RESUME 12

Kelompok 12 :
1. Nurul Yanuarsih
2. Yunita Nur Agustiningsih

(140342604423)
( 140342601774 )

REKAYASA GENETIKA
Pengertian rekayasa genetika (genetic engineering) antara lain:
1. Manipulasi sifat genetic suatu organisme dengan cara mengintroduksi atau mengeliminasi
gen-gen tersebut (Micklos dkk., 1990).
2. Manipulasi genetic dalam sel untuk menghasilkan sifat yang dikehendaki, kadang disebut
teknologi rekombinasi DNA (Rasmussen dkk., 1950).
3. Teknik mengubah kombinasi genetik sel atau individu dengan cara pemindahan selektif,
insersi, atau modifikasi gen, baik individual atau perangkat gen (Klug dkk., 1994).
Teknologi rekayasa gnetika muncul dan berkembang pada fase ketiga perkembangan
bioteknologi saat manusia sudah mampu mendayagunakan ilmu kimia sel. Berbagai fenomena
genetic alami seperti crossing over, gene pick up, transduksi, insersi, delesi translokasi
(transposisi), fusi, dan fisi merupakan model alami rekayasa genetika. Pada fenomena tersebut
terjadi pemutusan, penyambungan, serta perpindahan materi genetic yang dapat mengakibatkan
penambahan atau pengurangan gen.
PROSES REKAYASA GENETIKA
Teknik-teknik Rekayasa Genetika
Transfer vektor
Transfer vector merupakan cara memasukkan suatu gen ke dalam sel melalui pembawa
(carrier) khusus. Vector yang digunakan antara lain plasmid, bakteriofag, dan kosmid (cosmid).
Selain itu, ada juga vector ulang-alik (Shuttle vector).
Secara kimiawi, vektor-vektor tersebut adalah molekul DNA yang memiliki sifat-sifat sebagai
berikut:
1. Harus mampu mereplikasi sendiri maupun segmen DNA yang diinsersikan bebas dari
replikasi kromosom sel inang dengan cara membawa suatu ori

2. Mengandung sejumlah tapak pemutusan enzim restriksi khusus yang bermanfaat untuk insersi
segmen-segmen DNA
3. Membawahi suatu penanda yang dapat dimanfaatkan (biasanya berupa gen-gen yang
bertanggungjawab terhadap resistensi) untuk identifikasi sel-sel inang yang mnegandungnya
4. Mudah terbebas kembali dari sel inang
Selain sifat-sifat di atas, ada juga sifat lainnya:
1. Berat molekul rendah
2. Adanya kemampuan untukl memberikan sifat fenotip yang dipilih dengan segmen pada sel
inang
1) Plasmid
Contohnya pSC101 (58 M dal), ColE1 (4,2 M dal), dan RSF2124 (7,4 M dal). Plasmidplasmid tersebut terbentuk secara in vivo dan terdapat pada E. coli (plasmid RSF2124
merupakan derivat dari plasmid ColE1): asal-usul yang pasti dari plasmid PSc101 belum jelas.
Rincian ketiga plasmid tersebut dapat dilihat pada Tabel 1.
Tabel 1.
Rincian sifat dari 3 plasmid yang terbentuk secara in vivo pada E. coli
Plasmid

PSc101

Ukuran (M dal)

5,8

Tapak

Tunggal Penanda

untuk Inaktivasi

untuk

seleksi

Endonuklease

transforman

insersi dari....

Xho L, Eco, R1, Resisten

Resisten

Pvu, II, Hind II, tetrasiklin

tetrasiklin

Hpa I, Hind III,

Bam HI, Sal I
ColE1

4,2

Eco R1

Imunitas

Produksi colicin

terhadap colicin E1
E1
RSF2124

7,4

Eco R1, Bam I

Resistensi

Produksi colicin

ampisilin

E1

Contoh-contoh p[lasmid lain pada E. coli ialah pBR322 (4363 kb), dan pUC19 (2686 kb) seperti
yang ditunjukkan pada Gambar 1 dan 2. Plasmid pUC19 adalah derivat dari pBR322, ukurannya
yang lebih kecil memungkinkan insersi fragmen DNA yang lebih besar.
2) Bakteriofag
Bakteriofag yang banyak digunakan dal;am teknologi DNA rekombinan pada E. coli adalah
fag ; seperti pada Gambar 3 yang memperlihatkan genom fag dalam kondisi tidak sirkuler.
Seluruh derivat fag yang digunakan sebagai vektor transfer sudah direkayasa sehingga hanya
siklus titik saja yang mungkin.

Gambar 1. Plasmid pBR322

Bakteri lain juga digunakan sebagai vector dan salah satu diantaranya adaam M 13.
Materi genetic m 13 berupa DNA unting tunggal yang bereplikasi menghasilkan DNA unting
ganda yang disebut RF. Molekul RF dapat dipandang setara plasmid dan DNA asing yang dapat
diinsersian ke tapak-tapak pemutusan enzim retriksi tunggal yang ada pada genom.
3. Kosmid
Kosmid adalah vektor yang dibuat di laboratorium dengan memanfaatkan urut-urutan cos
dan fag lamda yang berguna untuk pemasukan kromosom ke dalam kepala fag dan yang
memanfaatkan pula urutan-urutan untuk fungsi resistensi terhadap antibiotik serta replikasi.
Kosmid dirakit dari plamid dan fag lamda contohna plasmid pBR322. Rakitan plasmid dan
kosmid memiliki urutan on suatu penanda sominan seperti amp serta tapak retriksi unik untuk
insersi dan pengklonan fragmen DNA seperti pada gambar 5.
Gambar 4

Bagan kromosom fag ; terlihat pula

bahwa

bagian

tengah

kromosom

dapat

disingkirkan dan diganti dengan DNA asing.

Gambar 5
Bagan Kosmid

4. Vektor ulang-alik (Shuttle vectors)

Vektor ulang alik adalah vektor pengklon berupa plasmid khusus yang sudah direkayasa
materi genetiknya sehingga dapat memasukkan molekul DNA rekombinan ke dalam dua
atau lebih makhluk hidup inang.

5. Injeksi mikro, fusi protoplas, elektroporasi, kopresipitasi kalsium fosfat dan endositosis, serta
proyeksi mikro.

Injeksi mikro: menggunakan jarum mikroskopis untuk memasukkan DNA melalui

membran sel sasaran termasuk ke dalam inti sel.

Fusi protoplas: pelarutan dua membran sel dari sel-sel yang berbeda sehingga dua sel
dapat digabung menjadi satu. Misalnya fusi sel-sel yang dikultur dengan protoplas bakteri
yang mengandung DNA eksogen. Dengan teknik ini, protoplas sel yang memperoleh
DNA eksogen dapat mencapai 100%.

Berkaitan dengan fusi protoplas, suatu sistem trasformasi sederhana telah dikembangkan
yaitu dengan memanfaatkan lisosom yang tersusun dari suatu lipida kationik.
Pemanfaatan lisosom sabagai sistem transformasi atau transfeksi ini disebut sebagai
lipofeksi (lipofection).

Gambar 6.
Vektor ulang alik yEp 24 pada khamir dan E. coli

Pada teknik elektroporasi digunakan listrik untuk menciptakan lubang kecil di membran sel
yang akan dimanfaatkan untuk pemindahan DNA ke dalam sel. Berkenaan dengan
elektroporasi informasi dari Old dan Primrose (1989) menyebutkan bahwa pada pendedahan
singkat kejutan listrik berkekuatan antara 4000-8000 V, sel-sel memperoleh DNA eksogen
dan larutan sekitar (tampaknya melalui lubang-lubang yang terbentuk sesaat pada membran
plasma). Disebutkan pula bahwa perlakuan dengan colsmid sebelum kejutan listrik akan
meningkatkan frekuensi efisien transformasi (Potter dkk., 1984 dalam Old dan Primrose,

1989).
Pada teknik kopresipitasi kalsium fosfat dan endositosis tampaknya butir-butir kopresipitasi
kalsium fosfat dan DNA masuk ke dalam sel melalui endositosis fagositosis (Old dan
Primrose, 1989). Pada teknik ini merupakan cara umum memasukkan suatu DNA ke dalam
sel-sel mamalia, sekalipun tingkat keberhasilan teknik antara 1-2%. Adapula laporan yang
menyebutkan sudah ada perbaikan prosedur yang mampu meningkatkan tingkat keberhasilan

teknik ini hingga mencapai 20%.

Pada teknik proyektil mikro, DNA ataupun RNA ditembakkan ke dalam sel (Klein dkk.,
1987 dalam Old dan Primrose 1989), teknik ini merupakan suatu cara yang sama sekali baru
untuk memasukkan asam nuklet ke dalam sel tumbuhan memanfaatkan kecepatan tinggi.
Gambar 7 memperlihatkan bagan senapan penembak proyektil mikro. Pada pengujian yang

dilakukan sebagian besar sel daun Alium cepa didaerah sasaran seluas 1 cm2 yang ditembaki
proyektil-proyektil makro terbukti bahwa DNA yang masuk kedalam sel bersama proyektil
mikro diekspresikan. Pada teknik proyeksi mikro membutuhkan kultur sel ataupun perlakuan
jaringan resipien.
Prosedur Dasar Teknologi DNA rekombinan
Urutan proses yang menjadi prosedur dasar pada teknik DNA rekombinan yang diperantarai
vektor diantaranya:
1. Pembuatan fragmen DNA dengan bantuan enzim nuklease retriksi yang memotong molekul
DNA pada urutan nukleotida yang spesifik
2. Segmen-segmen terebut digabung ke olekul DNA lain dengan bantuan vektor
3. Vektor yang sudah terinsersi segmen DNA ditransfer ke suatu sel inang.
4. Segmen-segmen DNA yang diklon dapat diambil dari sel inang, dimurnikan dan dianalisis
5. Sel-sel inang yang mengandung DNA rekombinan menghasilkan kepada seluruh sel turunan
6. DNA yang di klon dapat di transkripsi, RNAd-nya ditranslasi, serta produk-produk gennya
diisolasi dan dikaji.
Peran enzim Endonuklease Retriksi
Dalam teknik DNA rekombinan dibutuhkan enzim yang dapat memotong molekul DNA,
yaitu enzim endonuklease retriksi. Enzim tersebut dapat memotong molekul DNA unting ganda
pada urutan pasangan nukleotida spesifik yang dikenal sebagai tapak retriksi.
Pada makhluk hidup prokariotik tidak ada enzim endonuklease retriksi yang sama satu
sama lain. Dalam penamaan enzim tersebut berdasarkan makhluk hidup tempat enzim tersebut
diisolasi, secara konvensional digunakan tiga huruf dalam posisi miring yang diikuti dengn suatu
angka romawi, kadang juga huruf tambahan sebagai penanda strain. Contoh, Bgl ii berasal dari
Bacillus globigi.

Enzim endonuklease retriksi menjadi dua tipe. Tipe I mengenali suatu urutan pasangan
nukleotida yang spesifik pada DNA dan memotong DNA pada suatu tapak tidak spesifik jauh
dari urutan pasangan nukleotidanya. Dikarenakan tapak pemotongan tipe I tidak spesifik maka
tipe I tidak terlalu bermanfaat dalam pembentukan DNA rekombinan. Sedangkan tipe II
memotong DNA justru di dalam urutan pasangan nukleotida yang spesifik sehingga
bermanfaatan dalam pembentukan molekul DNA rekombinan.
Enzim endonuklease retriksi tipe II memiliki sumbu simetri yang memiliki titik tengah
urutan pengenalan. Dalam hal ini urutan basa 5 -> 3 pada unting DNA sama dengan urutan
basa 5 -> 3 pada basement nya sehingga disebut twofold rotational symmetry.
Tiap enzim yang telah diisolasi dari sejumlah besar strain bakteri yang berbeda akan
memotong DNA pada suatu urutan pasangan nukleotida yang spesiifik. Jumlah potongan yang
dibuat enzim pada suatu molekul DNA tergantung pada banyaknya jumlah urutan pengenalan
ditemukan pada DNA. Juga terdapat isoehizemer yaitu enzim yang berbeda mmengenal dan
memotong urutan pasangan nukleotida yang sama.
Pada tabel 2 yang merupakan beberapa contoh enzim endonuklease restriksi tipe II
memperlihatkan bahwa sebagian enzim mengenal urutan sepanjang empat pasangan nukleotida,
sebagian lagi mengenal urutan sepanjang enam dan delapan pasangan nukleotida. Selain itu
terdapat enzim endonuklease restriksi tipe II yang mengenal urutan sepanjang lima dan tujuh
pasangan nukleotida.
Pada tabel 2 juga terlihat bahwa sebagian pemutusan DNA oleh enzim endonuklease
restriksi tipe II terjadi pada posisi menyamping, tetapi sebagian lagi pada posisi berhadapan.
Pemutusan DNA pada posisi menyamping menghasilkan ujung 5 lancip atau ujung 3 lancip
sedangkan pemutusan pada posisi berhadapan menghasilkan ujung tumpul. Enzim endonuklease
restriksi tipe II yang menghasilkan ujung lancip memiliki nilai khusus pada pengklonal fragmen
DNA jika kedua ujung lancip hasil pemotongan bertemu dalam larutan, maka akan terbentuk
pasangan basa yang sempurna (ikatan kimia antara gula dan asam fosfat akan terbentuk di bawah
pengaruh enzim DNA ligase).

Tabel 2. Contoh Enzim Endonuklease Restriksi serta Beberapa Deskripsi Sifatnya

Gambar 9. Contoh pemutusan

molekul dna oleh enzim

Peluang jumlah tapak pemutusan (table 3) dapat dihitung dengan mengetahui jumlah

pasangan nukleotida pada setiap mutan pengenal.

Nukleotida yang dihitung sepanjang tiap pasangan nukleotida bersifat acak

Seleksi Klon Rekombinan

Untuk mengetahui urutan yang mana dari fragmen DNA retriksi yang ditranskripsi
menjadi RNA atau cara membuat peta urutan hasil-hasil hibridisasi dengan fragmen-fragmen
retriksi. Maka, Southern mengembangkan suatu metode untuk mendeteksi fragmen-fragmen di
dalam sel agarose yang komplementer dengan urutan DNA atau RNA tertentu.
Pada Soouthern Blotting yang dikembangkan untuk menganalisis RNA dan protein yang
dikenal dengan Nothern dan Western. Pada intinya, teknik blotting ini mentransfer makro
molekul dari gel yang berarti mereka telah dipisahkan secara elektroferesis ke permukaan suatu
membran. Sekali ditransformasi, makro molekul ini akan atau dapat difiksasi secara permanen
pada membran. Membran ini relatif mudah ditangani dan dapat dipakai untuk berbagai macam
teknik analisis.sebagai akibatnya, membran ini juga luas pemakaiaannya dalam mendeteksi dan
menganalisis asam dan protein.
Gambar 10. Bagan Teknik Southern Blotting

MANFAAT DAN RESIKO REKAYASA GENETIK

Manfaat rekayasa genetic dapat dilihat kaitannya dengan analisis genetic diagnosis atas
penyakit manusia, terapi gen, sidik jari DNA, serta bioteknologi.
Analisis Genetika
Pada ahli genetika menggunakan teknik-teknik DNA rekombinan untuk analisis genetic.
Teknik-teknik ini memungkinkan pengadaan suatu kumpulan klon yang meliputi keseluruhan
klon demikian pula memungkinkan pemetaan genetika meupun fisik yang lengkan serta
memungkinkan penetapan urutan nukleotida dari keseluruhan kromosom. Peta fisik yang
dihasilkan memperlihatkan seluruh gen pada genom yang ditandai oleh urutan nukleotida, tanpa
memperhatikan mutan bahkan sering tanpa dukungan pengetahuan awal tentang fungsi atau
fenotip dari gen-gen yang dipetakan.
Diagnosis Molecular atas Penyakit Manusia
Pemanfaatan urutan DNA yang diklon memungkinkan pengamatan langsung terhadap
genotip dari pada pengamatan atas suatu produk gen yang belum dikenal atau yang tidak
terekspresi. Contoh deteksi molecular dapat dilakukan atas Thelessemia dan sickle cell anemia.
Terapi Gen
Kemampuan mengisolasi dan mengklon gen-gen spesifik manusia yang pada mulanya
dikembangkan sebagai suatu penelitian. Proses terapi semacam ini disebut terapi gen. Panduan
terapi gen disusun dan mencakup beberapa pernyataan , yaitu:
a. Gen harus diisolasi dan ditransfer
b. Cara transfer gen yang efektif harus ada
c. Jaringan target harus dapat tercapai, sebagai contoh percobaan tetapi gen yang pertama
menggunakan sel-sel darah putih ataupun prekursornya sebagai jaringan target.
d. Tetapi gen tidak boleh menyakiti pasien dan sudah tidak ada cara terapi lain yang efektif.

Sidik jari DNA

RFLP sudah digunakan untuk membedakan salinan gen yang normal dari yang mutan dan
dapat digunakan sebagai penanda polimorfisme tersebut diwariskan dalampola kodomain.
Fenotip dari penanda-penanda ini berupa susunan atau deretan fragmen DNA berbagaiukuran
yang ada pada southern blott, sesudah DNA dipotong dengan suatu enzim endonuklease retriksi.
Suatu tipe RFLP kedua muncul dari variasi jumlah urutan berulang tandem. DNA yang ada
diantara dua tapak enzim endonukleotida retriksi. Urutan tersebut berasal dari dua hingga dua
puluh nukleotida. Urutan semacam itu tersebar luas pada genom manusia, dan jumlah alela pada
lokus-lokus tersebut berkisar antara dua hingga lebih dari dua puluh. Lokus-lokus itu disebut
VNTR (Variabel Number Tandem Repeats).
Pola pita yang dihasilkan tatkala urutan VNTR dipotong dengan menggunakan enzim
endonuklease retriksi dan divisualisasikan dengan southern blotting itulah yang dikenal sebagai
sidik jari DNA.
Bioteknologi
Masing-masing jaringan dikendalikan oleh banyak gen. Jadi mengubah bentuk tubuh
maupun intelegensi manusia pada saat sekarang masih jauh dari jangkauan teknologi genetika
yang diketahui.

Catatan Lain Tentang Bioteknologi di Bidang Pertanian

Menurut Miklos dan Freyer (1990) kesulitan analitis genetis tanaman disebaban oleh: (1)
Pertumbuhan tanaman yang lambat dan umur pergantian generasi yang lama, (2) besarnya
genom tanaman, termasuk banyaknya kromosom poliploidi, dan (3) dimilikinya kotak kayu
yaitu dinding sel berupa selulosa yang mengelilingi tanaman. Sehingga perlu dilakukan
penelitian mengenai sifat-sifat yang dikendalikan oleh gen tunggal.

Namun kebanyakan sifat dikendalikan oleh banyak gen (multigen). Sifat yang
dikendalikan oleh banyak gen sangat sulit direkayasa dan dikendalikan. Seperti fiksasi nitrogen
yang dikendalikan oleh lebih dari 15 gen yang berbeda dalam sistem bakteri/tanaman. Banyak
gen yang belum berhasil diisolasi (dipisahkan), bahkan meskipun berhasil dipisahkan ilmuwan
masih harus mengatasi kesulitan dalam memindahkan gen-gen itu ke dalam tubuh tanaman
budidaya. Gen-gen itu harus diletakkan pada sisi/tempat tertentu dalam kromosom tanaman agar
dapat berfungsi. Kemudian meskipun tanaman budidaya dapat menerima gen pemfiksasi
nitrogen, masih tetap belum diketahui bagaimana caranya mengatur kerja dan tidak kerja
gennya (on dan offnya). Peneliti tumbuhan memiliki masalah dalam merekayasa secara
genetis pengembangan kemampuan tanaman dalam fotosintesis untuk mengatasi kekeringan agar
panen tetap meningkat.
Menciptakan Dasar yang Kokoh Bagi Keberhasilan Pengembangan Rekayasa Genetika di
Indonesia
Gagasan ini pernah dikemukakan di Semnas Bioteknologi Pertanian di IPB. Keinginan
kita adalah supaya rekayasa genetika sebagai ilmu terapan biologi dapat dikuasai dan
dikembangkan.Usahanya adalah secepat mungkin menciptakan dasar yang lebih kokoh bagi
pengembangan rekayasa genetika yang dilakukan, diharapkan lebih berhasil sehingga kita tidak
hanya mampu melakukan alih teknologi saja.
Dasar yang kokoh dalam pengembangan rekayasa di Indonesia dengan tumbuh dan
berkembangnya ilmu murni pendukungnya. Ini dasar utama dalam pengembangan rekayasa
genetika sebagai ilmu terapan selain faktor lainnya. Artinya ilmu murni genetika, biokimia,
biologi molekuler dans ebagainya harus tumbuh dan berkembang. Ha tersebut harus ditunjang
oleh tenaga handal dan prasarana yang dibutuhkan
Upaya pengadaan tenaga handal yaitu dengan perbaikan dan pembenahan jalur
sekolah(pendidikan). Agar tenaga handal tersebut memiliki ilmu murni yang kuat, sehingga
banyak muncul karya penelitian murni yang dapat mendorong pertumbuhan dan perkembangan
ilmu murni dalam genetika, biokimia, biomol dan lainnya. Atas dasar ilmu murni yang sudag
berkembang inilah diharapkan laju pertumbuhan dan perkembangan ilmu terapam termasuk
rekayasa genetika semakin dipercepat.

PERTANYAAN
1. Bagaimana proses teknik rekayasa genetika menggunakan teknik elektroporasi?
Jawab: teknik elektroporasi digunakan listrik untuk menciptakan lubang kecil di membrane
sel yang akan dimanfaatkan untuk memindah DNA ke dalam sel. Pada pendedahan singkat
kejutan listrik berkekuatan antara 4000-8000V, sel-sel memperoleh DNA eksogen dan larutan
sekitar. Disebutkan pula ahwa perlakuan dengan colsmid sebelum kejutan listrik akan
meningkatkan

frekuensi

efesiensi

transformasi.

Ditemukan

bahwa

DNA

linier

mengalamitransformasi lebih efisien daripada DNA yang sangat terpilin.

2. Apakah pada tumbuhan juga terdapat teknik untuk melakukan rekayasa genetika? Jelaskan!
Jawab : Ada, pada tumbuhan juga terdapat teknik prozektil mikro yang mana DNA ataupun
RNA ditembakkan ke dalam sel, bahkan dinyatakan teknik tersebut merupakan suatu cara
yang sama sekali baru untuk memasukkan asam nukleat ke dalam sel tumbuhan dengan
memanfaatkan kecepatan tinggi.