Pengertian format hibridisasi

Adalah format atau metode untuk menempel kan

suatu fragmen asam inti (DNA/RNA) pada
fragmen asam inti yang lain .

Beberapa metode untuk melangsungkan

terjadinya hibridisasi antara lain:
> Dot blot
> Southern blot
> In Situ Hibridisasi
Manfaat Hibridisasi DNA.
1. Untuk mendeteksi adanya kelainan pada
gene (DNA).
2. Untuk mengetahui kemurnian molekul DNA.
3. Untuk mengetahui terinfeksinya suatu gene
oleh gene asing (bibit penyakit).
1.Dot Blot hibridisasi.
Metode ini relatif lebih sederhana dari metode-
metode yang lain
Prosedur:
Sampel sel /spesimen
(volume tertentu)
>spot(teteskan ) _ pada membran nitrosellulose
>keringkan - pada suhu kamar
Spot sampel pada membran
+larutan alkali -untuk meliliskan membr. Sel
(0,2N NaOH) - denaturasi DNA
ssDNA pada mbr.NITROSEL.
>panaskan 80o C =merekatkan ssDNA pada selam 20 menit
Nitro
ssDNA pada membr.NITROSEL. (kering)
+larutan probe - hibridisasi 2 12 jam
ssDNAhibridisasi dengan probe
>pencucian dg bufr - menghilangkan sisa probe
> keringkan - ditutup dengan film (24 jam)
Film terdapat spot (bila ada hibridisasi
2. Metode Southern blot hibridisasi (hl. 226)
Ds DNA target
(fingerprint dlm buffer)
- dimasukkan
Elektrophoresis
(fingerprint dipisahkan dlm gel agarose)
>larutan alkali - denaturasi DNA
(NaOH)
ssDNA target
(menempel pada gel agarose)
+mbr.Nitroselulose -menutup gel agarose
ssDNA pada gel agarose
(ditutup dengan mbr.Nitrosell.)
+ kertas filter - menutup mbr.Nitrosel
+ pemberat
ssDNA dari gel agarose pindah
ke mbr.Nitrosel.
+ film -menutup mbr.Nitrosel
Spot pada film untuk dianalisa
Skema Metode Southern blot
hibridisasi
3.In Situ Hibridisasi

Pengertian In Situ Hibridisasi adalah :

Proses hidridisasi yang DNA targetnya berasal
dari sel yang terinfeksi oleh virus atau bibit
penyakit yang ditargetkan.
Manfaat:
In situ hibridisasi merupakan metode yang
mudah dan murah untuk menentukan apakah
seorang pasien dapat dilakukan terapi dengan
cara tertentu.
Misalnya: Deteksi virus Dengue tipe 2
 Polymerase Chain Reaction (PCR)
PCR merupakan aplikasi dari proses hibridisasi.
Pengertian :
PCR adalah proses replikasi bahan genetik (DNA)
target dengan bantuan DNA primer dan enzim
DNA polimerase.
Tujuan :
Untuk memperbanyak fragmen-fragmen DNA
target yang dapat digunakan utuk pendeteksian
atau kepentingan lain.
Aplikasi PCR
1. Mendeteksi penyakit yang menginfeksi,
variasi dan mutasi gene (Powledge,2001).
2. Mengetahui hubungan kekerabatan antar
spesies (Powledge 2001).
3. Untuk penerapan dalam bidang klinik, obat-
obatan, dan forensik.
4. Mengembangkan teknik-teknik bidang
genetika dan diagnosa (Davis et.al, 1994)
5. Untuk DNA library.
Pembuatan cDNA library menggunakan teknik
Transverse Replikasi PCR atau RT- PCR
Komponen yang diperlukan PCR
1. DNA target :
Fragmen DNA hasil isolasi dari sel target yang akan direplikasikan.
Fragmen DNA yang akan menjadi template dalam PCR
2. DNA primer:
Diperlukan dua fragmen DNA primer yang dibuat dalam laboratorium
dan merupakan rangkaian oligonukleotida (9 20 nukleotida) yang
masing-masing dapat ber
hibridisasi dengan ssDNA target.
Syarat DNA primer:
a. Kandungan C/G 45 60%
b. Perbedaan suhu annaeling kedua DNA primer hanya 1o
c. Ujung 3 harus C/G, dan tidak boleh lebih dari 2 basa-N
d. Rangkaian DNA primer tidak boleh ada rangkaian basa-N
yang dapat menyebabkan ikatan dimmer.
Komponen PCR (Lanjut)

3. Enzim DNA polimerase:

- Enzim yang diperlukan untuk replikasi DNA
- Enzim ini diisolasi dari mikroorganisme.
Syarat:
Enzim harus tahan terhadap suhu tinggi
dan suhu rendah (lihat hal. 232).
4. Elektrophoresis, untuk memisahkan
fragmen-framen DNA hasil PCR
Prosedure atau proses PCR
Proses PCR terdiri dari tiga tahap , yaitu
(lihat hl.231).
1. Tahap I, merupakan tahap denaturasi dari dsDNA target dengan
pemanasan pada suhu 94o C, sehingga dihasilkan
ssDNA target.
2. Tahap II, Annaeling, merupakan tahap hibridisasi antara ssDNA
target dengan masing- masing DNA primer, yang berlangsung
pada suhu 34o C s/d 60o C.
3. Tahap III, tahap ekstensi atau tahap perpanjangan
rangkaian DNA primer dengan bantuan enzim DNA
polimerase, yang berlangsung pada suhu 72o C
Catatan :
1.Tahap I s/d III dapat diulang (repeated)
2.Pengulangan jangan lebih dari 40 X
3. suhu annaeling = Ta = Tm -5.
Tm = 4( G + C ) + 2 ( A + T )
Skema prosedure PCR
Catatan ( lanjut)
4. Jumlah enzim , DNA target dan DNA primer harus cukup
untuk pengulangan , agar ti dak perlu
penambahan bahan baru sebelum target
pengulangan selesai.
5. Setiap akhir sikles (pengulangan) akan
menghasilkan sejumlah jutaan copy DNA target yang
disebut amplikon.
6. Jumlah amplikon yang dihasilkan setiap akhir sikles
PCR dapat dirumuskan :
Mf = Mi X 2n
Mf : jumlah amplikon yang dihasilkan.
Mi : jumlah molekul DNA awal.
n : jumlah sikles PCR yang dilakukan
Contoh :

Bila jumlah molekul DNA awal = 50 mol., dan

dilakukan sikles dalam PCR sebanyak 5 X,
maka jumlah amplikon yang dihasilkan adalah

Mf = 50 X 25 = 50 X 32 = 1600
 Kondisi untuk suatu tipe PCR :
Parameter Konsentrasi

Template 10 attomoles ( 1 X 106 molekul)

pH 8,4 ( 10 mM Tris HCl )

dNTP 200 uM
Gelatin 100 g/ ml
Primer Hasi banyak > 1,0 uM 0,1 uM < hasil sedikit
Konsentrasi enzim 1 unit

Volume 25 100 ul

Suhu 55o -94o C , tergantung dari tahap pelaksanaan PCR

Faktor-faktor yang mempengaruhi PCR

1. pH
2. suhu
3. dNTP
4. konsentrasi Mg++
5. konsentrasi primer
6. konsentrasi DNA target
7. jenis enzim
 Ligase Chain Reaction (LCR)
Pengertian :
proses replikasi bahan genetik yang menggu
nakan enzim ligase disamping enzim DNA po
limerase.
Manfaat :
Untuk mendeteksi adanya kelaian pada
struktur DNA target , misalnya akibat mutasi
(point mutation) dan karena adanya infeksi
virus atau bibit penyakit yang lain.
 Beda
LCR PCR

1.menggunakan 2 pasang 1.Mengunakan satu pasang

DNA primer. DNA primer.
2.tidak memerlukan DNA 2.Memerlukan DNA kualitas
kualitas tinggi. tinggi
3.untuk mendeteksi kelainan 3. Untuk membentuk amplikon
struktur DNA target sebanyak-banyaknya.
Komponen yang diperlukan pada LCR

1. DNA target

2. 4 fragmen DNA primer ( 2 pasang)

3. Enzim DNA polimerase

4. Enzim ligase.
 Prosedure (Proses) LCR
ds DNA target
pemanasn 94o C denaturasi DNA
2 mol. ssDNA target
+4 fragmen DNA proses annaeling
primer pada suhu 54o C
ssDNA target
(masing2 berhibridisasi dengan 2 DNA primer)
-dipanaskan 74oC tahap ekstensi
2 mol. Ds DNA
(setelah DNA primer mengalami ekstensi)