Teknologi DNA

Rekombinan
 ENZIM RESTRIKSI

 Fungsi: melindungi bakteri dari DNA asing (seperti virus).

 DNA organisme penghasil enzim mengalami metilasi sehingga tidak
dapat dipotong

 Enzim restriksi tipe I: memotong DNA pada jarak 1000 bp atau lebih
dari sisi pengenalan

 Enzim restriksi tipe II: memotong pada bagian tengah sisi pengenalan.
 Memotong DNA untai ganda pada titik yang sama menghasilkan ujung
tumpul (blunt end)
 Jumlah bp menentukan kemungkinan untuk
menemukan sisi pemotongan.

 Untuk menghasilkan fragmen DNA yang lebih

panjang digunakan enzim restriksi dengan sisi
pengenalan enam atau lebih bp
 DNA Ligase

 DNA ligase dari T4 bacteriophage.

 Mengkatalisis pembentukan ikatan antara 3’-OH
dari satu untai dan 5’-PO4 dari untai DNA lain

 Ligase bekerja lebih efisien pada ujung lancip

dibanding dengan ujung tumpul.
Restriction Fragment
Length
Polymorphism (RFLP)
 Deteksi Asam Nukleat

 Ultraviolet
 DNA menyerap sinar UV karena struktur cincin
pada basa

 RNA dan juga nukleotida menyerap sinar UV

 Konsentrasi DNA ditentukan pada panjang
gelombang 260 nm
 Penandaan DNA dengan
Radioaktif
 Sinar UV dapat mendeteksi DNA, tetapi tidak dapat
membedakan molekul DNA yang berbeda.

 Prekursor nukleotida radioaktif 32P atau 35S

ditambahkan dalam medium pertumbuhan.

 Autoradiografi digunakan untuk mendeteksi DNA

bertanda.

 Peluruhan radioaktif menghasilkan radiasi yang

dapat menyebabkan film fotografi menjadi hitam
• DNA radioaktif dapat dideteksi dengan scintillation
counting.

• Peluruhan isotop radioaktif menghasilkan partikel

beta.

• Cairan scintillation akan mengalami eksitasi dan

kemudian mengemisikan sinar

• Scintilation counter akan mendeteksi sinar yang

diemisikan .
 Deteksi DNA dengan
Fluoresens

• Fluoresecence tags menyerap cahaya pada satu

panjang gelombang .

• Atom mengalami eksitasi yang selanjutnya akan

memancarkan cahaya dengan panjang gelombang
berbeda ketika kembali ke keadaan dasar.

• Foton yang diemisikan akan dideteksi oleh detektor

 Biotin dan Digoxigenin

• Biotin adalah vitamin

• Digoxigenin adalah hormon steroid dari tumbuhan
foxglove.

• Biotin atau digoxigenin berikatan dengan urasil

• DNA hasil sintesis mengandung dUTP-
biotin/digoxigenin, menggantikan dTTP
DNA bertanda dengan senyawa yang dapat
berfluoresens
Visualisasi DNA bertanda:
 DNA: Melting dan Reannealing

• DNA dapat mengalami ‘melting’ dan bergabung kembali ‘reanneal’

• Pemanasan dapat merusak ikatan hidrogen.
• Pada pendinginan perlahan dapat terbentuk ikatan hidrogen antar
kedua untai DNA yang saling komplemen.
Southern Blot
(Ed Southern)
• SB digunakan untuk menentuk kedekatan DNA dari satu sumber
dengan DNA dari sumber lain.
• Isolasi DNA target
• Pemotongan dengan enzim restriksi
• Pemisahan fragmen DNA dengan elektroforesis
• Pemisahan DNA untai ganda dengan cara menginkubasi gel dengan
asam kuat.
• Transfer DNA untai tunggal ke membran
• Pembuatan probe/pelacak
• Denaturasi DNA pelacak.
• Hibridisasi DNA target dengan DNA pelacak
• High stringency: Temperatur tinggi dan konsentrasi garam
rendah. DNA templat dan pelacak berhibridisasi sempurna

• Low stringency: temperatur rendah dan kadar garam tinggi.

DNA templat dan pelacak mempunyai mismatches.
 Nothern Blot

• Target molekul: RNA

• Variasi teknik hibridisasi: dot blot
Zoo Blot: Kemiripan urutan nukleotida antara
beberapa spesies yang berbeda
Fluorescene In Situ Hybridization

• Hibridisasi pelacak dengan DNA/RNA di dalam

sel.

• Sumber DNA: sayatan jaringan, kultur mamalia,

kultur serangga, darah (sel darah putih).

• Pemanasan sampel DNA

• Hibridisasi dengan pelacak bertanda (fluoresens)
Analisis FISH gen RUNX1 yang mengalami peningkatan
jumlah kopi pada penderita leukemia akut karena
polisomi pada kromosom 21.

RUNX1: Merah; TEL: Hijau

 Vektor Kloning

• Herbert W Boyer: enzim restriksi dan pemodifikasi

• Stanley N. Cohen: Plasmid resistan antibiotik dan
teknik transformasi dengan CaCl2.
 Vektor Kloning

•• Ukuran
Ukuran kecil,
kecil, mudah
mudah dimanipulasi
dimanipulasi
•• Dapat
Dapat ditransfer
ditransfer dari
dari sel
sel ke
ke sel
sel
•• Mudah
Mudah diisolasi
diisolasi
•• Mudah
Mudah dideteksi
dideteksi dan
dan diseleks
diseleks
•• Plasmi
Plasmi multi
multi kopi
kopi (membantu
(membantu utk utk mendapatkan
mendapatkan DNA
DNA dalam
dalam jumlah
jumlah besar)
besar)
•• Mempunyai
Mempunyai beberapa
beberapa sisi
sisi pengenalan
pengenalan enzim
enzim restriksi
restriksi
•• Ada
Ada metode
metode untuk
untuk mendeteksi
mendeteksi keberadaan
keberadaan DNA
DNA insert
insert
Vektor Kloning Umum