ANALISA KUANTITATIF

MIKROORGANISME

Noor Tifauzah
• Analisis kuantitatif mikrobiologi pada
bahan pangan penting dilakukan
untuk mengetahui mutu bahan
pangan dan menghitung proses
pengawetan yg akan diterapkan pada
bahan pangan tersebut.
Beberapa cara menghitung atau mengukur jml
mikrobia dlm suspensi atau bahan :
A. Perhitungan jumlah sel
1. Hitungan mikroskopik
2. Hitungan cawan
3. MPN (Most Probable Number).
B. Perhitungan massa sel scr langsung
1. Volumetrik
2. Gravimetrik
3. Kekeruhan (turbidimetri)
C. Perhitungan massa sel scr tdk langsung
1. Analisis komponen sel (protein, DNA, ATP, dll)
2. Analisis produk katabolisme (metabolit
primer, sekunder)
3. Analisis konsumsi nutrien (karbon, nitrogen,
oksigen, dll)
• Perhitungan massa sel secara langsung maupun
tidak langsung jarang digunakan dalam uji
mikrobiologi bahan pangan, tetapi sering
digunakan untuk mengukur pertumbuhan sel
selama proses fermentasi.
• Dalam perhitungan scr langsung, jumlah
sel mikrobia dapat dihitung jika medium
pertumbuhannya tdk mengganggu
pengukuran. (perlakuan awal dg
menyaring sel-sel mikrobia/ jasad renik),
sehingga apabila substrat tempat
tumbuhnya banyak mengandung
padatan maka sel jasad renik tdk bisa
diukur dg metode tsb.
Cara perhitungan jml sel yang umum digunakan dlm uji
mikrobiologi bhn pangan yaitu :

1. Hitungan mikroskopik (Direct Microscopic

Counts)
2. Hitungan cawan (Total Plate Count)
3. MPN (Most Probable Number)
 Hitungan Mikroskopik

• Metode Breed dan Metode Petroff-Hausser

1. Metode Breed
Sering digunakan untuk menganalisis susu yg
mengandung bakteri dlm jumlah tinggi (susu
yg diperoleh dr sapi yg terkena mastistis yaitu
suatu penyakit infeksi yg menyerang kelenjar
susu sapi.
Cara ini merupakan cara yg cepat, yaitu
menghitung bakteri secara langsung
menggunakan mikroskop.
Kelemahannya : tidak dapat dilakukan pada
susu yg telah dipasteurisasi krn secara
mikroskopik tidak dapat dibedakan antara sel
yg hidup maupun yg sudah mati
• Caranya menghitung, terlebih dahulu menghitung
luas areal pandang. untuk menghitung jumlah
bakteri di dalam susu, sebanyak 0,01 ml susu dipipet
dg pipet Breed dan disebarkan di atas gelas obyek
sehingga mencapai luas 1 cm2, didiamkan sampai
kering, difiksasi, dan diwarnai dg metilene biru.

Rata-rata jumlah bakteri per areal pandang

mikroskop ditentukan setelah mengamati 10
sampai 60 kali areal pandang tergantung dari
jumlah bakteri per areal pandang
• Hasil perhitungannya biasanya lebih
mendekati hasil perhitungan jumlah bakteri
menggunakan agar cawan.
• Pada sapi yg terkena mastitis, susunya
mengandung sel-sel darah putih dalam jumlah
tinggi. Setelah dg pewarnaan metilen biru, sel-
sel darah putih akan terlihat sebagai sel yg
bulat atau berbentuk tdk teratur, berwarna
biru dengan ukuran lebih besar daripada
bakteri.
•  
•  
2. Metode Petroff-Hausser
dalam metode ini hitungan mikroskopik
dilakukan dg pertolongan kotak-kotak skala, di
mana setiap ukuran skala seluas 1 mm2
terdapat 25 buah ktak besar dengan luas 0.04
mm2 dan setiap kotak besar terdiri dari 16
kotak kecil. Tinggi sampel yg terletak diantara
gelas obyek dengan gelas penutup adalah
0.02 mm.
• Jumlah sel dalam beberapa kotak besar dihitung, kemudian
dihitung jumlah sel rata-rata dalam satu kotak besar.
• Jumlah sel per ml sampel dapat dihitung sbb:
• Jml sel ml sampel = jml sel per x 25 kotak x 1 x 103
kotak besar 0.02

 
Jumlah sel/mm2
Jumlah sel/mm3
Jumlah sel/cm3 (ml)
• Jml sel per ml sampel = jml sel per kotak besar x 25 x 50 x 103
= jml sel per kotak besar x 1.25 x 106
• Hitungan mikroskopik merupakan metode
yg cepat & murah, tetapi mempunyai
beberapa kelemahan :
1. Sel-sel yg telah mati tdk dapat
dibedakan dr sel-sel yg hidup, mk
keduanya akan terhitung
2. Sel-sel yg berukuran sangat kecil sukar
dilihat di bawah mikroskop, sehingga
kadang2 tak terhitung
3. Utk mempertinggi ketelitian, jumlah sel
dlm suspensi harus cukup tinggi
(bakteri minimal 10⁶ sel/ml.)
4. Tdk dpt digunakan utk menghitung sel
jasad renik di dlm bahan pangan yg
banyak mengandung ekstrak makanan,
krn akan mengganggu dlm perhitungan
sel.
 Prinsip Hitungan Cawan

• Metode utk menghitung jumlah mikrobia

dalam bahan pangan tdr dr:
1. “Most Propable Number” (MPN)
2. Hitungan Mikroskopik Langsung
Pengenceran:
• Bahan pangan yg diperkirakan
mengandung >300 sel mikrobia per ml,
per g memerlukan pengenceran.
• Pengenceran biasanya dilakukan secara
desimal yaitu 1:10, 1:100, 1:1000 dst
• Pengambilan sampel dilakukan scr aseptik
dan setiap pengenceran dilakukan
pengocokan sebanyak 25 kali
• Untuk mengetahui mikrobia bagian luar
(permukaan) bahan daging sapi, ayam
atau ikan menggunakan metode ulas
(swab)
• Larutan yg digunakan dapat berupa :
a. Larutan fosfat bufer.
b. Larutan garam fisiologi 0,85%
c. Larutan Ringer
 Untuk bahan yg sukar larut :
• Misal tepung atau pati
kedalam larutan pengencer pertama
ditambahkan pasir putih atau butir-butir gelas
sebanyak satu sendok pasir ke dalam 90 atau
99 ml yg disterilisasi bersama larutan
pengencer.
Butir-butir gelas digunakan jika akan
menganalisa total mikrobia dari telur.
Metode hitungan cawan merupakan cara yg
paling sensitif utk menghitung jml mikrobia krn :
1. Hanya sel yg masih hidup yg dihitung
2. Beberapa jenis mikrobia dapat dihitung
sekaligus
3. Dapat digunakan utk isolasi dan identifikasi
mikrobia karena koloni yg terbentuk
mungkin berasal dari satu sel mikrobia dg
penampakan pertumbuhan spesifik
 Kelemahannya:
• Hasil perhitungan tidak menunjukkan jumlah sel
mikrobia yg sebenarnya, krn beberapa sel yg
berdekatan mungkin membentuk satu koloni
• Medium & kondisi yg berbeda mungkin menghasilkan
nilai yg berbeda
• Mikorbia yg ditumbuhkan harus dapat tumbuh pada
medium padat & membentuk koloni yg kompak & jelas
• Memerlukan persiapan & waktu inkubasi beberapa
hari
 Metode hitungan cawan dpt dibedakan :

1. Metode tuang (pour plate)

2. Metode permukaan (surfase/ spread
plate)
1. Metode Tuang
• Dari pengenceran yg dikehendaki sebanyak 1ml
atau 0,1ml, sebaiknya waktu antara dimulai
pengenceran sampai menuangkan ke dalam cawan
petri tidak boleh lebih lama dr 30 menit.
• Kemudian masukkan nutrien agar cair steril (50⁰C)
sebanyak 15 ml secara aseptik, dan tutup tidak
boleh dibuka terlalu lebar. Cawan digerakkan utk
menyebarkan sel-sel mikrobia scr merata, ditunggu
beku kemudian diinkubasi dg posisi terbalik.
 Lanjutan........
• Inkubasi dilakukan pada suhu & waktu tertentu
sesuai dengan jenis mikrobia, medium yg digunakan
juga disesuaikan dg jenis mikrobia. Sel-sel yg masih
hidup akan tumbuh & membentuk koloni.
• Koloni dihitung dan setiap koloni dapat dianggap
berasal dari satu sel yg membelah menjadi banyak
sel.
• Penghitungan jumlah koloni menggunakan “Quebec
Colony Counter”
 2. Metode Permukaan
• Nutrien agar seril dituangkan ke dalam cawan
petri steril dan dibiarkan membeku, kemudian
0,1 ml sampel yg telah diencerkan dipipet pd
permukaan agar.
• Batang gelas melengkung dicelupkan pd alkohol
95% dan dipijarkan agar alkohol habis, kemudian
untuk meratakan sampel di atas media.
• Perlu diingat sampel yg ditumbuhkan hanya
0,1ml tidak boleh 1 ml.
 Cara penghitungan koloni:
• Penghitungan lebih mudah & cepat jika
pengenceran dilakukan secara desimal. Contoh:
1. Mengencerkan 1 ml susu ke dalam 9 ml
larutan pengencer dst tergantung pada mutu
susu.
2. Setelah diinkubasi dihitung misal 60 dan 64
koloni masing2 pada cawan petri duplo pada
pengenceran 10⁻⁴, maka jumlah koloni dapat
dihitung sbb :
1 ml larutan pengencer dianggap mempunyai berat 1g
Faktor pengenceran = Pengenceran x jumlah yg ditumbuhkan
= 10⁻⁴ x 1.0
= 10⁻⁴
Jumlah koloni per ml = Jml koloni per cawan x 1/ fkt pengenceran
= (60+64)/2 x 1/ 10⁻⁴
= 6.2 x 10⁵
 Standar Perhitungan
Untuk melaporkan suatu hasil analisa mikrobiologi
digunakan suatu standar yg disebut “Standard plate
Count” (SPC)
Cara menghitung koloni pada cawan :
1. Cawan yg dipilih & dihitung adalah yg mengandung
jumlah koloni antara 30 & 300
2. Beberapa koloni yg bergabung menjadi satu merupakan
suatu kumpulan koloni yg besar dihitung 1 koloni
3. Suatu deretan (rantai) koloni yg terlihat sebagai suatu
garis tebal dihitung sebagai satu koloni
 Data yg dilaporkan sebagai SPC harus
mengikuti peraturan2 sbb:

1. Hasil yg dilaporkan hanya terdiri dari dua

angka, yaitu angka pertama di depan koma
dan angka kedua dibelakang koma. Jika
angka yg ketiga sama dg atau lebih besar dr
5 harus dibulatkan satu angka lebih tinggi
pd angka yg kedua
• Jml koloni SPC Keterangan
per pengenceran
10⁻2 10⁻3 10⁻4

234 28 1 2.3 x 10⁴ 28 dan 1< 30

700 125 10 1.3 x 10⁵ 700 > 300; 10 < 30
TBUD TBUD 197 2.0 x 10⁶ TBUD > 300

TBUD = Terlalu Banyak Untuk Dihitung

2. Jika semua pengenceran yg dibuat
menghasilkan angka kurang dari 30 koloni pd
cawan petri, hanya jumlah koloni pada
pengenceran terendah yg dihitung. Hasilnya
dilaporkan sebagai kurang dari 30 dikalikan
dg besarnya pengenceran, tetapi jumlah yg
sebenarnya harus dicantumkan dalam tanda
kurung.
• Jml koloni “Standard Plate Count” Keterangan
per pengenceran
10⁻2 10⁻3 10⁻4

16 1 0 <3.0 x 103 Hitung pengenceran

(1.6 x 103) 10⁻2

3. Jika semua pengenceran yg dibuat menghasilkan lebih

dari 300 koloni pada cawan petri, hanya jumlah koloni
peda pengenceran yg tertinggi yg dihitung, misalnya dg
cara menghitung jumlahnya pada ¼ bagian cawan petri,
hasilnya dikalikan 4. Hasilnya dilaporkan sebagai lebih
dari 300 dikalikan dg besarnya pengenceran, tetapi jumlah yg
sebenarnya harus dicantumkan dalam tanda kurung.
• Jml koloni SPC Keterangan
per pengenceran
10⁻2 10⁻3 10⁻4

TBUD TBUD 355 > 3.0 x 10⁶ Hitung pengenceran

(3.6 X 10⁶ ) 10⁻⁴
TBUD 325 20 > 3.0 x 10⁵ Hitung pengenceran
(3.3 x 10⁵) 10⁻3
4. Jika cawan dari dua tingkat pengenceran
menghasilkan koloni dengan jumlah antara 30
dan 300, dan perbandingan antara hasil tertinggi
dan terendah dari kedua pengenceran tersebut
lebi kecil atau sama dengan 2, tentukan rata-rata
dari kedua nilai tsb dg memperhitungkan
pengencerannya. Jika perbandingan antara hasil
tertinggi dan terendah lebih besar dari 2, yg
dilaporkan hanya hasil yg terkecil.
• Jml koloni SPC Keterangan
per pengenceran
10⁻2 10⁻3 10⁻4

293 41 4 > 3.5 x 10⁴ Hitung rata-ratanya krn

41000/29300 = 1.4 (<2)
140 32 2 1.4 x 10⁴ Hitung rata-ratanya krn
32000/14000 = 2.3 (>2)
5. Jika digunakan dua cawan petri (duplo) per
pengenceran, data yg diambil harus dari
kedua cawan tersebut, tidak boleh diambil
salah satu, meskipun salah satu dari cawan
duplo tersebut tidak memenuhi syarat di
antara 30 dan 300.
• Jml koloni SPC Keterangan
per pengenceran
10⁻2 10⁻3 10⁻4

175 16 1 1.9 x 10⁴ rata-rata dr pengenceran 10⁻2

208 17 0

138 42 2 1.5 x 10⁴ rata-rata dr pengenceran 10⁻2

162 43 4 krn perbandingan antara
pengenceran 10⁻3 dan 10⁻⁴ adl 2.4
 290 36 4 3.1 x 10⁴ rata-rata dr pengenceran 10⁻ 2 dan
280 32 1 10⁻ 3 krn perbandingan antara kedua
pengenceran adalah 1.2

291 25 3 3.0 x 10⁴ rata-rata dr pengenceran 10⁻ 2

305 27 0 meskipun 305 >300 (angka yg lain
<30)
 Total mikrobia berdasarkan kelompok
• Total mikrobia. Prinsip hitungan cawan dapat
digunakan untuk menghitung jumlah mikrobia
didalam contoh, yaitu dengan menggunakan
Plate Count Agar (PCA) sebagai medium
pemupukan.
PCA adalah suatu medium yg mengandung 0,5%
tripton, 0,25% ekstrak khamir dan 0,1 % glukosa,
sehingga semua mikroba termasuk bakteri,
kapang dan khamir dapat tumbuh dengan baik.
• Total Bakteri. Untuk menghitung total bakteri
dengan metode hitungan cawan digunakan
Nutrient Agar (NA).
NA adalah suatu medium yg mengandung
sumber nitrogen dalam jumlah cukup yaitu
0,3% ekstrak sari, 0,5% pepton, tetapi tidak
mengandung sumber karbohidrat, maka baik
untuk pertumbuhan bakteri tetapi kapang dan
khamir tidak dapat tumbuh dengan baik.
• Total Spora bakteri. Untuk menghitung jumlah
spora bakteri pada contoh makanan, suspensi
contoh harus dipanaskan terlebih dahulu pada
suhu 80⁰C selama 10 menit untuk membunuh sel
vegatatif bakteri, kapang, khamir maupun spora
kapang dan khamir.
Medium yg digunakan untuk spora aerobik
adalah Nutrient Agar, sedangkan untuk spora
anaerobik dpt digunakan Chopped Meat Medium
• Total kapang dan khamir. Jumlah kapang dan
khamir dalam makanan dapat dihitung dengan
metode hitungan cawan menggunakan medium
Potato Dextrose Agar (PDA).
Jika di dalam sampel diduga mengandung juga
bakteri dalam jumlah tinggi, maka
pertumbuhan bakteri dapat dihambat dengan
menambahkan asam tartarat 10% steril ke
dalam PDA setelah disterilkan
• Jumlah yg ditambahkan biasanya adalah 1 ml asam
tartarat 10% kedalam setiap 100 ml PDA steril.
• PDA adalah suatu medium yg mengandung sumber
karbohidrat dalam jumlah cukup, yaitu terdiri dari 20%
ekstrak kentang dan 2% glukose, sehingga baik untuk
pertumbuhan kapang dan khamir tetapi kurang baik
untuk pertumbuhan bakteri.
• Dengan menurunkan pH PDA menjadi kira-kira 3.5
pertumbuhan bakteri akan terhambat. PDA yg telah
diasamkan tsb disebut Acidified Potato Dextrose Agar
(APD).
Komposisi medium :
1. Nutrien Agar (NA)
Ekstrak sapi 3 g
Pepton 5 g
Agar 15 g
Air destilata 1000 ml
pH 6.8
2. Potato Dextrose Agar (PCA)
Tripton 5 g
Ekstrak khamir 1.5 g
Dektrose 1 g
Agar 15 g
Air destilata 1000 ml
pH 7.0
3. Potato Dextrose Agar (PDA)
Infusi kentang 200 g
Dextrose 20 g
Agar 15 g
Air destilata 800 ml

4. Acidified PDA (APDA)

Komposisi seperti PDA, tetapi setelah sterilisasi,
pHnya diatur menjadi 3,5 – 4,0 dengan larutan
asam tartarat 10%. Biasanya dibutuhkan 1 ml
larutan asam tartarat 10% dalam 100 ml PDA.
 Metode MPN
• Metode MPN menggunakan medium cair didalam
tabung reaksi, perhitungannya berdasarkan jumlah
tabung yg positif yaitu yg sudah ditumbuhi mikrobia
setelah diperam.
• Pengamatan tabung yg positif dapat dilihat dg
mengamati timbulnya kekeruhan, atau terbentuknya
gas di dalam tabung durham.
• Untuk setiap pengenceran digunakan tiga atau lima
seri tabung. Lebih banyak tabung yg digunakan
menunjukkan ketelitian yg lebih tinggi.