Teknologi DNA Rekombinan

Yohanes Eugenius H. ( 18502034 )

Pembahasan
01 Pengertian dan prinsip
teknologi

02 Isolasi DNA

03 PCR ( Polymerase Chain

Reaction )

04 RT – PCR ( Reverse
Transcription Polymerase
Chain Reaction
Pembahasan
05 Sekuensing DNA

06 Analisis Restriction
Fragment Length
Polimorphism ( RFLP )
 Pengertian dan prinsip teknologi Rekombinan

Teknologi DNA Rekombinan merupakan kumpulan teknik atau metode yang digunakan untuk mengkombinasikan gen
– gen di dalam tabung reaksi. Teknik – teknik tersebut meliputi:
 Teknik untuk mengisolasi DNA
 Teknik untuk memotong DNA
 Teknik untuk menggabungkan atau menyambung DNA
 Teknik untuk memasukkan DNA ke dalam sel hidup
Kumpulan teknik – teknik atau metoda – metoda yang telah dikembangkan oleh para ilmuwan telah mungkinkan bagi
kita untuk: mengisolasi DNA dari berbagai organisme, menggabungkan DNA yang berasal dari organisme yang
berbeda sehingga terbentuk kombinasi DNA ( DNA Rekombinan ), memasukkan DNA Rekombinan ke dalam sel
organisme prokariot maupun eukariot hingga DNA Rekombinan tersebut dapat bereplikasi dan bahkan dapat di
ekspresikan.
 Tahap – Tahapan Isolasi DNA
Gambar Proses pufrifikasi
DNA dengan
menggunakan metode
silika dan kolom
kromatografi (a) proses 01 03
pengikatan DNA ke silika Tahapan
02
Tahapan Tahapan
dengan bantuan Pelisisan Sentrifugasi Ekstraksi

perubahan konsentrasi
garam, (b) DNA dielusi
untuk memperoleh DNA 04 05
(Brown, 2010). 06
( http://staff.unila.ac.id/pri Tahapan Tahapan Tahapan
Purifikasi Sentrifugasi Presipitasi
yambodo/archives/646 )

Gambar Asam nukleat berada pada lapisan air

setelah disentrifugasi pada tahapan ekstraksi
(Clark, 2010)
( http://staff.unila.ac.id/priyambodo/archives/646 )
 PCR ( Polymerase Chain Reaction )

PCR adalah teknik yang kuat digunakan untuk memperkuat DNA jutaan kali lipat, dengan replikasi berulang template,
dalam waktu singkat. Proses ini menggunakan set tertentu dalam vitro oligonukleotida sintesis untuk sintesis DNA
prima. Desain primer tergantung pada urutan DNA yang diinginkan untuk dianalisis. Teknik ini dilakukan melalui
banyak siklus (biasanya 20-50) pencairan template pada suhu tinggi, yang memungkinkan primer untuk anil untuk
urutan gratis dalam template dan kemudian mereplikasi template dengan DNA polimerase. Proses ini telah otomatis
dengan menggunakan DNA polimerase termostabil diisolasi dari bakteri yang tumbuh di ventilasi termal di laut atau air
panas. Selama putaran pertama replikasi satu salinan DNA dikonversi menjadi dua salinan dan seterusnya
mengakibatkan peningkatan eksponensial jumlah salinan dari urutan yang ditargetkan oleh primer. Setelah hanya 20
siklus satu salinan DNA diperkuat lebih dari 2.000.000 kali lipat. Produk dari reaksi PCR dianalisis dengan pemisahan
dalam gel agarosa diikuti oleh bromida pewarnaan dan visualisasi dengan transillumination ultraviolet.

Gambar Jumlah Kopi DNA yang

dihasilkan melalui proses PCR
( https://simdos.unud.ac.id/uploads/file
_penelitian_1_dir/6778c79d173755122
a3bc876b14b2f15.pdf )
 RT – PCR ( Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction )

RT-PCR adalah prosedur yang cepat dan kuantitatif untuk analisis tingkat ekspresi gen. Teknik ini memanfaatkan
kemampuan reverse transcriptase (RT) untuk mengubah RNA menjadi cDNA beruntai tunggal dan pasangan itu
dengan amplifikasi PCR-dimediasi jenis cDNA tertentu dalam reaksi RT. cDNA yang dihasilkan selama reaksi RT
merupakan representasi ke pola gen yang sedang diekspresikan pada saat ekstraksi RNA.
Total RNA seluler dapat diekstraksi dari jaringan atau sel melalui berbagai teknik dan digunakan sebagai template
untuk RT. Pada beberapa kasus, isolasi RNA pertamakali menggunakan primer acak. Sebuah alikuot kecil reaksi RT
ini kemudian ditambahkan ke reaksi PCR mengandung primer spesifik untuk melakukan amplifikasi. Produk-produk
dari RT-PCR bisa kemudian divisualisasikan seperti dijelaskan di atas untuk PCR standar (Cox, T.M. 1997).

Gambar Perbedaan RT – PCR &

PCR
( https://www.slideshare.net/iqraw
azir7/rt-pcr-reverse-transcription-
pcr )
 Sekuensing DNA

Sekuensing DNA dapat dilakukan secara kimia atau cara enzimatik. Teknik konvensional untuk sequencing dengan
metode sekuensing Maxam dan Gilbert, bergantung pada replikasi nukleotida atau DNA dan tidak secara rutin
digunakan lagi. Teknik enzimatik, Sanger sequencing, melibatkan penggunaan dideoxynucleotides (2 ', 3'-dideoksi)
yang mengakhiri sintesis DNA dan karena itu disebut sekuensing terminasi rantai dideoksi.

Gambar Protokol Sanger sekuensing DNA

menggunakan dideoxynucleotides
( ddNTPs ) untuk menghentikan
perpanjangan rantai DNA dari template
kloning selama sintesis in vitro.
( https://simdos.unud.ac.id/uploads/file_pe
nelitian_1_dir/6778c79d173755122a3bc87
6b14b2f15.pdf )
 Analisis Restriction Fragment Length Polimorphism ( RFPL )

Variabilitas genetik pada lokus tertentu (gen) perubahan dasar akibat kecil bahkan dapat mengubah pola fragmen
restriksi enzim pencernaan yang dapat dihasilkan. perubahan patogen untuk genotipik bisa karena penghapusan atau
sisipan di dalam gen yang dianalisis atau bahkan substitusi nukleotida tunggal yang dapat membuat atau menghapus
situs enzim restriksi pengakuan (Mizuguchi, H dan Kay, M.A. 1998).
Analisis RFLP mengambil keuntungan dari hal ini dan memanfaatkan Southern blotting direstriksi oleh endonuclease
DNA genom untuk mendeteksi pola keluarga dari fragmen gen yang diberikan, terdeteksi dengan penapisan Southern
blotting dengan probe sesuai dengan gen yang diinginkan. Sebuah contoh klasik dari penyakit yang terdeteksi oleh
RFLP adalah anemia sel sabit (Ross, D.W. 1996).
RFLP mendeteksi kedua salinan: yang Alel terpengaruh dan alel terpengaruh. Ukuran variabilitas dalam fragmen
terdeteksi dalam silsilah keluarga menunjukkan perbedaan dalam pola situs restriksi dalam dan di sekitar gen yang
sedang dianalisis (Gaspar, HB. Dan Kinnon, C. 1991). Pola RFLP yang diwariskan dan memisahkan dalam mode
Mendel sehingga memungkinkan penggunaannya dalam genotip seperti dalam kasus sengketa ayah atau dalam
investigasi kriminal.

Gambar Respresentation diagram dari analisis

RFLP untuk kehadiran lokus sel sabit.
(https://simdos.unud.ac.id/uploads/file_peneliti
an_1_dir/6778c79d173755122a3bc876b14b2f
15.pdf)
THANK YOU
Insert the Subtitle of Your Presentation