Thin Layer Chromatography-Bioautography and

Gas Chromatography-Mass Spectrometry of

Antimicrobial Leaf
Extracts from Philippine Piper betle L. against
Multidrug-Resistant Bacteria

Dibuat Oleh :

Lailatul Nasrotin ( K100180180 )

Luthfia Firdaus Maharani ( K100180181 )
Renika Valentina Widiyani ( K100180182 )
Harun Arrosyid ( K100180183 )
Nabila Ika Fitriyani ( K100180189 )
Septantiana Nur Laili A. ( K100180190 )
Nuring Novita Kusumawati ( K100180191 )
 Thin Layer Chromatography-Bioautography and Gas
Chromatography-Mass Spectrometry of Antimicrobial Leaf
Extracts from Philippine Piper betle L. against Multidrug-
Resistant Bacteria
Pendahuluan
Piper betle L. merupakan bagian dari famili Piperaceae adalah tanaman rambat yang digunakan dalam
pengobatan alternatif yang meliputi antibakteri, antijamur, antioksidan, sitotoksik, antihelminthic,
antiprotozoal, antidi- abetic, hepatoprotektif, dan sifat imunomodulator. Telah dilaporkan memiliki aktivitas
antimikroba spektrum yang luas terhadap berbagai strain bakteri dan jamur.
Metode pengujian yang digunakan dalam penelitian ini termasuk metode difusi disk standar dan
metode kaldu mikrodilusi untuk penentuan konsentrasi minimum penghambatan (MIC) dan konsentrasi
bakterisida minimum (MBC) dari ekstrak untuk mikroorganisme uji.
Studi ini membahas aktivitas bakterisida pada ekstrak kasar daun sirih memiliki KBM (Kadar Bunuh
Minimum) dari 19μ g/mL sampai 1250μ g/mL. Ekstrak tersebut terbukti lebih ampuh melawan Gram-
positif methicillin-resistant Staphylococcus aureus ( MRSA) dan vancomycin-resistant Enterococcus ( VRE)
dibandingkan bakteri uji Gram-negatif.
Untuk menentukan produk alami yang aktif secara biologis dalam ekstrak tumbuhan, pilihan metode
bioassay sangat penting. Tes bioassay harus sensitif, andal, sederhana, dan cepat. Jenis metode ekstraksi,
lama ekstraksi, suhu, dan polaritas pelarut yang digunakan mempengaruhi kualitas dan konsentrasi
komponen bioaktif yang diisolasi dari bahan baku. Fraksinasi yang dipandu aktivitas sangat penting, karena
semua fraksi harus diperiksa dan dipantau secara seksama, untuk mendeteksi atau mengidentifikasi
senyawa yang sangat aktif untuk isolasi dan pemurnian lebih lanjut sampai diperoleh zat tunggal yang aktif.
Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi dan mengisolasi
senyawa antibakteri ekstrak P. betle menggunakan KLT, agar-overlay,
dan kontak (tidak langsung) tes P. betle ekstrak menggunakan TLC, agar-
overlay, dan kontak (tidak langsung) tes bioautographic dan untuk
mengidentifikasi senyawa semivolatile dan volatile menggunakan GC-
MS.
• Alat • Bahan
1. kertas Whatman filter nomor 1 1. Bubuk dedaunan dari P. Betle yang telah dikeringkan dan
disterilkan
2. rotary evaporator
2. Ethanol
3. VitekMS (bioM´erieux, Marcy l’Etoile, France) GP colorimetric
identification card 3. strain bakteri gram positif : metisilin
Staphylococcus aureus (MRSA) dan vankomisin
4. pelat gel silika (fase diam) Enterococcus (VRE); Bakteri MDR gram negatif, yaitu,
5. Agar Mueller-Hinton Enterobacteriaceae- (CRE-). Klebsiella
pneumoniae dan metallo-𝛽-lactamase- (M𝛽L-)
6. GC-MS Acinetobacter baumannii.
7. Jarum syringe 4. etil asetat dan n-heksana (7: 3 v / v)
5. Chamber kaca
6. asam vanilin-sulfat
• 2.1. Pengumpulan dan Persiapan
Bahan Tumbuhan. Dedaunan
dari P. betle dikumpulkan di kaki
Gunung SierraMadre di
Kotamadya Jenderal Nakar,
Quezon, Filipina. Daunnya dicuci
bersih dan kemudian dikeringkan
pada suhu kamar selama tujuh
hari, bubuk halus,dan disimpan
dalam wadah kedap udara steril
sampai digunakan lebih lanjut.
• 2.2. Persiapan Ekstrak Daun Etanol.
• Bubuk kering daun P. betle diekstraksi sesuai
dengam metode Basri dan Kipas [11] dengan
modifikasi kecil.Secara singkat, 150 g bahan
tanaman bubuk direndam 500 mL etanol
selama tujuh hari dengan aduk dan sesekali
kemudian disaring menggunakan kertas
Whatman filter nomor 1 (Whatman Ltd.,
Inggris). Filtrat dipekatkan di bawah tekanan
yang tereduksi menggunakan rotary
evaporator pada 50∘C. Etanol ekstrak mentah
dikumpulkan dan dibiarkan kering pada suhu
kamar. Larutan stok disiapkan dengan
melarutkan kering ekstrak dalam DMSO pada
konsentrasi 1 × 105 𝜇g / mL.
2.3. Strain Bakteri Multidrug-Resistant
(MDR).
• MDR strain bakteri yang digunakan dalam penelitian
ini adalah sebagai berikut:Bakteri MDR Gram-positif,
yaitu, resisten metisilin Staphylococcus aureus
(MRSA) dan tahan vankomisin Enterococcus (VRE);
Bakteri MDR gram negatif, yaitu,
Enterobacteriaceae- (CRE-) yang resisten terhadap
carbapenem. Klebsiella pneumoniae dan metallo-𝛽-
lactamase- (M𝛽L-) Acinetobacter baumannii. Strain
bakteri MDR ini diisolasi dari pasien anonim yang
dirawat di Makati Medical Pusat dan Ospital
ngMakati. Semua isolat diidentifikasi oleh tes
biokimia otomatis menggunakan Vitek MS (bioM
´erieux, Marcy l'Etoile, Prancis) Identifikasi
kolorimetri GP card. Pola kerentanan diperoleh oleh
VitekMS AST (bioM´erieux, Marcy l'Etoile, Prancis)
mengikuti Standar interpretasi MIC dari Standar
Laboratorium Klinis Lembaga M100-S24 [12].
2.4. Kromatografi Lapis Tipis (KLT).
Sistem TLC (CAMAG) yang dilengkapi dengan aplikator sampel digunakan
untuk aplikasi sampel. Lima mikroliter etanol daun
ekstrak secara terpisah diterapkan pada 5 cm × 10 cm kromatografi pelat
gel silika yang diendapkan (Merck, TLC grade) sebagai fase diam. Pelat TLC
dikembangkan di sebuah chamber kaca yang berisi campuran etil asetat
dan n-heksana (7: 3 v / v) sebagai fase gerak. Plat-plat itu diangkat ketika
bagian depan pelarut telah pindah ke 15 cm dari posisi ekstrak asli dan
selanjutnya dibiarkan kering. Setelah pengeringan, bintik-bintik di piring
yang dikembangkan divisualisasikan di bawah terlihat (putih), UV pendek
(254 nm), dan UV panjang (366 nm) menyala. Sebagai postderivatization,
plat disemprot dengan asam vanilin-sulfat untuk reaksi warna dan
diizinkan kering. Visualizer dan pemindai digunakan untuk dokumentasi
foto pada UV 254 nm dan UV 366 nm dan di bawah cahaya tampak
sebelum dan sesudah aplikasi vanillinsulfuric semprotan asam. Pergerakan
setiap titik pemisah ekstrak diekspresikan oleh faktor retensi (𝑅𝑓). Nilai-
nilai dihitung untuk setiap tempat menggunakan rumus berikut:
Rf = Jarak yang ditempuh substansi
Jarak yang ditempuh oleh pelarut
2.5. TLC-Kontak (Tidak Langsung)
Teknik Bioautografi.
• Inokulum strain bakteri MDR yang representatif dengan 1,5 ×
108 CFU / mL konsentrasi, yaitu, MRSA, VRE, M𝛽L-A.
baumannii, dan CRE-K.
• pneumoniae, dioleskan ke
Pelat agar Mueller-Hinton untuk digunakan dalam
bioautografi kontak.
• Teknik yang diadopsi dari metode Wedge dan Nagle [13]
dengan sedikit modifikasi.
• Piring TLC kering dengan bintik-bintik yang sesuai ditempatkan
secara aseptik ke benih Pelat agar Mueller-Hinton dilapisi
dengan kertas lensa steril.
• Piring TLC ditempatkan menghadap ke bawah dengan
silicacoated sisi kontak secara merata dengan kertas lensa dan
diinkubasi selama 12 hingga 18 jam pada suhu 4 ± 2∘C.
• Lalu, TLC piring dihilangkan, dan agar agar diinokulasi lebih
lanjut diinkubasi pada 35 ± 2∘C selama 24 jam inkubator
udara inanambient.
• Zona penghambatan diamati dan dibandingkan dengan TLC
piring 𝑅𝑓 hasil nilai.
2.5. Teknik Bioautografi
TLC-Agar-Overlay
• Satu mililiter strain bakteri MDR yang representatif
dengan 1,5 × 108 CFU / mL konsentrasi digunakan
untuk setiap 10 mL Agar Mueller-Hinton.
• Piring TLC yang dikembangkan ditempatkan di
cawan Petri steril (150 mm).
• Kultur ditambahkan ke agar Mueller-Hinton meleleh
dan lapisan tipis dituangkan di atas pelat TLC.
• Setelah pemadatan medium, Piring TLC diinkubasi
selama 24 jam pada 35 ± 2∘C. Itu Pelat TLC-
bioautografi disemprotkan dengan larutan air(2.5mg
/ mL) dari methylthiazol tetrazolium (Sigma,
AMERIKA SERIKAT).
• Zona penghambatan yang jelas diamati terhadap
warna ungu latar belakang [14].
• Identifikasi senyawa spesifik adalah dibatasi oleh
tidak tersedianya standar referensi yang disiapkan.
 2.7. Kromatografi Gas-Spektrometri Massa (GC-
MS)
• Analisis GC-MS ekstrak etanol daun dilakukan menggunakan Perkin Elmer GC-MS (Perkin Elmer
Clarus 680 GC-Clarus SQ 8T MS) dilengkapi dengan Elite-5 MS 30m× 0,25mm × 25 columnm
kolom kapiler (5% difenil, 95% dimethylpolysiloxane).
• GC-MS, adalah sebuah elektron yang menggunakan sistem ionisasi dengan energi ionisasi 70
eV.
• Gas helium ultrapure digunakan sebagai gas pembawa pada konstanta laju aliran 1 mL / menit.
Sumber ion, jalur transfer massa, dan suhu injektor ditetapkan pada 230∘C, 250∘C, dan 290∘C,
masing-masing. Suhu oven diprogram dari 50 hingga 150 ° C pada kecepatan 3 ° C / menit dan
kemudian ditahan dalam isotermal kondisi selama 10 menit dan akhirnya dinaikkan menjadi
250∘C pada 10∘C / mnt.
• Sampel yang diencerkan (1/100, v / v dalam etanol) dari 1 𝜇L secara manual disuntikkan dalam
mode split 120. Pemindaian spektral massa dimulai pada 45-450 m / z, dengan penundaan
pelarut 2 menit ekstrak diidentifikasi berdasarkan perbandingan waktu retensi relatif GC dan
spektrum massa dengan mereka dari NIST MS Search Library Software versi 2.0
HASIL DAN PEMBAHASAN
Thin Layer Chromatography (TLC). Untuk
isolat dan iDEN- tifikasi
• senyawa bioaktif dari P. betle ekstrak daun, TLC awalnya dilakukan
sebagai metode kualitatif untuk mendokumentasikan konstituen
ekstrak.
• Metode ini telah beenwidely digunakan untuk memisahkan metabolit
sekunder seperti polifenol, flavonoid, saponin, alkaloid, dan steroid,
termasuk asam amino, protein, peptida, hormon, dan pestisida [15].
• Meskipun TLC tidak menyediakan pengukuran tertentu, sangat efektif
bila digunakan dalam kombinasi dengan teknik lain.
• Dalam penelitian kami, TLC dari P. betle ekstrak etanol daun
mengungkapkan maksimal 9 senyawa dalam rangka penurunan
TLC-bioautografi. Dalam agar-overlay dan
kontak (tidak langsung)
• bioautografi, aktivitas antibakteri senyawa dipisahkan pada TLC ditentukan.
• Bakteri MDR perwakilan digunakan untuk bioautografi.
• antibakteri yang signifikan terhadap MRSA ditunjukkan oleh senyawa dengan nilai 0,86 dan
0,13 pada bioautografi agar-overlay, terbukti dari zona bening yang signifikan inhibisi pada
latar belakang ungu (Gambar 2).
• Dalam kontak metode (langsung), hanya senyawa dengan • • 0.86 adalah ble visi-,
ditampilkan sebagai zona bening besar penghambatan pada tanah kembali-ungu disemprot
dengan methylthiazol tetrazolium (Gambar 3).
• Senyawa yang sama juga ditunjukkan untuk menjadi aktif terhadap VRE, seperti yang
terlihat pada hasil bioautografi agar-overlay pada Gambar 2.
• Untuk aktivitas antimikroba Gram-negatif, hanya compoundwith yang • • nilai 0,86
menunjukkan aktivitas yang signifikan terhadap M β L- A. baumanii dan CRE K. pneumoniae
Analisis GC-MS. Enam stabil dan
semivolatile pound com- di P. betle ekstrak
• etanol daun diidentifikasi berdasarkan perbandingan dari GC waktu retensi relatif mereka
andmass spektrum dengan orang-orang dari NISTMS
• Senyawa-senyawa antimikroba diidentifikasi meliputi etil diazoacetate, 4- (2-propenil) fenol,
eugenol, tris (trifluoromethyl) fosfin, heptafluorobutyrate, dan 3- fluoro-2-propynenitrite
(Tabel 2). Dalam studi sebelumnya pada P. betle dikumpulkan dari berbagai provinsi di
Filipina, yaitu, La Union, Abra, Iloilo, Palawan, dan Bukidnon, dua puluh compoundswere
diidentifikasi sebagai konstituen dari daun tanaman minyak atsiri [4].
• Eugenol merupakan salah satu senyawa dengan waktu retensi tertinggi, sebagai sama
terungkap dalam hasil analisis GC-MS dalam penelitian kami.
• Studi lain dari enam kultivar India P. betle mengungkapkan bahwa dari beberapa pound com-
diidentifikasi dalam ekstrak daun eugenol juga ditemukan untuk menjadi umum dan
senyawa utama [18].
• Eugenol telah mendokumentasikan kegiatan antibakteri terhadap berbagai tanaman
Kesimpulan
• Hasil penelitian ini menunjukkan keberadaan berbagai senyawa bioaktif dalam
varian P. betle Filipina, yang memiliki aktivitas fisiologis atau terapeutik yang
berbeda.
• Telah diidentifikasi dua senyawa melalui TLC-bioautografi dengan nilai 𝑅𝑓 0,86
dan 0,13 yang menunjukkan aktivitas signifikan terhadap bakteri MDR terpilih.
• Hasil ini menunjukkan potensi pengembangan agen antimikroba terapi baru
dari P. betle yang mampu menangani penyakit tertentu atau kondisi medis
yang entah memiliki reaksi yang melemah atau saat ini tidak responsif
terhadap obat yang ada.
• Analisis melalui GC-MS telah mengidentifikasi senyawa volatil dan semivolatil
yang ada dalam ekstrak etanol daun.