakan
- Jika terdapat gelembung udara segera hilangkan dengan ujung tip bersih
- Miringkan sebentar + 5 detik cetakan gel sekitar 45 0 agar permukaan merata.
- Diamkan gel pada suhu ruang sampai gel mengeras
2. Tuang buffer TAE 1x ke dalam wadah sampai garis batas
3. Siapkan sampel DNA / produk PCR yang akan diperiksa dan diamkan pada suhu ruang
4. Siapkan DNA ladder dan loading dye, diamkan pada suhu ruang
5. Sentrifus cepat semua bahan
6. Melakukan prosedur elektroforesis :
- Lepaskan sisir gel dari cetakan
- Lepaskan gel beserta tray dari cetakan
- Masukkan gel beserta tray ke dalam wadah/chamber yang berisi TAE 1x
- Siapkan parafilm sesuai kebutuhan
- Ambil 2 ul loading dye, buat beberapa titik diatas parafilm sesuai kebutuhan
- Tambahkan masing-masing dye 5 ul sampel DNA/produk PCR
- Campur, masukkan 7 ul campuran ke dalam sumuran gel secara hati-hati (jangan sampai
ujung tip menusuk gel)
- Posisi Mikropipet tegak lurus
- Masukkan semua sampel dan control secara berurutan
- Masukkan 3 ul DNA ladder yang sudah bercampur dengan loading dye pada salah satu
sumuran.
- Tutup penutup chamber dan sambungkan kabel penghantar arus dengan power supply
(jangan sampai terbalik)
- Atur voltase dan waktu
- Tekan tombol start
- Setelah selesai tekan tombol stop
- Matikan alat
- Lepaskan kabel penghantar arus dari power supply
- Buka tutup
- Angkat gel dan baca hasil elektroforesis menggunakan alat geldok