TUGAS PRAKTIKUM BIOLOGI SEL MOLEKULER

Kelompok :
1. Roni Ardyantoro
2. Insiwi Purwianshari
3. Desy Normalia
4. Amalia Ala
Kelas
: Biologi E
Pembuatan sel kultur
1. Sentrifus dengan kecepatan 400 g (2000 rpm) selama 10 menit.
2. Supernatan dibuang diganti dengan MEM 10 ml kemudian putar lagi.
3. Supernatan dibuang kemudian tambahkan 10 ml MEM sampai 3 kali.
4. Jumlah setiap sel milimeter dihitung dengan menggunakan hemositometer dan cat
tripan blue(TBS).
Preparasi sel kultur
Teknik pembuatan KSG mempergunakan metode yang telah dilakukan oleh Channing
dan Kammerman (1978) adalah sebagai berikut :
1. Sel untuk pembuatan kultur diambil dari jaringan hewan atau dapat juga dari hewan
yang disembelih dari rumah pemotongan hewan setempat, kemudian dimasukkan ke
dalam botol berisi PBS dan antibiotik dalam termos es.
2. Setelah di laboratorium, jaringan (dalam hal ini ovarium) dibersihkan, kemudian sel
granuloa di ambil dengan menyedot cairan folikel menggunakan spuit steril dengan
ukuran jarum 26 gauge.
3. Folikel dibedakan menjadi ukuran kecil (1-2 mm), edang (2-5 mm), dan putaran 500
g, suhu 4oC, selama 5 menit untuk mendapatkan pelet el granulosa, kemudian dicuci
dengan PBS dengan cara disentrifus diulang sampai dua kali.
4. Sel granulosa ditumbuhakan dalam multiwells plate 48 sumuran dan chambers slide 8
kotakan dengan medium penumbuh yang mengandung 10% serum (FBS), 1%
antibiotik (penicillin-streptomicycin) dan 0,5 % antifungi (fungizone), kemudian
diinkubasi pada suhu 37oC dan 5% CO2 (95% udara).
5. Kepadatan sel granulosa pada saat ditanam adalah 1x105 sel/ml, jumlah sel granulosa
dihitung dengan mempergunakan counting chamber (Thoma hemocytometer) dan
pewarna eksklusi tripan biru.
6. Setelah inkubasi selama 24 jam, medium kultur diganti dengan medium penumbuh
yang masih segar dengan maksud untuk penyegaran dan sekaligus mengambil
fragmen-frangmen jaringan yang rusak dan sel yang mengalami kematian.
7. Etelah inkubasi selama 72 jam (48 jam setelah medium pertama), medium kultur
diganti dengan medium bebas serum (serum free medium) kemudian diberi perlakuan
dengan ; pelarut metanol (vehicle), FSH 50 g/ml, LH 50g/ml, kurkumin dan PGV-0
50 M, PGF2 0,56 M dan teofilin 5mM.
8. Setelah inkubasi selama 36 jam dalam medium perlakuan, kemudian medium diambil
dan diwdahi dalam tabung ependrof, setelah itu disimpan dalam suhu beku (-20C)
sampai dianalisis kadar E2 dan P dengan menggunakan medode enzymeimmunoassay

(EIA) atau radioimmunoassay (RIA), dan slide diproses dengan metode

immunositokimia.
Tahap-Tahap Pertumbuhan Sel Granulosa
1. Pertumbuhan sel yang lamban (lagphase)
2. Pertumbuhan sel sangat pesat (log phase)
3. Tanpa pertumbuhan sel (plateauphase atau stationerphase). Fase ini pertumbuhan sel
granulosa telah menyebar memenuhi seluruh permukaan dasar cawan kultur dan
terjadi persinggungan antara sel satu dengan lainnya sehingga sel berdesak-desakan
dan menyebabkan pertumbuhan terhenti. Pada kondisi konfluen, sel granulosa
menampakkan morfologi dan fungsi mirip dengan jarigan aslinya. Kultur sel primer
lapis tunggal menunjukkan sifat-sifat seperti jaringan aslinya. Waktu yang diperlukan
untuk pertumbuhan sel dari fase awal sampai dengan terbentuknya sel anakan baru
berkisar antara 18-24 jam.
Teknik Detach Kultur
Ambil media kultur dengan pipet, kemudian cuci dengan PBS non Ca dan Mg, 2 kali
tambahkan Collagenese 10mg20ml, atau Tripsin EDTA 0,25% sebanyak 1 ml
kemudian goyangkan dan amati di bawah mikroskop. Setelah semua sel lepas, hentikan
kerja enzim dengan menambahkan serum.
CPE (cytophatic efect)
1. Pelepasan sel granulosa dari dasar cawan kultur mempergunakan enzim collagenase.
2. Larutan kurkumin dibuat dengan melarutkan serbuk kurkumin dan methanol
proanalisis selanjutnya disaring dengan menggunakan milipore untuk mendapatkan
larutan kurkumin steril ( larutan stok). Untuk mengetahui dosi larutan kurkumin stok
dipergunakan spektofotometer dengan panjang gelombang 420 nm.
3. Penentuan dosis kurkumin yang menyebabkan kematian sel granulosa sebanyak 50 %
(CPE-50) dengan rumus Reed & Muench.