IDENTIFIKASI ACID ORANGE 7 (CI 15510),

MERAH K3 (CI 15585), JINGGA K1 (CI

12075), VIOLAMIN R (CI 45190), METHANIL
YELLOW (CI 13065), MERAH K10
(RHODAMIN B/CI 45170), FAT BROWN B
(CI 12010) DAN NAPHTHOL BLUE BLACK
(CI 20470) DALAM SEDIAAN SEMI SOLIDA
SECARA KROMATOGRAFI CAIR KINERJA
TINGGI – PHOTO DIODE ARRAY
29/KO/16

PPOMN
JAKARTA 23-27 APRIL 2017
 RUANG LINGKUP……...

• Metode ini digunakan untuk identifikasi

Acid Orange 7 (CI 15510), Merah K3 (CI
15585), Jingga K1 (CI 12075), Violamin R
(CI 45190), Methanil Yellow (CI 13065),
Merah K10 (Rhodamin B/CI 45170), Fat
Brown B (CI 12010) dan Naphthol Blue
Black (CI 20470) dalam sediaan semi
solida.
 PUSTAKA…….
• Anonim. 2015. Peraturan Kepala Badan Pengawas Obat dan
Makanan RI No. 18 Tahun 2015 Tentang Persyaratan Teknis Bahan
Kosmetika, Direktorat Standardisasi Obat Tradisional, Kosmetik dan
Produk Komplemen, Deputi Bidang Pengawasan Obat Tradisional,
Kosmetik dan Produk Komplemen, Badan Pengawas Obat dan
Makanan Republik Indonesia, Jakarta : Lampiran II, Halaman 1,2,3,
Lampiran V, Halaman 10.
• Dorieke van Balen. 2008. An HPLC-PDA Method Coupled to A 223-
Substances Database for Identification of Pharmaceutical Active
Substances in Dosage Forms.
 PRINSIP..…

• Acid Orange 7 (CI 15510), Merah K3 (CI 15585),

Jingga K1 (CI 12075), Violamin R (CI 45190),
Methanil Yellow (CI 13065), Merah K10
(Rhodamin B/CI 45170), Fat Brown B (CI 12010)
dan Naphthol Blue Black (CI 20470) dapat
diidentifikasi dalam matriks sampel secara
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)
berdasarkan perbedaan kelarutan dan polaritas.
 BAHAN DAN BAKU PEMBANDING

1. Bahan
2. Baku Pembanding
Acid Orange 7 (BPFI); Merah K3 (BPFI); Jingga
K1 (BPFI); Violamin R (BPFI); Methanil Yellow
(BPFI); Merah K10 (Rhodamin B/CI 45170)
(BPFI); Fat Brown B (BPFI) dan Naphthol Blue
Black (BPFI).
 PEREAKSI
• Asam Orto-Fofsfat 85%; metanol derajat KCKT; asetonitril derajat
KCKT; air bebas mineral; N,N Dimetilformamid (DMF).
• Dapar Fosfat pH 3,74:
Pipet 3320 µL Asam Orto-Fosfat 85%, encerkan dengan air bebas
mineral hingga 1000 mL, atur pH hingga 3,74 dengan penambahan
larutan Kalium Hidroksida 10%.
• Pelarut I:
Asam Orto-Fosfat 85% - DMF (5 : 95)
• Pelarut II:
Asetonitril - Metanol (50 : 50)
 PERALATAN…..

• Seperangkat alat Kromatografi Cair

Kinerja Tinggi (KCKT) dengan Detektor
Photo Diode Array (PDA); kolom
Oktadesilsilana/C18 (250 x 4,6 mm,
ukuran partikel 5 µm) (contoh : Waters-
Xbridge TM); sonikator; penyaring
membran; penyaring vakum; peralatan
gelas yang bertutup rapat; pipet mikro;
tabung sentrifuga 15 mL.
PROSEDUR
1. Larutan Uji
No
1
Nama Baku Pewarna
Acid Orange 7
Bobot Zat (mg)
3,750
PROSEDUR
2
3
Merah K3
Jingga K1
9,375
18,750 2. Larutan Baku
4 Violamin R 9,375
5 Methanil Yellow 3,750
6 Rhodamin B 1,000
7 Fat Brown B 9,375
8 Naphthol Blue Black 4,700
 PROSEDUR
2. Larutan Spiked….
 Cara penetapan

Larutan A, B dan C masing masing disuntikkan secara berurutan dan

dilakukan penetapan KCKT dengan kondisi analisis sebagai berikut :
Kolom : Kolom Oktadesilsilana (C18) (250 x 4,6 mm,
ukuran partikel 5 µm), contoh Waters- Komposisi Fase Gerak
Xbridge TM (%)
Menit
Fase gerak : Asetonitril (C) - Dapar Fosfat pH 3,74 (D), C D
dengan elusi gradien sebagai berikut : 0,00 40 60
Detektor : PDA 483 nm (Acid Orange 7, Merah K3, 3,00 40 60
Jingga K1)
4,01 55 45
PDA 531 nm (Violamin R)
29,00 55 45
PDA 418 nm (Methanil Yellow)
PDA 554 nm (Merah K10 (Rhodamin B)) 29,01 40 60
PDA 404 nm (Fat Brown B)
PDA 618 nm (Naphthol Blue Black) 35,00 40 60
Laju alir : 1,0 mL/menit 35,01 STOP
Volume : 20 µL
penyuntikan
Suhu kolom : 40C
 Interpretasi Hasil:

•Hasil uji dinyatakan positif jika waktu retensi,

spektrum dan panjang gelombang maksimum Larutan
Uji sama dengan Larutan Baku dan Larutan Spiked
Sample.
•Catatan :
Apabila sampel mengandung pewarna Merah K3 (CI
15585), maka dilanjutkan uji konfirmasi Merah K3 (CI
15585) secara Kromatografi Cair Tandem
Spektroskopi Masa.
 Data Penimbangan

Data Penimbangan Baku

Baku Pewarna W+Z Wadah zat RT
Acid Orange 20.812 17.062 3.750 4.106
Jingga k 1 35.725 16.853 18.872 20.825
Naphtol Blue black 18.900 14.077 4.823 3.252
Merah K 3 22.401 12.784 9.617 9.119
Violamin R 21.256 11.400 9.856 7.203
Fat Brown 19.706 9.954 9.752 22.464
Methanyl Yellow 14.863 10.867 3.996 5.923
Rhodamin B 14.332 9.187 5.145 10.914
Data Penimbangan Sampel
Data Penimbangan Sampel
Sampel W+Z Wadah Zat
1A 20.6431 20.1191 0.5240
1B 20.5032 20.0879 0.4153
1 Spike 20.5353 20.0849 0.4504
2A 20.5134 20.1149 0.3985
2B 20.4726 19.9759 0.4967
2 Spike 20.6246 20.1190 0.5056
3A 20.3136 19.8026 0.5110
3B 20.4688 19.9648 0.5040
spike 20.4362 19.9303 0.5059
4A 20.4937 19.9857 0.5080
4B 20.4824 19.9742 0.5082
spike 20.3921 19.8911 0.5010
5A 20.4698 19.9645 0.5053
5B 20.4396 19.9227 0.5169
5 Spiked 20.4589 19.9562 0.5027
6A 20.4557 19.9536 0.5021
6B 20.3486 19.8315 0.5171
6 Spiked 20.4373 19.9390 0.4983
 Uks…
UKS area 1 2 3 4 5 6 Rata-Rata SD RSD
Acid Orange 3932123 3935586 3934314 3944580 3949134 3943747 3939914 6815.616 0.172989
Jingga k 1 15034653 15070796 15040028 15152932 15103980 14988588 15065162.8 57737.76 0.383253
Naphtol Blue black 5174425 5168463 5172030 5191851 5209924 5199593 5186047.67 16899.92 0.325873
Merah K 3 8091897 8089671 8088612 8094687 8087198 8035935 8081333.33 22395.58 0.277127
Violamin R 9564379 9548758 9543966 9557339 9551779 9558804 9554170.83 7414.424 0.077604
Fat Brown 9642833 9748188 9715174 9708526 9718482 9729592 9710465.83 35925.37 0.369965
Methanyl Yellow 5874027 5883841 5872118 5886829 5868438 5893880 5879855.5 9852.92 0.167571
Rhodamin B 2600313 2633388 2634262 2638877 2636380 2658718 2633656.33 18841.32 0.715406
UKS RT 1 2 3 4 5 6 Rata-Rata SD RSD
Acid Orange 4.144 4.144 4.148 4.141 4.144 4.129 4.14166667 0.006593 0.159185
Jingga k 1 21.766 21.762 21.737 21.685 21.678 21.645 21.7121667 0.049829 0.2295
Naphtol Blue black 3.161 3.17 3.161 3.161 3.156 3.153 3.16033333 0.005785 0.183052
Merah K 3 9.261 9.256 9.262 9.254 9.251 9.215 9.24983333 0.017566 0.189907
Violamin R 7.349 7.336 7.344 7.314 7.35 7.286 7.32983333 0.025238 0.344322
Fat Brown 23.276 23.27 23.231 23.168 23.169 23.125 23.2065 0.061634 0.265588
Methanyl Yellow 6.004 5.999 6.004 5.985 6.019 5.962 5.9955 0.019705 0.328669
Rhodamin B 11.142 11.14 11.141 11.134 11.121 11.101 11.1298333 0.016142 0.145034
 Hasil Pengujian
• 1. Kromatogram Pelarut
2. Kromatogram Matrix Sampel
Kromatogram baku jingga K1
Kromatogram Baku Merah K3
Kromatogram Acid Orange
Kromatogram Violamin R
Kromatogram Methanyl Yellow
Kromatogram Rhodamin B
Kromatogram Naphtol Blue Black
Kromatogram Fat Brown
Kromatogram Larutan Baku Pewarna Simultan
Dengan Panjang Gelombang Maksimum 483 nm
Kromatogram Larutan Baku Pewarna
Simultan Dengan Panjang Gelombang
Maksimum 531 nm
Kromatogram Larutan Baku Pewarna
Simultan Dengan Panjang Gelombang
Maksimum 418 nm
 Kromatogram Larutan Baku Pewarna Simultan
Dengan Panjang Gelombang Maksimum 554 nm
 Kromatogram Larutan Baku Pewarna Simultan
Dengan Panjang Gelombang Maksimum 404 nm
Kromatogram Larutan Baku Pewarna Simultan Dengan
Panjang Gelombang Maksimum 618 nm
Kromatogram Larutan Sampel 1 dan spiked
Kromatogram Larutan Sampel 2 dan Spiked
Kromatogram Larutan Sampel 3 dan spiked
Kromatogram Larutan Sampel 4 dan spiked
Kromatogram Larutan Sampel 5 dan spiked
Kromatogram Larutan Sampel 6 dan spiked
 Kesimpulan
• Dari hasil penginjekan 8 baku pewarna
simultan diperoleh puncak larutan baku
yang satu terpisah baik dengan puncak
larutan baku lain (resolusi ≥ 1,5)
• Dari hasil penginjekan sampel diperoleh:
 Kesimpulan…
• Sampel no 1,2,3,5, dan 6 negatif
pewarna.
 Kesimpulan…
• Sampel no 4 POSITIF mengandung
Rhodamin B, karena ada puncak larutan
matriks sampel yang memiliki waktu retensi,
pola spektrum, panjang gelombang
maksimum dan peak puryti yang sama
dengan larutan baku Rhodamin B,
larutan spiked memberikan puncak dengan
waktu retensi yang sama
 Kendala..,
• Pengkondisian kolom
• Membedakan Pola Spektrum , Panjang
Gelombang larutana sampel dan baku
• Penimbangan Sampel