THERMAL CYCLER DAN

ELEKTROFORESIS

Kelompok 5:
Intan Wulan Sari
Khatimatul Husna
Lina Safitri
Maidah Hayati
Nadya Fahmilia
Nurkholifah
Resti Eka Rahayu
Siti Fadlillah
THERMAL
CYCLER
 PENGERTIAN THERMAL CYCLER
Thermal Cycler (juga dikenal sebagai
thermocycler, mesin PCR atau amplifier DNA)
adalah peralatan laboratorium yang paling umum
digunakan untuk memperbanyak segmen DNA
melalui polymerase chain reaction (PCR).
Thermal Cycler juga mengontrol suhu, naik
dan turun sesuai dengan program yang dimasukan
kedalam komputer PCR tersebut, sehingga proses
polymerase chain reaction (PCR) terjadi.
 FUNGSI THERMAL CYCLER

Thermal cycler merupakan suatu mesin

yang dapat mengubah suhu sesuai dengan waku
dan urutan yang telah ditentukan. Mesin tersebut
digunakan untuk mempermudah teknik PCR.
KOMPONEN THERMAL CYCLER
 KETERANGAN KOMPONEN
1. Reaction block : Komponen yang memegang pelat,
tabung atau strip tabung yang berisi sampel.
2. Heated inner lid : Memanaskan bagian atas sampel
untuk mencegah penguapan dan pengembunan.
3. Touch screen : Untuk mengontrol alat dengan layar
touch screen
4. USB port : Terhubung ke USB flash drive untuk transfer
data
5. Status LED : Menyala selama pengoperasian normal;
berkedip saat alat berada dalam keadaan standby.
6. Air vents : Menyediakan ventilasi untuk memungkinkan
thermal cycler panas dan dingin dengan cepat.
 PRINSIP
Pengulangan siklus pemanasan dan pendinginan
suhu reaksi secara cepat dengan proses
berlangsungnya pemisahan untaian DNA hingga
proses replikasi enzimatik DNA.
 CARA KERJA
1. Pembuatan reaction mixture terlebih dahulu, Setelah reaction mixture selesai
dibuat.
2. Hubungkan kabel daya yang disertakan ke stopkontak yang sesuai
3. Nyalakan Thermal cycler dengan saklar daya pada panel belakang
4. Thermal cycler menjalankan self-test untuk memverifikasi fungsi yang benar,
dan kemudian menampilkan layar awal.
5. Untuk memulai fungsi di layar awal, sentuh
tombol untuk setiap fungsi:
• New Protokol - membuat protokol baru
• Saved protocols - untuk melihat, mengedit, dan menjalankan protokol
tersimpan
• Inkubasi - untuk berjalan pada suhu konstan yang serupa dengan inkubator
• Tools - log, pengaturan, swauji, informasi sistem, dan update firmware.

6. Untuk membuka tutupnya, angkat pegangan

tutup sampai penutup tetap terbuka tanpa bantuan.
7. Masukan sampel , Untuk memastikan pemanasan dan pendinginan
yang merata, wadah harus berada dalam kontak penuh dengan blok
reaksi. Kontak yang memadai dicapai dengan:
• Mengkonfirmasi bahwa blok tersebut bersih sebelum memuat
sampel
• Tekan dengan kuat masing-masing tabung atau lempeng mikro ke
dalam sumur blok
8. Untuk menutup tutupnya, dorong penutup ke bawah sampai berhenti
9. Untuk memulai pengujian, gunakan salah satu metode berikut:
• Buat sebuah protokol baru, lalu sentuh Run
• Pilih sebuah protokol dari layar Saved Protocols, lalu sentuh Run
10. Layar Protokol yang Disimpan diatur dalam tiga panel:
• Panel Folders menampilkan semua folder pada instrumen
dan flash drive USB jika USB flash drive terhubung
• File panel menampilkan semua file protokol dalam folder
yang dipilih
• Panel pratinjau menampilkan pratinjau file protokol yang
dipilih.
11. Pilih sebuah protokol dari layar Protokol yang Disimpan,
sentuh Edit, buat perubahannya, lalu sentuh Run.
12. Instrumen mengkonfirmasikan run dan volume sampel
13. Sentuh OK untuk menjalankan protokol, atau sentuh Volume
untuk mengedit volume sampel.
14. Alat akan memulai siklus PCR.
15. Hasil PCR dapat divisualisasikan dengan menggunakan teknik
elektroforesis.
 KALIBRASI

Thermal cycler digunakan sebagai peralatan

pengujian di laboratorium terakreditasi, harus
dikalibrasi secara teratur 1 tahun sekali. Kalibrasi biasa
dilakukan oleh pihak luar atau instansi yang memiliki
wewenang menangani kalibrasi alat thermal cycler
misalnya: biomedis kalibrierservice GmbH & Co.
KG.,PT CALTESYS INDONESIA.
 CARA PERAWATAN
1. Untuk mencegah sengatan listrik, matikan instrumen sebelum
membersihkannya.
2. Eksterior cycler thermal T100 harus dibersihkan dengan jadwal reguler
untuk menghilangkan kotoran yang menganggu fungsi alat.
3. Bersihkan ventilasi udara. Lepaskan debu dengan sikat lembut, kain
lembab, atau penyedot debu
4. Bersihkan layar sentuh. Bersihkan kotoran di panel kontrol dengan
kain lembut dan cairan pembersih layar komersial atau larutan sabun
ringan.
5. Bersihkan bagian luar dan penutup thermal cycler. Gunakan kain
lembab atau tissue untuk membersihkan tumpahan dari luar
6. Bersihkan Heated inner lid . Gunakan kain
lembut dan air untuk menghilangkan kotoran dan
larutan
7. Bersihkan sumur-sumur blok. Bersihkan
tumpahan segera agar tidak mengering di dalam
sumur. Gunakan pipet plastik sekali pakai dengan
air (disarankan), etanol 95%, atau pengenceran 1:
100 pemutih dalam air. Selalu bilas sumur dengan
air beberapa kali untuk menghilangkan semua
bekas etanol, pemutih, atau sabun
8. Mengganti sekering secara reguler untuk
mempertahankan operasi tanpa gangguan
 PCR KONVENSIONAL
• Prinsip:
Isolasi RNA atau DNA dilanjutkan dengan karakterisasi
terhadap kemurniannya. Sampel RNA murni diawali dengan
tahap transkripsi balik (reverse transcriptase) tetapi tahap
ini tidak dilakukan apabila sampel berupa DNA murni.
Jumlah amplifikasi fragmen DNA pada PCR konvensional
divisualisasikan dengan menggunakan agar elektroforesis.
Penandaan fragmen DNA dengan fluorescent dye dan
intensitas pita DNA dapat diukur dengan menggunakan
mesin

• Reagen : Elektroforesis/ agarose gel

• Sampel : Darah, virus, bakteri, tanaman, DNA pangan
 PCR REAL TIME
Dapat diketahui jumlah amplicon secara kuantitatif, pada setiap
siklus, berdasarkan perbandingannya terhadap kurva nilai kontrol.
karena adanya sinyal fluorofor yang dilepas/ berkaitan saat terjadi
reaksi, yang kemudian akan ditangkap dan direkam oleh sensor
mesin Q-PCR.
• Prinsip :
DNA yang telah diamplifikasi dihitung setelah diakumulasikan
dalam reaksi secara real time sesudah setiap siklus amplifikasi
selesai.
• Reagen : Zat pewarna fluoresens seperti SYBR Green dan
probe/penanda
• Sampel : Darah, virus, bakteri, tanaman, DNA pangan
ELEKTROFORES
IS
 PENGERTIAN ELEKTROFORESIS

Elektroforesis adalah teknik pemisahan komponen atau

molekul bermuatan berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya
dalam suatu matriks yang dipengaruhi oleh medan listrik.
Elektroforesis menyediakan informasi mengenai ukuran,
muatan, dan jenis komponen yang dielektroforesis.
Aplikasi elektroforesis yaitu untuk uji paternitas dan
identifikasi pelaku kejahatan (DNA fingerprinting), Elektroforesis
juga berperan dalam human genome project.
 5 JENIS GEL YANG DAPAT DIGUNAKAN
DALAM ELEKTROFORESIS DNA YAITU
• Gel poliakrilamida berfungsi untuk menganalisis
hasil ekstensi primer.
• Gel alkalin agarosa berfungsi untuk memisahkan
rantai DNA yang berukuran besar.
• Gel agarosa berfungsi untuk menyediakan sistem
elektroforesis yang digunakan untuk fraksi RNA
pada ukuran standar.
• Gel pati dan cellulose acetat digunakan untuk
memisahkan molekul DNA yang bermuatan
negatif.
 MANFAAT ALAT ELEKTROFORESIS
Untuk menyediakan informasi mengenai
ukuran, konfirmasi dan muatan dari protein
dan asam nukleat.
Sebagai metode pemisahan yang dapat
digunakan untuk menentukan komponen dari
protein atau asam nukleat setiap individu.
 JENIS-JENIS ELEKTROFORESIS
Elektroforesis bebas (free electrophoresis) :
molekul atau partikel yang akan dipisahkan
tersebar di seluruh larutan.
Elektroforesis zona: merupakan jenis
elektroforesis yang paling banyak digunakan
yang mempergunakan media penunjang,
seperti kertas, selulosa asetat, agarose atau
poliakrilamid.
KOMPONEN ALAT ELEKTROFORESIS

• Mikropipet
Berfungsi untuk
memindahkan
sampel dan
larutan lainnya
dari tube ke
dalam wells pad
a aparatus
elektroforesis.
KOMPONEN ALAT ELEKTROFORESIS

 Aparatus Elektroforesis
Aparatus elektroforesis
terdiri atas:
 Comb (sisir) yang
membentuk well (sumu
r) pada gel agarosa
 Tray yang merupakan
wadah cetakan gel
 Chamber yang
merupakan medium
tempat berlangsungnya
proses elektroforesis
KOMPONEN ALAT ELEKTROFORESIS

• Power Supply
(DC)
Berfungsi sebagai
sumber energi
untuk aparatus
elektroforesis.
 KOMPONEN ALAT ELEKTROFORESIS
• Gel doc
Alat yang digunakan untuk
mengamati dan
mendokumentasikan hasil
elektroforesis. Komponen gel doc
terdiri dari:
 Lampu UV berfungsi menerangi
bagian dalam dalam dari gel
doc,
 Kamera berfungsi memotret
hasil elektroforesis,
 Komputer berfungsi
menjalankan proses
dokumentasi lewat bantuan
software
KOMPONEN ALAT ELEKTROFORESIS

• Power Supply
(DC)
Berfungsi
sebagai sumber
energi untuk
aparatus
elektroforesis.
 KOMPONEN ALAT ELEKTROFORESIS
• Gel doc
Alat yang digunakan untuk
mengamati dan
mendokumentasikan hasil
elektroforesis. Komponen gel
doc terdiri dari:
• Lampu UV berfungsi
menerangi bagian dalam
dalam dari gel doc,
• Kamera berfungsi memotret
hasil elektroforesis,
• Komputer berfungsi
menjalankan proses
dokumentasi lewat bantuan
software
 PRINSIP KERJA ALAT
ELEKTROFORESIS
Prinsip kerja elektroforesis gel dimulai saat
makromolekul yang bermuatan listrik ditempatkan
pada medium berisi tenaga listrik. Molekul-molekul
tersebut akan bermigrasi menuju kutub positif atau
kutub negatif berdasarkan muatan yang terkandung
di dalamnya. Molekul-molekul yang bermuatan
negatif (anion) akan bergerak menuju kutub positif
(anoda), sedangkan molekul-molekul yang
bermuatan positif (kation) akan bergerak menuju
kutub negatif (katoda).
 INSTRUKSI KERJA ALAT
ELEKTROFORESIS
a) Pembuatan Gel Agarose
• 0,4 gram bubuk agarose dilarutkan pada 50 ml Buffer
TAE .
• Campuran tersebut dilarutkan dengan cara
dipanaskan.
• Setelah semua terlarut kemudian didiamkan pada
suhu ±50°C.
• Gel comb dipasang pada tangki elektroforesis.
• Larutan agarose dituangkan pada tangki
elektroforesis dan didinginkan hingga mengeras.
• Setelah gel tersebut mengeras, gel comb dapat
diambil dan gel agarose siap untuk digunakan.
 INSTRUKSI KERJA ALAT
ELEKTROFORESIS

b) Proses Elektroforesis
• Elektroforesis Gel Agarose direndam dengan Buffer TAE.
• 1µl loading dye dicampur dengan 3µl produk DNA pada
parafilm yang telah tersedia dengan bantuan mikropipet.
• Campuran tersebut dituangkan ke sumur/well pada gel
agarose. Sedangkan untuk 3µl DNA marker 1kb dituangkan
pada sumur/ well yang berada pada paling tepi atas dan
bawah.
• Tangki elektroforesis kemudian ditutup dan dihubungkan ke
power supply.
• Power Supply ( 400 MA, 90 V) dinyalakan selama 30 menit.
 INSTRUKSI KERJA ALAT
ELEKTROFORESIS
c) Dokumentasi
• Gel agarose hasil elektroforesis direndam
pada larutan EtBr selama ± 15 menit.
• Dilanjutkan dengan direndam dalam aquadest
selama ± 15 menit.
• Gel agarose lalu divisualisasi dengan
menggunakan Gel Doc dan kemudian diambil
gambarnya.
HASIL PENGAMATAN DARI PENGUKURAN
ALAT ELEKTROFORESIS
 Macam-macam metode Blotting
1. Southern Blot
Southern blot pertama kali dikemukakan oleh
Southern (1975). Teknik ini mentrasfer DNA
ke kertas NC dengan menggunakan prosedur
aliran pelarut.
 2. Northern Blot
• Northern Blot merupakan tekniknya sama
dengan Sothern Blot, namun menggunakan
kertas DBM dan biasanya mendeteksi RNA.
 3. Eastern Blot
• Eastern Blot merupakan teknik yang
ditemukan oleh Reinhard dan Malamud
(1982), adalah proses transfer bidirectional
dengan menggunakan aliran pelarut protein
dari gel ke NC berdasarkan titik isoelektrik.
 4. Western Blot
• Teknik ini pertama kali dibuat oleh W. Neal
Burnette. Western Blot merupakan teknik
untuk mendeteksi protein spesifik pada
sampel jaringan yang homogenat ataupun dari
suatu ekstraksi berdasarkan kemampuan
protein tersebut berkaitan dengan antibodi.
 PEMELIHARAAN ALAT
ELEKTROFORESIS

Setiap selesai pemakaian alat langsung

disiram dengan air keran dan dicuci
Simpan alat di tempatnya dalam keadaan
kering.
 KALIBRASI ALAT ELEKTROFORESIS

Kalibrasi alat Elektroforesis dilakukan oleh

pihak ketiga seperti badan yang menangani
pengkalibrasian alat instrumentasi laboratorium.
KELEBIHAN DAN KEKURANGAN ALAT
ELEKTROFORESIS
Kelebihan
 Mudahnya mengamati reaksi kimia
selama proses berlangsung
 Sampel dapat ditangani dengan
baik dan cepat
 Gel dari hasil percobaan dapat
disimpan dalam kantong plastik
dan didinginkan setelah percobaan,
sehingga dapat dipakai untuk
dokumentasi penting yang dapat
dipelajari lebih lanjut di lain waktu
Kekurangan
 Waktu pengerjaannya lama
 Terbatasnya jumlah sampel
yang dapat diperiksa.
 Terkadang hasil PCR dalam gel
muncul pita yang tidak
berbentuk (ghost atau smeary
bands) atau pita yang
terlampau banyak sehingga
hasilnya sulit diinterpretasikan
 Rawan terjadi kesalahan pada
proses pemindahan campuran
sampel ke dalam slot gel,
karena slot gel ukurannya
sangat kecil
Elektroforesis gel agarosa (Horizontal)
• Elektroforesis gel agarosa dijadikan sebagai metode standar
untuk memisahkan, mengidentifikasi dan memurnikan
fragmen DNA atau RNA. Gel agarosa memiliki resolusi yang
lebih rendah daripada gel poliakrilamid, akan tetapi gel ini
dapat memisahkan DNA yang berukuran sampai puluhan kilo
pasang basa. Elektroforesis gel agarosa dapat memisahkan
fragmen DNA dan RNA yang berukuran lebih besar dari 100
bp (base pair) hingga 50 kb dan memisahkan protein dengan
ukuran > 200 kDa dengan gerak medan yang digunakan
adalah secara horizontal.
Keuntungan Kekurangan
1. Teknik yang digunakan sederhana 1. Lebih mudah rusak oleh
2. Preparasi gel lebih cepat
3. Pembuatan gel agarosa lebih tangan sehingga
mudah dan bersifat non toksik membutuhkan kehati-
4. Laju pemisahan lebih cepat hatian
sehingga fragmen DNA pun lebih
cepat terbentuk 2. Bands yang dihasilkan
5. Dapat memisahkan campuran
potongan DNA sesuai dengan dapat berkabut dan
ukurannya menyebar agak jauh.
6. Dapat dilakukan pada suhu kamar
 Elektroforesis gel poliakrilamid (Vertikal)

Elektroforesis menggunakan gel poliakrilamid dilakukan pada medan gerak

vertikal. Gel poliakrilamid dapat menampung jumlah DNA yang lebih besar
daripada gel agarose.

Gel poliakrilamid sering digunakan untuk uji kualitatif protein, meskipun juga
digunakan untuk uji kualitatif DNA. Resolusi dalam memisahkan DNA lebih
tinggi jika dibandingkan gel agarosa sehingga panjang molekul DNA yang
berbeda hanya satu nukleotida dapat dideteksi. Elektroforesis gel poliakrilamid
dapat memisahkan protein dengan ukuran 5—200 kDa, sedangkan untuk
pemisahan fragmen DNA hanya dalam rentang ukuran DNA yang sempit yaitu
antara 5—500 bp.
Keuntungan Kekurangan
1. Pembuatannya lebih sulit
dibanding gel agarosa, karena
1. Laju pemisahan fragmen
biasanya digunakan lebih lambat dibandingkan
poliakrilamid dengan resolusi menggunakan gel agarosa
yang tinggi 2. Membutuhkan persentase
2. Membutuhkan biaya yang lebih konsentrasi yang lebih
mahal
banyak
3. Preparsi yang lebih lama
4. Bersifat toksik sehingga harus 3. Voltase yang digunakan
lebih berhati-hati dalam lebih tinggi
penanganannya
5. Dapat menampung jumlah DNA
yang lebih besar daripada gel
agarose
PERBEDAAN ELEKTROFORESIS GEL AGAROSE DAN POLIAKRILAMID

No Elektroforesis Gel Agarose (Horizontal) Elektroforesis Gel Poliakrilamid (Vertikal)

Dapat memisahkan fragmen DNA antara 100bp-50kb Lebih efektif untuk pemisahan fragmen DNA
1.
antara 5-500 bp
Dapat memisahkan protein dengan ukuran >200kDa Dapat memisahkan protein dengan ukuran
2. >2000kDa

3. Preparasai gel lebih cepat Preparasai gel lebih lama

4. Biaya lebih murah Biaya lebih mahal
5. Voltase yang digunakan lebih rendah Voltase yang digunakan lebih tinggi
6. Di running dengan arah horizontal Di running dengan arah vertikal
7. Laju pemisahannya lebih cepat Laju pemisahannya lebih lama
8. Non-toxic, lebih mudah dalam penanganannya Toxic, lebih hati-hati dalam penanganannya
Presentase konsentrasi yang digunakan lebih rendah Presentase konsentrasi yang digunakan lebih
9.
banyak