Aktivitas Antioksidan Susu Fermentasi Yang Diproduksi Oleh L

actobacillus casei ATCC 393 Selama Penyimpanan Dingin

UMI FAOZIYAH ANINDI

140210170005

UNIVERSITAS PADJADJARAN

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

DEPARTEMEN KIMIA

JATINANGOR

2020
 Latar Belakang
Pangan Fungsional
Mengandung sumber nutrisi esensial,
komponen bioaktif atau zat lain
yang dapat meningkatkan gizi dan
mencegah berbagai penyakit
(Contreras-Rodriguez et al., 2020).
Yogurt
Lactobacillus sp

Aktivitas Bakteri Asam Laktat

selama fermentasi
(Chen et al., 2017) :
1. Glikolisis
2. Proteolisis
(Corrieu & Béal, 2016)
3. Lipolisis
Susu Yogurt

(Agustinah et al., 2019)

Peptida Yogurt
Aktivitas Antioksidan Yogurt
Peptida dienkripsi dalam protein
susu dan dilepaskan selama STRES OKSIDATIF PANGAN ANTIOKSIDAN
proses fermentasi karena
adanya aktivitas proteolitik Aktifitas antioksidan peptida yogurt dipengaruhi oleh :
bakteri asam laktat (Möller et al.,
2008)
Komposisi
Komposisi Strukturf Hidrofobisitasf
Hidrofobisitasf

Aktivitas Peptida Yogurt

- Antioksidan
- Antibakteri
- Antiinflamasi
- Antimutagenik
- Antihipertensi
Tryptophan Tyrosine Histidine
- Antidiabetes

(Rutella et al., 2016; Abdel-Hamid et al., 2019; Aguilar- (Mann et al., 2017)
Toalá et al., 2017; Mann et al., 2017).

Lactobacillus casei ATCC 393
Strain probiotik yang dikenal
aktivitasnya dalam
meningkatkan kesehatan
(Abdel-Hamid et al., 2019).
Peptida bioaktif dengan aktivitas
antioksidan dan antikanker dari
starter yogurt + Lb. casei ATCC
Tujuan Penelitian
393 (Sah et al., 2014)
Untuk menilai secara in vitro, aktivitas
antioksidan, penghambatan ACE dan
antiproliferasi dari fraksi peptida yang
diperoleh dari susu yang dikultur dengan
Lb. casei ATCC 393, selama 21 hari
Lb. casei ATCC 393 memiliki
penyimpanan pada suhu 4°C.
aktivitas proteolitik yang tinggi
(Vukotić et al., 2014) (Abdel-Hamid et al., 2019).
 Alat dan Bahan
Alat
Bahan

1. Kalium persulfat
2. o-phthalaldehyde (OPA)
Spektrofotometer uv-vis Waterbath Alat Sentrifugasi
3. 2,20-azino-bis
(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid) (ABTS)
4. MRS agar
5. NaOH
Syringe filter 0,45 μm Pierce C18 spin column Microplate reader 6. Fenolftalein

Vivaspin 15R filter MS/MS

 Metode

Pembiakan Fermentasi Analisis Total

Kultur Susu Asam dan pH

Preparasi
Penentuan
water-soluble Penentuan
Aktivitas
peptide extract Viabilitas Sel
Proteolitik
(WSPE)

Identifikasi
Uji Aktivitas Analisis
Sekuens Asam
Antioksidan Statistika
Amino Peptida
 Prosedur
Pembiakan Kultur
Lactobacillus casei ATCC 393
- Ditumbuhkan ke dalam MRS agar
- Diinkubasi selama 72 jam pada suhu 37°C
- Diinokulasi ke dalam 10 mL MRS broth
- Diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37°C
- Disentrifugasi dengan kecepatan 5000 x g selama 10
menit suhu 4°C
- Diresuspensi dengan 0.85% NaCl
Kultur
  Starter
Fermentasi Susu
Susu sapi
- Dipanaskan 15 menit pada suhu 90°C di waterbath
- Didinginkan hingga suhu 40°C
- Diinokulasi dengan 2% Lb. Casei ATCC 393
- Diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37°C
- Disimpan pada suhu 4°C selama 3 minggu
- Diambil sampel pada hari ke-1, 7,14, 21 hari
Yogurt
 Prosedur
Analisis Total Asam dan pH Penentuan Aktivitas Proteolitik

Yogurt 2,5 mL Yogurt

- Dititrasi dengan 0,1 M NaOH & fenolftalein sebagai - Dicampurkan dengan 5 mL trichloroacetic acid (TCA) 0,75 % w/v
indikator - Disentrifugasi pada suhu 4°C selama 15 menit pada
- Diukur pH dengan pH meter kecepatan 3.000 x g
% Asam Laktat Supernatan
   
- Difiltrasi dengan 0,45 μm syringe filter
Penentuan Viabilitas Sel
Filtrat
Plates Kultur  
- Dicampurkan 50 μm L dengan 1 mL reagen OPA
- Diinkubasi selama 72 jam pada suhu 37°C
- Diinkubasi selama 2 menit pada suhu ruang
- Dihitung jumlah viabilitas sel per mL sebagai log CFU/mL
- Diukur dengan spektrofotometer uv-vis λ=340 nm
% Asam Laktat
Aktifitas Proteolitik
 
 
 Prosedur
Preparasi water-soluble peptide extract (WSPE) Uji Aktivitas Antioksidan

Yogurt 19,4 mM ABTS

- Disentrifugasi selama 30 menit pada kecepatan 20.000 x g - Ditambahkan ke dalam 6,7 mM kalium persulfat
- Disaring dengan 0,45 μm syringe filter - Disimpan di tempat gelap pada suhu ruang selama 16 jam

WSPE Larutan Stok ABTS•+

   
- Disaring dengan vivaspin 15R filter dengan 2 KDa cut-off 50 μL WSPE/F1
Filtrat/F1 (peptida < 2 Kda)
- Dicampurkan ke dalam 200 μL ABTS•+
 
Penentuan Kadar Protein - Diinkubasi pada suhu ruang selama 30 menit di ruang gelap
- Diukur menggunakan microplate reader pada λ=405 nm
WSPE & F1
- Dihitung persamaan % radical scavenging
- Disimpan pada suhu -20 °C untuk analisis berikutnya - Dibuat kurva regresi linear % radical scavenging versus
- Ditentukan kadar protein dengan Bio-Rad protein assay kit konsentrasi sampel
Kadar Protein
Nilai SC50
 Prosedur
Identifikasi Sekuens Asam Amino Peptida Analisis Statistika

Analisis menggunakan ANOVA dengan bantuan

Peptida Fraksi F1
software Minitab® 18.1 (MINITAB
- Dimurnikan dan dipekatkatkan dengan pierce C18 spin column
- Dianalisis dengan tandem mass spectrometry (MS/MS)

Sekuens Asam Amino

 
 Hasil
Hasil Sifat Fisikokimia

Kenaikan % TA (0,7->0,9%) sedangkan

nilai pH berkurang (4,69->4,05) selama
28 hari pada Lb. Casei ATCC 393
(Dimitrellou et al., 2016).

Yogurt dengan kultur Lb. Casei ATCC

393 memiliki aktivitas proteolitik lebih
tinggi dibandingkan yogurt tanpa Lb.
Casei ATCC 393 (Sah et al., 2014).
(Abdel-Hamid et al., 2019)

• Nilai pH menurun secara signifikan selama rentang waktu penyimpanan

• Nilai % TA meningkat secara signifikan selama rentang waktu penyimpanan
• Aktivitas proteolisis meningkat secara signifikan selama rentang waktu penyimpanan
 Hasil
Hasil Viabilitas Sel

Jumlah bakteri probiotik hidup minimal 6

> 9 log cfu/g
log cfu/g untuk mendapatkan efek
probiotik ( Tripathi & Giri, 2014).

Penurunan viabilitas sel Lb. Casei ATCC

393 selama 60 hari penyimpanan
(Sah et al., 2015).

(Abdel-Hamid et al., 2019)

Waktu penyimpanan tidak menunjukkan pengaruh yang signifikan (P> 0,05)

pada viabilitas sel
 Hasil
Hasil Uji Aktivitas Antioksidan

Ukuran peptida yang lebih kecil

akan menghasilkan aktivitas
antioksidan
yang lebih tinggi

(Abdel-Hamid et al., 2019)

• Nilai SC50 pada WSE dan F1 meningkat secara signifikan selama rentang waktu penyimpanan.
• Pada F1 menunjukkan aktivitas antioksidan lebih tinggi dibandingkan WSE selama rentang waktu penyimpanan.
 Hasil
Hasil Identifikasi Sekuens Peptida menggunakan MS/MS

(Abdel-Hamid et al., 2019)

 Kesimpulan

Lb. casei ATCC 393 terbukti mampu melepaskan berbagai peptida

bioaktif dari protein susu. Lb. casei ATCC 393 tumbuh dengan
baik dalam susu pada kondisi asam dengan viabilitas sel di atas
jumlah minimum yang disyaratkan bahkan setelah 21 hari
penyimpanan dingin. Dibandingkan dengan strain Lb casei
lainnya, Lb. casei ATCC 393 berpotensi menghasilkan peptida
bioaktif pada aktivitas antioksidan.
 Daftar Pustaka
Abdel-Hamid, M., Romeih, E., Gamba, R.R., Nagai, E., Suzuki, T., Koyanagi, T., & Enomoto, T. (2019) The biological activity of fermented milk
produced by Lactobacillus casei ATCC 393 during cold storage. International Dairy Journal. 91, 1–8.
Aguilar-Toalá, J.E., Santiago-López, L., Peres, C.M., Peres, C., Garcia, H.S., Vallejo-Cordoba, B., González-Córdova, A.F., & Hernández-
Mendoza, A. (2017) Assessment of multifunctional activity of bioactive peptides derived from fermented milk by specific Lactobacillus
plantarum strains. Journal of Dairy Science. 100(1), 65–75.
Agustinah, W., Warjoto, R.E., & Canti, M. (2019) Yogurt Making as a Tool To Understand the Food Fermentation Process for Nonscience
Participants. International Education. 20(1).
Chen, C., Zhao, S., Hao, G., Yu, H., Tian, H., & Zhao, G. (2017) Role of lactic acid bacteria on the yogurt flavour: A review. International Journal
of Food Properties. 20(1), S316–S330.
Contreras-Rodriguez, O., Mata, F., Verdejo-Román, J., Ramírez-Bernabé, R., Moreno, D., Vilar-Lopez, R., Soriano-Mas, C., & Verdejo-García,
A. (2020) Neural-based valuation of functional foods among lean and obese individuals. Nutrition Research. 78, 27–35.
Corrieu, G. & Béal, C. (2016) Yogurt: The Product and its Manufacture. Encyclopedia of Food and Health. (December 2016), 617–624.
Dimitrellou, D., Kandylis, P., Petrovi?c, T., Dimitrijevi?c-Brankovi?c, S., Levi?c, S., Nedovi?c, V., et al. (2016). Survival of spray dried
microencapsulated Lactoba- cillus casei ATCC 393 in simulated gastrointestinal conditions and fermented milk. Lebensmittel Wissenschaft
und Technologie Food Science and Technology. 71, 169-174.
Mann, B., Athira, S., Sharma, R., & Bajaj, R. (2017) Bioactive peptides in yogurt. Elsevier Inc..
Möller, N.P., Scholz-Ahrens, K.E., Roos, N., & Schrezenmeir, J. (2008) Bioactive peptides and proteins from foods: Indication for health effects.
European Journal of Nutrition. 47(4), 171–182.
Rutella, G.S., Tagliazucchi, D., & Solieri, L. (2016) Survival and bioactivities of selected probiotic lactobacilli in yogurt fermentation and cold
storage: New insights for developing a bi-functional dairy food. Food Microbiology. 60, 54–61.
Sah, B.N.P., Vasiljevic, T., McKechnie, S., & Donkor, O.N. (2014) Effect of probiotics on antioxidant and antimutagenic activities of crude peptide
extract from yogurt. Food Chemistry. 156, 264–270
Sah, B. N. P., Vasiljevic, T., McKechnie, S., & Donkor, O. N. (2015). Effect of refriger- ated storage on probiotic viability and the production and
stability of anti- mutagenic and antioxidant peptides in yogurt supplemented with pineapple peel. Journal of Dairy Science. 98, 5905-5916.
Tripathi, M. K., & Giri, S. K. (2014). Probiotic functional foods: Survival of probiotics during processing and storage. Journal of Functional Foods,
9, 225e241.
Vukotic, G., Strahinic, I., Begovic, J., Lukic, J., Kojic, M., & Fira, D. (2016). Survey on proteolytic activity and diversity of proteinase genes in
mesophilic lactobacilli. Microbiology, 85,33e41Contreras-Rodriguez, O., Mata, F., Verdejo-Román, J., Ramírez-Bernabé, R., Moreno, D.,
Vilar-Lopez, R., Soriano-Mas, C., & Verdejo-García, A. (2020) Neural-based valuation of functional foods among lean and obese
individuals. Nutrition Research. 78, 27–35.
TERIMA KASIH
 Peptida DLEE yang mengandung
tiga residu asam amino asam
dan satu residu asam amino
hidrofobik dan memiliki
kemampuan pembersihan DPPH
yang tinggi (Xing et al., 2016)
Peptida GYP menunjukkan
aktivitas pembersihan radikal
hidroksil yang sangat tinggi
(97,6%) (Ohata et al., 2016)

(Liu et al., 2016)

 Mekanisme RSA Pada Peptida
Fig. 1. Radical scavenging mechanisms of peptides. HAT:
hydrogen atom transfer, SET: single electron transfer,
SAPL: solvent-assisted proton loss. Proposed scheme for
tyrosine (a), cysteine (b) and histidine (c) containing
peptides.

(Esfandi et al., 2019)

 Mekanisme ABTS

(Olivera et al., 2014)

Pierce® C18 Spin Columns
 MS/MS

ESI (electro-
spray ionization