PENUNTUN PRAKTIKUM

MIKROBIOLOGI DASAR

Disusun oleh :
Dra. Hj. Dewi Rusmiati
Dra. Hj. Sulistianingsih, M. Kes
Dr. Tiana Milanda, M.Si.
Sri Agung Fitri Kusuma, M.Si.
Tina Rostinawati, M.Si.
Dr. Med. Melisa Intan Barliana

UNIVERSITAS PADJADJARAN
FAKULTAS FARMASI
LABORATORIUM MIKROBIOLOGI
JATINANGOR
2015

KATA PENGANTAR

Penuntun Praktikum Mikrobologi Dasar ini disusun sebagai penuntun

bagi para mahasiswa dalam melakukan praktikum Mikrobiologi Dasar di
FakuItas Farmasi Universitas Padjadjaran. Tujuan utamanya adalah membantu
para mahasiswa Farmasi dalam mempelajari teknik dan prosedur dasar
laboratorium mikrobiologi.
Materi praktikum Mikrobiologi Dasar meliputi pengenalan mikroskop,
tcknikpewarnaan, penyiapan alat dan media, pengenalan berbagai sifat fisiologis
bakteri sertacara identifikasi bakteri. Materi-materi tersebut disusun dari
berbagai buku Mikrobiologi Dasar, baik teori maupun penuntun praktikum.
Penyusun menyadari bahwa buku ini masih jauh dari sempurna, namun
demikian diharapkan tetap dapat membantu mahasiswa atan siapa saja yang
berminat pada bidang mikrohiologi. Akhir kata, tegur sapa dan koreksi untuk
perbaikan buku kami sangat harapkan.

Jatinangor, 2015

Penyusun

TATA TERTIB DAN BENTUK LAPORAN

TATA TERTIB LABORATORIUM

Untuk mencegah kontaminasi alat dan bahan serta melindungi diri dari
kecelakaan di laboratorium, para mahasiswa diwajibkan mematuhi tata tertib
laboratorium sebagai berikut :
1.
Baca dan pelajari praktikum yang akan dikerjakan, sebelum memasuki
laboratorium.
2.
Letakkan tas dan benda-benda lain yang tidak diperlukan di tempat yang
tersedia. Gunakan jas laboratorium selama bekerja di laboratorium.
3.
Bersihkan meja laboratorium dengan desinfektan sebelum dan sesudah
praktikum.
4.
Cuci tangan dengan air dan sabun sebelum dan sesudah praktikum.
5.
Jangan makan, minum atau merokok di laboratorium. Jauhkan tangan dan
mulut, hidung dan telinga selama praktikum.
6.
Perlakukan semua mikroorganisme sebagai patogen (mampu menimbulkan
penyakit) Tidak diperkenankan membawa keluar biakan mikroorganisrne dari
laboratorium.
7.
Usahakan biakan mikroorganisme tidak tercecer dan tidak tercampur dengan
mikroorganisme lain. Jika tercecer, tuangkan desinfektan di atasnya, biarkan
beberapa menit, lalu bersihkan dengan kertas isap. Jika tabung berisi
mikroorganisme pecah, tuangkan desinfektan ke atasnya, biarkan beberapa
menit, buang ke tempat sampah.
8.
Jika mahasiswa terkontaminasi atau terluka, hubungi segera asisten
laboratorium.
9.
Ose harus disterilkan dengan memijarkan seluruh kawatnya sebelum dan
sesudah digunakan.
10.
Jika pipet yang sama digunakan lebih dan satu kali, letakkan pada penyangga
rak tabung reaksi.
11.
Api pada pembakar spirtus harus dimatikan, jika tidak digunakan.
12.
Biakan yang sudah tidak diperlukan harus diserahkan kepada asisten.
13.
Kaca obyek, kaca penutup dan pipet direndam dalam larutan yang berisi
desinfektan, lalu dicuci dengan air dan sabun. Labu ukur, erlenmeyer dan
beker glass dbasuh dengan desinfektan, lalu dicuci dengan air dan sabun.
Tabung reaksi dan cawan petri diletakkan dalam panci berisi air, rebus sampai
mendidih. lalu cuci dengan air dan sabun.
1 4.
Bersihkan lensa-lensa mikroskop menggunakan kapas dan xylene.
15.
Rapihkan kembali laboratorium tempat anda bekerja.

BENTUK LAPORAN
A. PENGAMATAN MIKROSKOPIS
Semua pengamatan mikroskopis harus digambarkan dan diwarnai sesuai
dengan pengamatan di bawah mikroskop, pada buku gambar khusus. Setiap halaman
diberi garis pinggir lalu dibagi menjadi 2 bagian. Setiap bagian diperuntukkan untuk 1
pengamatan. Pada bagian atas, dituliskan :
- Nomer dan nama kegiatan
- Tanggal pengamatan
- Zat kimia (yang dipakai)
- Sampel (mikroorganisme)
Hasil pengamatan digambarkan dalam sutui zona lingkaran dan diberi
keterangan yang diperlukan. Buku gambar dikumpulkan dan diperiksa pada tengah
semester.
B. LAPORAN
Kegiatan selain pengamatan mikroskopis, diwajibkan untuk diserahkan dalam
bentuk laporan praktikum. Laporan dibuat oleh masing-masing kelompok praktikan
dengan format sebagai berikut:
1.
Cover laporan, terdiri dari nomor dan nama kegiatan, fnama dan nomor induk
mahasiswa serta nama laboratorium tempat prakikum berlangsung.
2.
Format dalam, terdiri dari :
- tujuan
- teori singkat
- alat dan bahan
- prosedur kerja
- data pengamatan dan hasil perhitunan
- pembahasan
- kesimpulan dan saran
- daftar pustaka
-

Laporan dapat ditik maupun ditulis tangan (rapih).

Laporan harus diserahkan 1 minggu setelah praktikum tersebut berlangsung.
Perpindahan jam/hari praktikum hanya boleh dilakukan atas seizin Kepala
Laboratorium Mikrobiologi Dasar.
Mahasiswa yang mengikuti praktikum kurang dari 80% atau tidak
menyerahkan hasil pengamatan
mikroskopis dan laporan, tidak
diperkenankan mengikuti ujian praktikum.

Berbagai prosedur umum kerja dalam mikrobiologi yang membutuhkan teknik

Gambar 1

Saran saran Kerja Aseptis :

1. Sebelum
membuka
ruangan
atau
bagian
steril
di
dalam
tabung/cawan/Erlenmeyer sebaiknya bagian mulut (bagian yang
memungkinkan kontaminan masuk) dibakar/dilewatkan api terlebih dahulu.
2. Pinset, batang pengaduk dll dapat disemprot dengan alcohol 70% terlebih
dahulu lalu dibakar.
3. Ujung jarum inoculum yang sudah dipijarkan harus ditunggu dingin dahulu
atau dapat ditempelkan tutup cawan bagian dalam untuk mempercepat
transper panas yang terjadi.
4. Usahakan bagian alat yang diharapka dalam kondisi steril didekatkan ke
bagian api.
5. Jika kerja di Safety Cabinet tidak perlu memakai pembakar Bunsen tetapi jika
kerja di luar Safety Cabinet maka semakin banyak sumber api maka semakin
terjamin kondisi aseptisnya.

KEGIATAN I
MIKROSKOP MEDAN TERANG
TUJUAN
Memperkenalkan prinsip-prinsip penting Mikroskopi cahaya, bagian-bagian
mikroskop majemuk, penanganan dan pemeliharaan serta penggunaan mikroskop
yang baik.
TEORI SINGKAT
Mikroskop Medan Terang
Mikroskop Medan Terang (bright field microscope) adalah mikroskop dengan medan
rnikroskopis atau medan yang mengelilingi spesimen terlihat terang, sedangkan obyek
yang diamati tampak lebih gelap dari latar belakangnya. Hal ini disebabkan cahaya
dari suatu sumber masuk melalui sistem-sistem lensa tanpa mengalami perubahan,
sehingga terbentuk medan yang terang. Mikroskop yang dipakai saat ini umumnya
menggunakan dua sistem lensa terpish, yaitu lensa obyektif dan lensa okular, maka
mikroskop ini disebut pula sebagai mikroskop majemuk.
Pada umumnya, mikroskop ini menghasilkan perbesaran maksimum sekitar 1000X.
Ketajaman bayangan pada perbesaran maksimum tergantung pada pengaturan
diafragma, kondensor, minyak emersi dan faktor-faktor lain
Gambar l. Mikroskop Majemuk

Lensa dan Perbesaran

Lensa mikroskop terdapat pada kondensor, obyektif dan okular. Kondensor
merupakan lensa pengumpul cahaya di bawah pentas yang memusatkan cahaya pada
spesimen. Lensa obyektif merupakan lensa yang terletak dekat dengan spesirnen dan
lensa okular merupakan lensa pada ujung atas mikroskop, dekat dengan mata.
Lensa pada kondensor memusatkan kerucut cahaya pada medan specimen.
Sebagian berkas cahaya daam kerucut cahaya akan langsung menembus lensa
obyektif, untuk mcmbentuk cahaya latar belakang atau medan terang. Berkas cahaya
yang mengenai obyek akan difokuskan lensa obyektif sehingga membentuk bayangan
nyata. Bayangan tersebut diperbesar oleh lensa okular untuk menghasilkan bayangan
maya.
Kebanyakan mikroskop laboratorium dilengkapi tiga lensa obyektif, yaitu
lensa 16 mm (berkekuatan rendah 10 X), lensa 4 mm (berkekuatan tinggi 40-45 X)
dan lensa celup minyak 1,8 mm (97-100 X). Lensa-lensa tersebut terletak pada suatu
bidang yang dapat diputar. Angka 16, 4 dan 1,8 menyatakan jarak fokus (focal
length), sedang angka 10 X, 45 X dan 100 X nenyatakan daya perbesaran. Perbesaran
total diperoleh dengan mengalikan perbesaran obyeklif dengan perbesaran okular.
Ujung lensa obyektif celup minyak sangat kecil sehingga hanya sedikit cahaya
yang masuk, maka diafragma iris kondensor harus dibuka penuh dan penghematan
cahaya dilakukan dengan bantuan minyak emersi.
Resolusi dan Daya Pisah
Bila lensa difokuskan pada suatu obyek, maka dua titik terpisah pada benda
tersebut akan membentuk dua bayangan. Tetapi kedua bayangan tersebut dapat
terlihat sebagai satu titik akibat adanya difraksi. Resolusi adalah kemampuan lensa
untuk memisahkan kedua bayangan sebagai bagian-bagian yang terpisah. Difraksi
menyebabkan resolusi tidak mungkin sempurna.
Jarak terpendek yang masih mungkin untuk melihat dua bayangan sebagai
bagian-bagian terpisah disebut daya pisah lensa. Daya pisah ditentukan oleh panjang
gelombang cahaya dan tingkap numeris (numerical aperlure atau NA) sistem lensa
obyektif dan kondensor. Hubungan tersebut dinyatakan daam persamaan berikut :
Daya pisah = panjang gelombng
r=

Tingkap numeris NA obyektif + NA kondensor

Dari persamaan tersebut terlihat, bahwa makin pendek panjang gelombang atau makin
besar tingkap numeris, maka makin kecil nilai r (dayapisah) atau makin tinggi resolusi
mikroskop.
Tingkap numeris (NA) adalah pernyataan matematis kerucut cahaya yang
dihantarkan kondensor pada spesimen dan dikumpulkan oleh lensa obyektif.
NA = n sin , dimana n adalah indeks bias medium diantara lensa obyektif dan
spesimen, sedang sin O adalah sinus setengah sudut yang dibentuk kerucut cahaya
dari kondensor yang melewati spesimen menuju lensa obyektif. Bila digunakan lensa
obyektif kering, maka n adalah indeks bias udara (n = 1). Sedang untuk Obyektif
celup minyak n adalah indeks bias minyak emersi celup (n=1,56).

2
Iluminasi
Bola pijar lebih disukai sebagai cahaya, sebab warna, dan intensitasnya lebih
mudah dikendalikan. Bila mikroskop dilengkapi dengan cermin, maka selalu
menggunakan sisi cermin yang datar. Sisi cermin yang datar dapat memantulkan
berkas-berkas cahaya paralel yang diperlukan mikroskopyang menggunakan
kondensor.
Manipulasi kondensor dan diafragma iris diperlukan untuk mendapatkan
kontras kedalaman medan dan daya pisah yang optimum. Agar kondensor dapat
memusatkan semua berkas cahaya pada spesimen, maka harus terletak pada posisi
tertinggi.
Jumlah berkas cahaya yang memasuki lensa obyektif tergantung pada jenis
obyektifnya. Semakin besar daya pembesaran obyektif, semakin banyak cahaya yang
diperlukan. Jumlah cahaya yang masuk dapat diatur dengan membuka dan menutup
diafragma iris, yang terletak antara kondensor dan sumber cahaya. Sebaliknya, bila
menggunakan obyektif celup celup, diafraglna harus dibiarkan terbuka penuh.
ALAT DAN BAHAN
1. Mikroskop majemuk medan terang.
2. Spesimen jadi bakteri.
3. Kapas dan kertas saring.
4. Minyak emersi dan xylene.
5. Air suling
PROSEDUR KERJA
A.

PENANGANAN DAN PEMELIHARAAN MIKROSKOP

1.

Mikroskop dibawa dalam posisi tegak dengan dua tangan, satu tangan
memegang tangkai dan tangan yang lain menyangga dasar mikroskop
Hindarkan mikroskop dari benturan tiba-tiba.
Jangan menyentuh lensa dengan tangan atau melepaskan lensa dari tempatnya.
Jangan memiringkan mikroskop, bila bekerja dengan lensa obyektif celup
minyak.
Jangan melakukan penyetelan mikroskop dengan paksa.
Jangan menukarkan lensa obyektif atau okular mikroskop.
Lensa okular harus dibersihkan setiap selesai penggunaan, dengan kertas
saring yang dibasahi air suling, lalu dikeringkan dengan kertas lain.
Bersihkan minyak emersi dari pentas dan penjepit kaca obyek dengan kapas.
Bersihkan lensa obyektif celup minyak dengan kertas saring atau kapas yang
dibasahi sedikit xylene (xylol), setiap selesai menggunakan mikroskop. Xylene
yang terlalu banyak akan menyebabkan perekat lensa menjadi larut.
Pasang lensa obyektif berkekuatan rendah pada posisi kerja, bila mikroskop
tidak digunakan

2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.

10.

11.

3
Simpan mikroskop di dalam kotak setelah diselubungi dengan plastik. Simpan
kotak tersebut di tempat yang kering atau mempunyai kelembaban yang
rendah.

B.

PENGGUNAAN MIKROSKOP

1.

Letakkan mikroskop pada jarak tertentu dari tepi meja sehingga mudah untuk
melakukan pengamatan.
Atur iluminasi dengan menjauhkan atau mendekatkan sumber cahaya.
Letakkan spesimen di atas pentas mikroskop.
Buka diafragma iris dengan penuh dan naikkan kondensor sampai sama tinggi
dengan pentas.
Bila diperlukan sumber cahaya dari luar; maka atur sisi datar cenninmikroskop
sehingga cahaya terlihat pada lensa kondensor.
Mulailah pengamatan dengan lensa obyektif berkekuatan rendah (10X).
Dengan bantuan tombol pengatur kasar, rendahkan lensa atau naikkan pentas
sampai lensa obyektif terletak 54 mm dari specimen.
Perbaiki letak cermin dan setel diafragma iris sampai area obyektif terletak di
tengah-tengah dan penuh cahaya. Jauhkan lensa obyektif secara perlahanlahan dengan tombol pengatur kasar sampai terlihat bayangan. Perjelas
bayangan dengan memutar tombol pengatur halus secara perlahan.
Untuk-mikroskop majemuk dengan sumber cahaya terpasang, putar pengatur
filter kerapatan netral (neutral density filter), sehingga lensa es (frosted lense)
terpasang pada tempatnya.
Jika ingin menggunakan lensa obyektifkering tinggi (40-45 X), putar lensa ke
posisi kerja, rendahkan lensa obyektif atau naikkan pentas dengan tombol
pengatur kasar, sampai hampir menyentuh kaca obyek. Jauhkanljensa obyektif
dari spesimen dengan menggunakan tombol pengatur kasar. Stel cahaya dan
fokus seperti pada lensa obyektif berkekuatan rendah.
Unfuk obyektif celup minyak, putar lensa obyektif kering tinggi menjauhi
posisi kerja, Taruhlah setetes minyak celup di atas spesimen. Putarlah obyektif
celup minyak pada posisi kerja, Lakukan penyetelan sepeti pada lensa
obyektif berkekuatan rendah.
Usahakan memulai pengamatan spesimen dengan lensa berkekuatan rendah,
lalu dilanjutkan dengan lensa berkekuatan tinggi.
Gambarkan sel-sel yang diamati dengan skala yang sesuai.

2.
3.
4.
5.
6.

7.

8.

9.

10.

11.
12

4
HASIL PENGAMATAN

KEGIATAN 2
PENYIAPAN PREPARAT MIKROORGANISME
TUJUAN
Mempelajari teknik lekapan basah dan tetes gantung untuk mengamati morfologi,
pola penataan dan motilitas mikroorganisme hidup di bawah mikroskop.
TEORI SINGKAT
Untuk mengamati mikroba dengan mikroskop cahaya dapat disiapkan dua
macam preparat, yaitu preparat basah (wel mount preparation) dan olesan yang
diwarnai. Cara kedua lebih sering digunakan, tetapi memiliki beberapa kelemahan.
Pada olesan yang diwamai, hanya dapat diamati mikroba yang mali, dengan ukuran
dan pola penataan yang sering berubah serta tidak dapat diamati pergerakannya
(motilitas).
Untuk pengamatan mikroba hidup, maka mikroba tersebut harus tersuspensi
dalam lingkungan cair yang memadai. Ada dua teknik penyiapan preparat, yaitu
lekapan basah (wel mount) dan tetes gantung. Kedua teknik ini menggunakan setetes
cairan yang mengandung mikroba hidup. Pada preparat basah dapat diamati
morfologi, pola penataan khas dan gerak bakteri (motil) dalam keadaan alami yang
tidak terganggu.
Pada pengamatan motilitas, seringkali pergerakan mikroba dikelirukan dengan
gerak Brown. Beberapa macam alga dan protozoa dapat bergerak bebas karena
memiliki flagela. Sedangkan beberapa jenis protozoa dapat bergerak karena memiliki
silia atau pseudopodia (pergerakan amuboid). Pergerakan sejati umumnya lebih
progresif dan terarah. Sedang gerak Brown merupakan gerakan menggetar partikelpartikel secara acak dan tidak terarah. Gerakan it tidak mengubah posisi mikroba
nonmotil terhadap benda-benda lain di sekelilingnya.
Pergerakan sejati juga sering dikelirukan dengan pergerakan oleh arus Cairan. Bila
preparat tersebut mengandung gelembung udara atau tidak tersegel baik, maka arus
udara dapat menyebabkan arus cairan.
Apabila preparat basah diperiksa dengan mikroskop medan terang, maka
diperlukan penyesuaian sumber cahaya. Intensitas cahaya dapat dikurangi dengan
menggunakan filter khusus.
Selain pengamatan mikroskopis yang menggunakan lekapan basah, motilitas
mikroba juga dapat diamati secara makroskopis. Bakteri ditanam dalam medium
setengah padat (mediun semi solid) dalam tabung reaksi. Penanaman dilakukan
dengan jarum penusuk yang ditusukkan secara tegak ke dalam medium tersebut.
Biakan diinkubasikan pada suhu yang sesuai selama 18-24 jam. Jika terdapat
motilitas, maka seluruh medium menjadi keruh, Tetapi jika bakteri hanya hidup pada
daerah tusukan saja, maka motilitas negatif

5
ALAT DAN BA HAN
l. Mikroskop majemuk
2. Suspensi bakteri Bacillus subtilis
3. Kaca obyek dan kaca obyek cekung
4. Kaca tutup
5. Vaselin
6. Air suling
7. Kapas dan kertas saring
PROSEDUR KERJA
A. PENYIAPAN LEKAPAN BASAH
1.
2.
3.
4.

Letakkan setetes suspensi bakteri di tengah-tengah kaca obyek.

Usapkan sedikit vaselin pada tepi telapak tangan kiri, lalu sentuhkan secara
bergantian pada ke empat sisi kaca tutup sehingga terlapisi vaselin.
Letakkan kaca tutup dengan bagian bervaselin ke arah kaca obyek, sehingga
mengelilingi suspensi bakteri, lalu tekan perlahan-lahan.
Amati di bawah mikroskop dengan lensa obyektif kering tinggi (40-45 X).
Gambarkan pengamatan morfologi, pola penataan sel dan motilitas dengan
skala yang sesuai.

B. PENYIAPAN PREPARAT TETES GANTUNG

1.
2.
3.

4.
5.

Ambil sebuah kaca tutup yang bersih, lalu lapisi ke empat sisinya dengan
Vaselin.
Taruhlah setetes suspensi bakteri di tengah-tengah kaca tutup tersebut.
Pegang kaca obyek cekung dengan bagian cekung menghadap ke bawah.
Dekatkan kaca obyek pada kaca tutup, sehingga bagian cekung akan
mengelilingi suspensi bakteri. Tekan perlahan-lahan sampai vaselin menyebar
dan membentuk segel.
Balikkan kaca obyek tersebut dengan cepat, sehingga suspensi bakteri akan
menggantung di kaca tutup tanpa menyentuh kaca obyek.
Amati di bawah mikroskop dengan lensa obyektif kering tinggi (40-45 X).
Gambarkan pengamatan morfologi, pola penataan sel dan motilitas dengan
skala yang sesuai.

6
HASIL PENGAMATAN

KEGIATAN 3
PENYIAPAN OLESAN BAKTERI
TUJUAN
Mempelajari cara menyiapkan olesan bakteri yang baik, sebagai prasyarat untuk
berbagai pewarnaan.
TEORI SINGKAT
Olesan bakteri yang baik merupakan prasyarat bagi berhasilnya berbagai
teknik pewarnaan. Olesan yang baik adalah olesan tidak terlalu tebal alau terlalu tipis
dan tahan pencucian satu kali atau lebih, setelah difiksasi dengan panas. Bakteri tidak
hilang tercuci, dengan bentuk tetap dan tidak menyusut.
Kaca obyek yang digunakan harus bersih dari debu dan lemak serta tidak
boleh tergores. Partikel-partikel debu dan goresan pada kaca obyek dapat dikelirukan
dengan mikroorganisme. Di samping itu, olesan pada kaca obyek yang berlemak atau
berdebu akan cenderung mengumpul dan tidak menyebar dengan baik.
Hal penting lainnya ialah kemampuan menaruh sejumlah mikroorganisme
yang tepat pada kaca obyek, sehingga olesan tidak terlalu tebal atau terlalu tipis. Pada
olesan yang terlalu tebal, sel-sel bakteri akan bertumpuk sehingga sukar diamati
secara individu. Jumlah cahaya yang lewat melalui spesimen juga berkurang sehingga
menyulitkan pengamatan. Keadaan ini sering tejadi pada olesan-olesan dari biakan
yang diambil dari medium padat. Sedang pada olesan yang terlalu tipis, akan sulit
menemukan sel-sel tersebut. Keadaan tersebut cenderung terjadi pada olesan-olesan
yang dibuat dari biakan dalam medium cair.
Penyiapan olesan berbeda menurut jenis medium tempat tumbuh
mikoorganisme. yang bersangkutan. Bila medium berupa cairan (kaldu, susu, air liur,
air seni dan sebagainya), maka penyiapan olesan dimulai dengan menaruh satu atau
dua lup penuh biakan di atas kaca obyek.
Bila biakan berasal dari medium padat (agar miring, agar cawan atau bagianbagian tubuh), maka taruh satu atau dua lup penuh NaCl fisiologis steril di atas kaca
obyek, lalu campurkan sejumlah kecil biakan organisme. Sel-sel bakteri pada medium
padat cenderung saling melekat, sehingga harus disebarkan dengan baik. Untuk
mengambil biakan, gunakan jarum inokulasi yang lurus sehingga tidak terlalu banyak
biakan yang terambil.
Olesan bakteri harus betul-betul kering di udara terbuka sebelum difiksasi
dengan panas. Fiksasi pada olesan yang belunn kering akan menyebabkan sel-sel
bakteri seakan-akan terebus dan bentuknya menjadi tidak karuan. Fiksasi panas juga
dilakukan secukupnva untuk menghindarkan salah bentuk atau penyusutan sel.
Meskipun kaca obyek untuk penyiapan olesan tersebut tidak steril, namun
tetap digunakan teknik antiseptik. Hal tersebut untuk menghindari tercemarinya
biakan yang digunakan, juga untuk melindungi diri dari kontaminasi mikroorganisme.

7
ALAT DAN BAHAN
1. Suspensi bakteri pada medium cair.
2. Biakan bakteri pada medium padat.
3. Kaca obyek dan kapas
4. Alkohol 70 % dan NaCl fisiologis steril.
5. Pembakar spirtus dan spidol
6. Lup inokulasi (ose) dan jarum inokulasi.
PROSEDUR KERJA
1.
2.
3.

4.

5.
6.

7.

Bersihkan kaca obyek dengan kapas yang dibasahi alkohol 70 %, lakukan

pada kedua permukaannya.
Setelah bersih, peganglah kaca obyek pada pinggir-pinggirnya dan buat
lingkaran di tengah-tengah permukaan bawah kaca obyek dengan spidol
Bila biakan dalam medium cair, kocok biakan tersebut dengan baik, tanpa
membasahi sumbat tabung. Taruhlah 1-2 lup penuh suspensi mikroorganisme
pada kaca obyek yang sudah diberi tanda lingkaran di bawahnya. Sebarkan
organisme hingga rata seluas area lingkaran.
Bila biakan dalam medium padat, taruhlah 1-2 lup penuh air suling pada kac
obyek yang sudah diberi tanda lingkaran di bawalmya. Dengan jarum
inokulasi, pindahkalah sedikit biakan ke tetesan air, campurkan dan sebarkan
hingga rata seluas area lingkaran.
Biarkan olesan tersebut kering di dekat hawa hangat api. Olesan yang
mengering akan tampak lapisan tipis berwarna putih.
Setelah olesan benar-benar kering, lalukan kaca obyek tersebut.tiga kali di atas
api. Proses ini disebut fiksasi panas untuk mematikan mikroorganisme yang
bersangkutan dan membuatnya menempel pada kaca obyek.
Gunakan olesan-olesan tersebut untuk pewarnaan pada kegiatan-kegiatan
berikutnya.

8
HASIL PENGAMATAN

KEGIATAN 4
PEWARNAAN SEDERHANA
Mengamati ukuran, bentuk dan struktur-struktur tertentu dari bakteri, dengan
menggunakan satu macam zat pewarna.
TEORI SINGKAT
Sel-sel mikroorganisme umumnya tampak hampir tembus pandang
(transparan) bila diamati dengan mikroskop cahaya biasa. Hal tersebut diakibatkan
indeks bias sitoplasma sel hampir sama dengan indeks bias lingkungan, yang berupa
zat cair. Kontras antara sel dan latar belakangnya dapat dipertajam dengan cara
mewamai sel-sel tersebut dengan zat warna.
Ada dua golongan zat warna yang umum dipakai untuk pewarnaan
mikroorganisme, yaitu :
l.
Zat warna yang bersifat asam, dimana komponen warnanya adalah anion,
biasanya dalam bentuk garam natrium.
2.
Zat warn yang bersifat alkalis dengan komponen warna kation, biasanya
dalam bentuk klorida.
Pada pewarnaan bakteri, terjadi proses pertukaran ion-ion zat warna dengan
ion-ion protoplasma bakteri. Pada umumnya digunakan larutan-larutan zat warna
yang encer, jarang lebih dari 1 0%. Suatu larutan zat warna encer yang didiamkan
agak lama pada preparat, umumnya bekerja lebih baik daripada larutan zat warna
pekat yang didiamkan dalam waktu singkat.
Zat pemantek (mordant) sering ditambahkan pada waktu pewarnaan. Zat
tersebut berfungsi untuk menambah gaya gabung, dimana hasil reaksi antara sel dan
zat warna diendapkan oleh pemantek menjadi presipitat berbulir-bulir besar, sehingga
tidak mungkin keluar melalui pori-pori dinding sel.. Contoh zat pemantek adlah
amonium oksalat, fenol, iodium, asam tanat, garam-garam alumunium, besi, timah,
sego, tembaga, krom dan lain-lain. umumnya zat ini diberikan
- Sebelum penambahan zat warna
- Ke dalam larutan zat warna
- Antara pemakaian dua larutan zat warna
Teknik pewarnaan mikroorganisme dapat dibagi menjadi dua, yaitu .
1. Pewarnaan sederhana (tunggal)
2. Pewarnaan diferensial
Pewarnaan yang paling banyak digunakan ialah pewarnaan tungal, yang
mengunakan satu jenis zat warna. Zat-zat warna tersebut umumnya bersifat alkalin,
karena sitoplasma sel bakteri bersifat basofilik (suka akan basa).
Pewarnaan tunggal memungkinkan teramatinya ukuran dan bentuk/tipe
morfologi (kokus, basilus vibrio, spirilium, dsb.) dari bakteri. Selain itu, dapat pula
diamati struktur-struktur tertentu bakteri, seperti endospora. Berbeda dengan spesimen

hidup, sel-sel yang diwamai dan terfiksasi pada kaca obyek dapat dismpan sebagai
dokumentas untuk jangka waktu lama.
9
ALAT DAN BAIIAN
1. Sampel air liur
2. Suspensi campuran bakteri S. aureus dan B. subtilis.
3. Suspensi campuran bakteri E. coli dan B. sublilis.
4. Zat warna karbol fuksin, biru metilen dan karbol gentian violet.
5. Kaca obyek, kapas dan kertas saring.
6. Alkohol 70 % dan air suling dalam botol semprot.
7. Ose dan pembakar spirtus.
8. Bak pewarna.
9. Mikroskop majemuk dan minyak celup.
PROSEDUR KERJA
1. Buat masing-masing olesan bakteri dari air liur dan suspensi campuran bakteri
di atas kaca obyek yang bersih serta bebas lemak.
2. Setelah dingin, letakkan preparat tersebut di atas bak wratna, Genangi olesan
tersebut dengan salah satu dari zat warna. Bila digunakan karbol fuksin,
biarkan olesan terwarnai selama 5 menit. Bila digunakan biru metilen, biarkan
olesan terwarnai selama 1-2 tnenit, Sedang bila digunakan karbol gentian
violet, biarkan olesan terwarnai selama 15-30 detik.
3. Tuangkan zat warna yang berlebih dari preparat lalu bilas dengan air sampai
air bilasan berwarna pucat.
4. Keringkan preparat dengan kertas saring.
5. Teteskn sedikit minyak emersi pada preparat, lalu periksa di bawah
mikroskop. Mulailah dengan obyektif berkekuatan terendah 10X. lalu ganti
dengan lensa obyektif berkekuatan 100X. Amati dan gambarkan hasilnya.
Pewarnaan dengan karbol fuksin, sel bakteri akan berwarn merah. Bila
diwarnai dengan karbol gentian violet, sel bakteri akan berwarna ungu, Sedang
pewarnaan dengan biru metilen, sel bakteri akan berwarna biru.

10
HASIL PENGAMATAN

KEGIATAN 5
PEWARNAAN GRAM
TUJUAN
Menganuti dua kelompok bakteri yaitu Gram positif dan Gram negatif, dengan
menggunakan prosedur pewarnaan Gram, Memahami setiap langkah dan reaksi-reaksi
kimia yang terjadi dalam prosedur tersebut.
TEORI SINGKAT
Pewarnaan tunggal memungkinkan untuk mengamati ukuran dan bentuk
bakteri secara jelas. Tetapi bentuk bakteri-bakteri dengan morfologi yang sama dari
jenis yang berbeda, pewarnaan tersebut tidak dapat membedakannya. Untuk maksud
tersebut, maka dikembangkan teknik pewarnaan diferensial.
Pewarnaan diferensial bertujuan untuk mengetahui sifat-sifat bakteri terhadap
dua jenis pewarnaan dan untuk mengidentifikasi bakter. Zat-zat warna yang dipakai
lebih dari satu warna, baik dipakai satu-persatu maupun dalam suatu campuran.
Pada tahun 1884, seorang ahli bakteriologi Denmark menemukan pewarnaan
Gram. Melalui metode ini bakteri-bakteri dipisahkan menjadi dua kelompok besar,
yaitu :
1) Bakteri Gram positif, yang dapat menahan kompleks pewarna primer karbol
gentian violet-iodium sampai akhir prosedur (sel benvarna biru gelap atau
ungu).
2) Bakteri Gram negatif, yang kehilangan kompleks warna karbol gentian violetiodium dengan pembilasan alkohol dan tenwarnai oleh pewarna tandingan air
fuksin (sel berwarna merah muda).
Sekalipun mekanisme pewarnaan Gram belum diketahui dengan tepat, tetapi
perbedaan komposisi dinding sel bakteri Gram positif dengan Gran negatif, diduga
berperan terhadap reaksi Gram. Dinding sel yang tebal pada bakteri Gram positif akan
menyusut oleh pembi-lasan alkohol (terdehidrasi), sehingga pori-pori dinding sel
menutup dan mencegah larutnya kmpleks pewarna primer pada saat pemucatan.
Sedangkan dinding sel Granm negatif mengandung banyak lipid, yang pada umumnya
larut dalam alkohol dan aseton. Larutnya lipid diduga memperbesar pori-pori dinding
sel dan menyebabkan proses penmucatan berlangsung lebih cepat. Dugaan tersebut
didukung percobaan dimana berubah menjadi Gram negatif.
Walaupun demikian, prrbedaan reaksi tetap didasarkan atas perbedaan laju
lepas kompleks karbol gentian violet-iodium pada langkah pemucatan. jika pemucatan
berlebih bakteri C positif dapat memperlihatkan reaksi Gram negative. Faktor-faktor
lain yang dapat, menimbulkan keragaman pada reaksi Gram ialah :
1) Pelaksanaan fiksasi panas terhadap olesan

2)

3)
4)

5)

Olesan bakteri Yang dipanaskan secara berlebihan akan menyebabkan

pecahnya dinding sel. Akibatnya sel Granm positif akan melepaskan pewarna
primer dan menerima pewarna landingan.
11
Kerapatan sel pada olesan.
Olesan yangterlalu tebal akan memucat lebih lama dari olesan dengan
kerapatan sel normal.
Konsentrasi dan umur reagen yang digunakan.
Sifat, konsentrasi dan jumlah pemucat yang dipakai.
Sebagai pemucat, alkohol 95% bekrja paling lambat dan aseton paling cepat.
Umumnya digunakan campuran alkohol 95% dan aseton (l : 1).
Sejarah biakan.
Sejarah biakan meliputi umur biakan serta pH medium tempat bakteri tumbuh.
Umumnya reaksi Gram menggunakan biakan berumur 18-24 jam. Biakan
Gram positif yang lebih tua (terutama bila sudah autolisis) dalam medium
asam, seringkali memberikan reaksi Gram positif atau Gram variabel
(campuran Gram positif dan Gram negatif). Hal tersebut diakibatkan
perubahan permeabilitas dinding sel pada biakan tua. Tetapi bakteri Gram
negatif tidak terpengaruh oleh umur atau medium yang digunakan. Jangan
dipersoalkan teramatinya beberapa sel Gram negatif dalam suatu preparat sel
Gram positif.

ALAT DAN BAHAN

1. Suspensi campuran bakteri E. coli dan S. aureus.
2. Suspensi campuran bakteri E. coli dan B. subfilis.
3. Zat warna karbol gentian violet, lugol (iodium : kalium iodium : air suling 1 :
2: 100) dan air fuksin.
4. Akohol 95 %
5. Kaca obyek; kapas dan kertas saring.
6. Alkohol 70% dan air suling dalam botol semprot.
7. Ose dan pembakar spirtus.
8. Bak pewarna.
9. Mikroskop majemuk dan minyak celup.
PROSEDUR KERJA
1. Sediakan kaca obyek yang bersih dan buat olesan dari masing-masing
campuran bakteri.
2. Letakkan kaca-kaca obyek di atas rak kawat di atas bak pewarna. Genangi
olsan bakteri dengan pewarna karbol gentian violet selama 1 menit, buangt zat
warna yang berlebih, lalu bilas dengan air suling.
3. Genangi olesan dengan lugol selama 2 menit, buang lugol yang berlebih lalu
bilas dengan air suling.
4. Cuci olesan dengan pemucat alkohol 95% tetes demi tetes selama 30 detik
atau sampai zat warna larut, lalu bilas dengan air suling.

5. Genangi olesan dengan pewarna tandlingan air fuksin selama 30 detik, buang
warna yang berlebih bilas dengan air suling lalu keringkan dengan kertas
saring.
6. Teleskan sedikit minyak emersi pada preparat, lal periksa di bawah
mikroskop. Mulailah dengan obyektif berkekuatan terendah 10X, Jalu ganti
dengan lensa
12
obyektif berkekuatan 100X. Amati dan gambarkan hasilnya.
Bakteri Gram positif akan benwarna ungu dan bakteri Gram negatif akan berwarna
merah.

13
HASIL PENGAMATAN

KEGIATAN 6
PEWARNAAN TAHAN ASAM
TUJUAN
Mengamati dua kelompok bakteri, yaitu bakteri tahan asam dan bakteri tak tahan
asam, dengan menggunakan prosedur pewarnaan tahan asam pewarnaan (ZiehlNeelsen). Memahami setiap langkah dan reaksi-reaksi kimia yang terjadi dalam
prosedur tersebut.
TEORI SINGKAT
Bakteri-bakteri dari genus dan spesies-spesies tertentu dari genus Nocardia
mengandung sejumlah besar lipid dan asam lemak pada dinding- dinding selnya. Hal
tersebut menyebabkan dinding sel relatif tidak permiabel terhadap zat-zat warna,
sehingga sel-sel bakteri tidak terwarnai oleh pewarnaan biasa. Beberapa spesies dari
kedua genus tersebut patogenik terhadap manusia, seperti M. tuberculosis (penyakit
TBC) dan M. leprae (penyakit lepra). Untuk menunjang diagnosis penyakit-penyakit
tersebut, bakteri-bakteri penyebabnya harus dapat diisolasi, mudah diamati dan
dibedakan dari jenis bakteri lainnya. Untuk tujuan tersebut, maka digunakan
pewarnaan khusus yang dapat menembus dinding sel.
Teknik pewarnaan khusus tersebut diberi nama pewarnaan lahan asam, yang
mula-mula dikembangkan oleh Paul Ehrlich pada tahun 1882. Prosedur pewarnaan
yang digunakan sekarang merupakan perbaikan dari teknik Ehrlich ini dikenal dengan
pewarnaan Ziehl Nielsen. Nama tersebut diambil dari nama dua peneliti yang
mengembangkan prosedur tersebut pada akhir 1800-an. Prosedur ini menggunakan
pewarna utama karbol fuksin dengan pemanasan dan biru metilen sebagai pewarna
tandingan. Pada modifikasi lain teknik ini perlakuan panas diganti dengan
penggunaan pembasah (suatu deterjen ntuk mengurangi tegangan permukaan
lemak) untuk menjamin penetrasi pewarna. Pewarna yang mengandung bahan
pembasah disebut pewarna Kinyoun.
Sekali sitoplasma terwarnai, maka sel-sel bakteri, seperti mikrobakteria
menahan zat warna tersebut dan tidak terpucatkan sekalipun oleh zat bersifat keras,
seperti asam alkohol. Asam alkohol merupakan pcmucat yang sangat intensif. Pada
pewarnaan ini, mikroorganisme yang dapat menahan zat warna utama dikatakan tahan
asam dan berwarna merah. Sedang pada bakteri biasa senyawa karbol fuksin mudah
dipucatkan oleh alkohol-asam dan menyerapan biru metilen sehingga sel berwarna
biru. Hal yang harus diperhatlkan dalam pewarnaan ini adalah jangan sampai preparat

mongering, bila dilakukan pemanasan. Dindng sel harus utuh untuk mencegah lipid
yana telah terwarnai meninggalkan sel untuk melarut ke dalam pemucat. Bila dinding
ini pecah maka lipid meninggalkan sel dan sifal tahan asamnya akan hilang.

14
ALAT DAN BAHAN
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.

Suspensi bakteri saprofit.

Zat warna karbol fuksin dan biru metilen.
Asam alkohol (3% HCL dalam alkohol 95%).
Kaca obyek, kapas dan kertas saring.
Alkohol 70% dan air suling dalam botol semprot.
Ose dan pembakar spirtus.
Bak pewarna.
Mikroskop majemuk dan minyak celup.

PROSEDUR KERJA
1. Sediakan kaca obyek yang bersih dan buat olesan dari suspensi bakteri,
Genangi olesan bakteri dengan pewama karbol fuksin selama 5 menit, sambil
dipanaskan di atas penangas air. Jaga jangan sampai terlalu panas, mendidih
atau kering.
2. Buang zat wama yang berlebih, lalu bilas dengan air suling.
3. Bilas dengan zat pemucat alkohol-asam selama 15 detik atau sampai latar
belakang olesan berwarna merah muda pucat.
4. Genangi olesan dengan pewarna tandingan biru metilen selama 2 menit, buang
zat warna yang berlebih, bilas dengan air suling, lalu keringkan dengan kertas
saring.
5. Teteskan sedikit minyak imersi pada preparat, lalu periksa di bawah
mikroskop. Mulailah dengan obyektif berkekuatan terendah 10X, lalu ganti
dengan lensa obyektif berkekuatan 100X. Amati dan gambarkan hasilnya.
Bakteri tahan asam (ZN + ) akan berwarna merah dan bakteri tidak tahan asam (ZN -)
akan berwarna biru.

15
HASIL PENGAMATAN

KEGIATAN 7
PEWARNAAN SPORA
TUJUAN
Mengamiati endospora bakteri dengan menggunakan prosedur pewarnaan spora
(pewarnaan Klein). Memahami setiap langkah dan reaksi-reaksi kimia yang terjadi
daam prosedur tersebut.
TEORI SINGKAT
Jenis-jenis bakteri tertentu, khususnya famili Bacillaceae, membentuk suatu
struktur di daam sel pada tempat-tempat khas, disebut endospora. Famili ini terdiri
dari 3 genus, yaitu Bacillus, Clostridium dan Sporosarcina. Endospora tersebut
dibentuk daam lingkungan yang tidak menguntungkan. Hal ini
disebabkan endospora dapat bertahan hidup daam kekurangan nutrien, tahan terhadap
panas dan unsur-unsur fisik lain seperti pembekuan, kekeringan, radiasi utraviolet
serta tahan bahan kimia yang dapat menghancurkan bakteri. Bilamana keadaan
lingkungan cukup baik, dinding endospora akan pecah dan membentuk sel vegetative
kembali.
Endospora merupakan bentuk kehidupan yang paling resisten sehingga
mikroorganisme yang bersangkutan dapat bertahan hidup dalam debu dan tanah
selama bertahun-tahun. Adanya endospora dalam debu menjelaskan mengapa
Bacillus merupakan kontaminan umum di laboratorium.
Ketahanan endospora disebabkan adanya selubung spora yng keras dan tebal.
Sifat tersebut menyebabkan diperlukan perlakuan yang keras untuk mewarnainya.
Hanya dengan perakuan panas yang cukup, pewarna yag sesuai dapat menembus
endospore. Tetapi sekali pewarna tersebut memasuki maka sukar dihilangkan.
Ukuran dan letak endospora di dalann sel merupakan ciri-ciri untuk
membedakan spesies-spesies bakteri pembentuk spora. Letak spora ada tiga macam,
yaitu sentral (di tengah sel), terminal (di pinggir sel) dan subterminal (antara sentral
dan terminal). Bentuk endospora umumnya bulat atau lonjong. Adanya spora dapat
mengubah bentuk sel bakteri, dimana endospora menonjol keluar seperti pemukul
tambul, misalnya pada Clostridium tetani. Bila endospora
terletak sentral atau sub terminal, dengan diameter yang lebih besar dari diameter
bakteri, maka bentuknya seperti kumparan.

ALAT DAN BAHAN

1. Biakan padat bakteri Bacillus subtilis berumur 72 jam.
2. NaCl fisiologis.
3. Zat warna karbol fiuksin dan biru metilen.
4. H2S04 1%
5. Kaca obyek, kapas dan kertas saring.
6. Alkohol 70 % dan air suling dalam botol semprot.
16
7. Ose dan penbakar spirtus.
8. Bak pewarna.
9. Mikroskop majemuk dan minyak celup.
PROSEDUR KERJA
1. Buat suspensi bakteri yang terdiri dari biakan bakteri dan NaCl fisiologis di
tabung reaksi. tambahkan korbol fuksin sebanyak 1:1 ke dalam suspensi
tersebut.
2. Panaskan campuran tersebu dalam pemanas air bersuhu 800C selama 10 menit.
Jaga jangan sampai mendidih atau kering.
3. Sediakan kaca obyek yang bersih dan buat olesan dari campuran tersebut.
4. Genangi olesan dengan H2S04 1% selama 2 detik, lalu cuci dengan air suling.
5. Genangi olesan dengan pewarna tandingan biru metilen selama 5 menit, buang
zat warna yang berlebih, bilas dengan air suling, lalu keringkan dengan kertas
saring.
6. Teteskan sedikit minyak imersi pada preparat, lalu periksa di bawah
mikroskop. Mulailah dengan obyektif berkekuatan terendah 10X, lalu ganti
dengan lensa obyektif berkekuatan 100X. Amati dan gambarkan hasilnya.
Endospora akan berwarna merah dan badan vegetative akan berwarna biru.

17
HASIL PENGAMATAN

KEGIATAN 8
PEWARNAAN NEGATIF
TUJUAN
Mengamati morfologi bakteri yang sukar diwarnai oleh pewarna-pewarna sederhana,
dengan menggunakan prosedur pewarnaan negatif. Memahami setiap langkah dan
reaksi-reaksi kimia yang terjadi dalam prosedur tersebut.
TEORI SINGKAT
Metode ini bukan untuk mewarnai bakteri, tetapi mewarnai latar belakang
menjadi hitam gelap). Melode pewarnaan negatif meliputi pencampuran
mikroorganisme dengan setetes tinta Cina, lalu disebarkan pada kaca obyek yang
bersih. Mikroorganisme akan terlihat transparan (tembus pandang) di medan tidak
dapat menembus yang gelap, karena pewarna-pewarna tersebut menembus
mikroorganisme. Metode ini berguna untuk bakteri-bakeeri tertentu, seperti spiroketa,
yang sukar diwarnai.
Pewarnaan negatif berguna untuk menentukan morfologi dan ukuran sel suatu
mikroorganisme. Pada pewarnaan ini, olesan dipanaskan maupun mendapatkan
perlakuan keras bahan-bahan kimia sehingga dapat menghindarkan terjadinya
penyusutan atau salah bentuk sel. Tetapi jika pewarna sudah mengering, sel-sel
tersebut dapat saja mengalami penyusutan atau salah bentuk.
Keberhasilan metode ini bergantung pada hal-hal berikut :
1. Kaca obyek harus betul-betul bersih (bila terdapat sisa-sisa lemak dan debu,
maka olesan mikroorganisme tidak akan rata).
2. Jumlah tinta Cina yang digunakan menentukan keberhasilan pewarnaan (tidak
boleh berlebih).
3. Campuran mikroorganismc dan pewarna harus diseret di atas kaca obyek
bukan sekedar didorong.
ALAT DAN BAHAN
1. Suspensi bakteri Klebsiela sp.
2. Tinta Cina.
3. Kaca obyek, kapas dan kertas saring.

4. Alkohol 70% dan air suling dalam botol semprot.

5. Ose dan pembakar spiritus.
6. Bak pewarna.
7. Mikroskop majemk dan minyak celup.
PROSEDUR KERJA
1. Sediakan 2 kaca obyek yang bersih. Lelakkan satu ose suspensi bakteri dan
18
satu tetes cina (1:1) di deka ujung kanan kaca obyek pertama.Campurkan
keduanya dengan menggunakan kaca (obvek kedua, sanpai homogen.
2. Letakkan kaca obyek kedua pada kaca obyek pertama dengan membentuk
sudut 450, Tarik kaca obyek kedua sepanjano kaca obyek pertama dengan
menyeretnya ke arah kiri.
3. Biarkan preparat tersebut mengering dengan sendirinya.
4. Teteskan sedikit minyak imersi pada preparat lalu periksa di bawah mikroskop
Mulailah dengan obyektif berkekuatan terendah 10X, lalu ganti dengan lensa
obyek tifbeckekuatan 100X. Amati dan gambarkan-hasilnya.
Sel bakteri akan tampak sebagai bagian yang kosong dengan latar belakang
yang gelap.

19
HASIL PENGAMATAN

KEGIATAN 9
PEWARNAAN KAPSUL
TUJUAN
Mengamati kapsul bakteri dengan menggunakan prosedur pewarnaan kapsul
(pewarnaan Burri-Gins). Memahami setiap langkah dan reaksi-reaksi kimia yang
terjadi dalam prosedur tersebut.
TEORI SINGKAT
Beberapa jenis bakteri dan algae hijau-biru mengeluarkan bahan-bahan yang
amat berlendir dan lengket pada permukaan selnya dan menyelubungi dinding sel.
Bila bahan berlendir tersebut kompak dan menampakkan bentuk yang pasti (bundar
atau lonjong) maka disebut kapsul. Tetapi bila bentuknya tidak teratur dan menempel
kuranng erat pada sel, maka disebut lapisan lendir.
Kapsul dan lendir tidak esensial bagi kehidupan sel, tetapi dapat berfungsi
sebagai makanan cadangan, perlindungan terhadap fagositosis (baik dalam tubuh
inang maupun di alam bebas) atau perlindungan terhadap dehidrasi. Kemampuan
menghasilkan kapsul merupakan sifal genetis, tetapi ukuran dan jumlahnya sangaat
dipengaruhi oleh komposisi medium tempat tumbuh sel-sel tersebut. Ukuran kapsul
berbeda-beda dalam setiap jenis bakteri maupun dalam galur-galur yang berbeda
dalam satu spesies. Pada bebeiapa jenis bakteri, keberadaan kapsul merupakan
petunjuk bahwa mikroorganisme tersebut bersifat virulen (misalnya Streptococcus
pneumoniae atau pneumokokus patogenik). Maka diagnosis pneumonia dan beberapa
penyakit lain dapat dipermudah oleh pewarnaan kapsul. Kapsul bakteri umumnya
larut dalam air.
Komposisi kimiawi kapsul berbeda-beda menurut jenis mikroorganismenya.
Ada yang berupa polimer glukosa (misalnya, dekstran pada leuconostoc
mesenleroides), polimer gula-annino (misalnva, asan hialuronat pada
stafilokokuspiogenik), polipeptida (misalnya, polimer asam D-glutamat pada Bacillus
anthracis) atau kompleks polisakarida-protein (misalnva, basillus
disentri).
Bakteri berlendr dapat mengganggu perindustrian, misalnya pada pembuatan
gula tebu. Belacoccus dextranicus dapat membentuk lendir yang sangat banyak
sehingga memampatkan mesin pembuat gula. Bacillus subtillis kadang-kadang
mengganggu pembuatan roti. dengan membentuk lendir yang liat yang kenyal.

Kapsul bakteri sangat sukar diamati deng0\an nikroskop cahaya biasa karena tidak
berwarna dan mempunyai indeks bias yang rendah. Kapsul bakteri bersifat non-ionik,
maka tidak dapat diwarnai dengan prosedur pewarnaan sederhana. Masalah utama
dalam pewarnaan kapsul adalah bila olesan bakteri tersebut difiksasi dengan panas
dengan mtlode biasa maka kapsul tersebut akan meluncur pada waktu pencucian.
Tetapi kebuluhan bakteriologis biasanya hanya memerlukan deteksi ada atau tidaknya
kapsul. Tuuuan ini dapat dicapai dengan
menggabungkan prosedur pewarnaan negattf dengan pewarnaan sederhana.
20
ALAT DAN BAHAN
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.

Suspensi bakteri Klebsiela sp.

Tinta Cina dan zat warna air fuksin
Kaca obyek, kapas dan kertas saring
Alkohol 70% dan air suling dalam botol seprot
Ose dan pembakar spirtus
Bak pewarna.
Mikroskop majemuk dan minyal celup/emersi

PROSEDUR KERJA
1. Sediakan 2 kaca obyek yang bersih. Letakkan satu ose suspensi bakteri dan
stu tetes Tinta Cina (1:1) pada dekat ujung kanan kaca obyek pertama.
Campurkan keduanya dengan menggunakan sudut kaca obyek kedua, sampai
hornogen.
2. Letakkan kaca obyek kedua pada kaca obyek pertama dcngan membentuk
sudut450. Tarik kaca obyek kedua sepanjang kaca Obyek pertama dongan
menyeretnya ke arah kiri.
3. Fikssi preparat tersebut dengan melalukannya sebanyak 3 kali di atas api.
4. Genangi dengan pewarna air fuksin selama 5 menit, buang zat warna yang
berlebih, lalu keringkan dengan kertas saring.
5. Teteskan sedikit minyak imersi pada preparat, lalu periksa di bawah
mikroskop.Mulailah dengan obyektif berkekuatan rendah 10X, lalu ganti
dengan lensa obyektif berkekuatan. 100X. Amati dan gambarkan hasilnya.
Sel bakteri akan berwarna merah dan kapsul tampak sebagai bagian yang
kosong di Sekitar tubuh bakteri.

21
HASIL PENGAMATAN

KEGIATAN 10
PEMBIAKAN BAKTERI
10.1. Pcnyimpanan Media
Tujuan
Mempelajari prosedur umum untuk merekonstitusi medium berbentuk bubuk dan
menaruhnya dalam jumlah yang dikehendaki ke dalam wadah-wadah yang sesuai.
Teori Singkat
Medium adalah bahan yang digunakan untuk menumbuhkah mikroorganisme
di atas atau di dalamnya. Persyaratan unluk membuat medium itu amat beragam,
diantaranya yang utama adalah air, karbon, energi, mineral dan faktor tumbuh. Air
merupakan komponen utama protoplasma (70-85% protoplasma terdiri dari air) serta
wahana bagi masuknya nutrien ke dalam sel dan keluarnya sekresi ataupun ekskresi
dari dalam sel. Selain itu air juga diperlukan untuk berlangsungnya reaksi-reaksi
enzimatik di dalam sel. Air yang digunakan adalah air suling. Air sadah tidak dapat
digunakan karena pada medium yang mengandung pepton dan ekstrak daging dapat
menyebabkan terbentuknya endapan fostal dan magnesium fosfat.
Berdasarkan pada sumber karbon yang digunakan, organisme dibagi menjadi
dua kelompok yaitu organisme autotrof (organisme yang dapat mensintesis semua
komponen selnya dari karbon diokside) dan organisme heterotrof (organisme yang
memerlukan satu atau lebih senyawa organik sebagai sumber karbonnya termasuk
karbondiokside).
Lebih jauh lagi, organisme dikelompokkan berdasarkan pada sumber
energinya
yaitu adalah fotoautotrof (autotroph fotosintetik) adalah aututrof yang dapat
memancarkan energi cahaya matahari dengan bantuan pigmen fotosintetiknya,
sedangkan yang memperoleh energi dari oksidas senyawa-senyawa anorganik
sederhana (seperti nitrit, nitrat atau sulfide) disebut kemoaufotrof (autotrof
kemosintetik). Kemoheterotrof (heterotrof kemosintetik) adalah heterotrof yang
memerlukan sumber energi organik seperti glukose atau asam-asam amino. Sebagian
besar bakteri termasuk kelompok ini. Fotogeterotrof (heterotroph fotosintetik)adalah

organisme yang dapat memanfaatkan energi cahaya matahari (mempunyai pigmen

fotosintetik) dan memerlukan sumber karbon organik seperti alkohol.
Sumber nitrogen bagi organisme autotrofk adalah senyawa anorganik,
sedangkan bagi heterotrof dapat berupa asam amno atau senyawa-senyawa protein
intermediat seperti peptde, protease, dan pepton. Misalnya, pada kaldu nutrien
(nutrient broth), nitrogen diperoleh dari ekstrak daging dan pepton. Faktor tumbuh
ialah komponen selular esensial (yaitu asam-asam amino atau vitamin) yang tidak
dapat disintesis sendiri oleh organisme dari sumber dasar karbon dan nitrogennya.
Bagi banyak heterotrop, factor tumbuh dipenuhi dari ekstrak daging ataukaldu
nutrient. Namun bagi pathogen-patogen yang lebih rewel (fastidious),untuk
penyediaan faktor
22
tumbuhnya memerlukan medium yang lebih rumit seperti agar darah.
Berdasarkan komposisi kimianya, dikenal medium sintetik yaitu medium yang
komposisi kimiawinya diketahui dengan pasti dan biasanya dibuat dari bahan-bahan
kimia yang kemurniannya tinggi dan ditentukan dengan tepat, sehingga medium ini
dapat diulangi pembuatannya, Medium nonspesifik atau kompleks adalah medium
yang komposisi kimiawinya tidak diketahui dengan pasti, misalnya ekstrak daging
dan pepton.
Kaldu nutrien disebut medium serbaguna karena merupakan medium yang
paling umum digunakan dalam bakteriologi. Sedangkan medium yang mengandung
zat-zat kimia tertentu yang dapat menghambat petumbuhan. satu kelompk bakteri atau
lebih tanpa menghambat pertumbuhan organisme yang diinginkan disebut medium
selektif. Selain itu dikenl pula medium diferensial yaitu medium yang mengandung
kimia tertentu yang memungkinkan si pengamat membedakan berbagai tipe bakteri.
Berdasarkan konsistensinya, medium dibagi menjadi medium cair seperti
kaldu
Nutrient atau kaldu glukosa. Medium ini dapat digunakan untuk pembiakan
organisme dalam jumlah besar, penelaahan fermentasi, dan berbagai macam uji.
Medium padat, biasanya digunakan untuk mengamati penampilan atau morfologi
koloni dan mengisolasi biakan murni. Untuk membuat medium pdat, dapat
ditambahkan agar-agar, gelatin atau gel silica ke dalam medium kaldu. Agar-agar
menjadi larut atau cair bila dipanaskan pada suhu hampir 100 0C dan tetap berbentuk
cair bila didinginkan sampai kurang lebih 430C. Hal ini berbeda dengan gelatin, sekali
menjadi padat tidk dapt dicairkan lgi. Oleh karena itu yang paling umum
digunakan ialah agar-agar namun tidak dianjurkan untuk mencairkan kembali medium
padat agat lebih dari dua kali karena dapat memberikan hasil yang kurang baik,
Sedangkan medium dengan konsistensi pertengahan disebut medium setengah padat,
medium ini dapat digunakan untuk menguji ada tidaknya motilitas dan kemampuan
fernentasi.
Alat dan Bahan

Gelas ukur 200-250 ml

gelas piala 250 ml

neraca berlengan tiga

kertas timbang
spatula atau sendok
batang pengaduk kaca atau pemusing magnetik
pembakar Bunsen kaki tiga dan kasa
kertas pH atau pH meter
thermometer
pipet10 ml atau gelas ukur 25 ml
tabung reaksi (9 buah)
cawan petri (8 buah)
kapas untuk sumbat
papan miring
keranjang/rak tabung
23

nutrient agar (NA; agar nutrien) Difco

larutan penyangga baku (standard buffer) pH 7,0 dan pH 4,0

Prosedur Kerja
1. Penyiapan dan penempatan Medium untuk Disterilkan
Bacalah dengan teliti petunjuknya pada wadah berisi medium nutrient agar
(NA). Hitunglah jumlah yang sesuai untuk volume yang dibutuhkan yaitu
dalam percobaan ini akan disiapkan 110 ml medium.
Ukurlah 110 ml air suling menggunakan gelas ukur kemudian tuangkan dalam
gelas piala.
Siapkan neraca berlengan tiga. Letakkan wadah yang akan dipakai untuk
menimbang pada pinggan neraca. Ambilah medium agar nutrien dengan
spatula atau sendok dan timbanglah seberat 25 gr.
Taruhlah medium tersebut ke atas air suling dalam gelas Piala.
Didihkan medium agar selama beberapa menit untuk melarutkannya. Medium
harus terus tenerus diaduk dengan batang pengaduk kaca atau dengan alat
pemusing magnetik untuk mencegah hangusnya atau meluapnya medium
Ingat, medium seperti medium kaldu tidak memerlukan pemanasan untuk
melarutkannya.
Pada penyiapan medium seperti agar nutrien biasanva tidak perlu dilakukan
penyesuaian pH. Tetapi bila memerlukan penyesuaian pH, dapat dilakukan
langkah-langkah berikut :
a. Ambillah 10 ml medium tersebut dan ukur pH nya dengan kerlas pH atau pH
meter.
b. Sesuaikan pH 10 ml medium dengan cara menambahkan 0,1N HCL atau
NaOH sesuai dengan keperluan.
c. Berdasarkan hasil yang diperoleh di atas, hitunglah jumlah asam atau basa
yang perlu ditambahkan pada sisa medium untuk mencapai pH yang

diinginkan.bila ternyata diperlukan 10 ml atau lebih 0,1N HCL asam atau

basa, gunakanlah asam atau basa dengan konsentrasi lebih tinggi.
d. Satukan kembali Imediunn tersebut ke dalam wadah semula. Ambilah lagi 10
ml medium untuk memeriksa kembali pH nya. Berdasarkan dari pH yang
dikehendaki.
Dengan menggunakan pipet, tempatkanlah medium tersebut ke dalam 9 bua
tabung reaksi, 8 tabung diisi masing-masing 12 ml (untuk agar cawan)
sedangkan 1 tabung diisi 4 ml (untuk agar miring). Medium untuk penyiapan
agar cawan dapat juga disterilkan dalam labu erlenmeyer. sedangkan
penempatan medium ke dalam tabung dapat menggunakan salah satu dari alat
berikut : buretpembagi, pipet otomatis, gelas ukur, pipet serologis atau corong.
Tabung tidak boleh diisi lebih dari setengahnya sedangkan labu tidak boleh
diisi lebih dari sepertiganya agar tidak meluap ketika disterilkan.
Sumbatlah tabung-tabung tersebut dengan kapas.
Sterilkan media tersebut dalam sterilisator uap pada 1210C selama 15 menit.
24
2. Penuangan Agar Cawan dan Pembuatan Agar Miring.
Setelah dikeluarkan dari steriisator, letakkan kedelapan tabung tersebut ke
dalam penangas air bersuhu 500C dan biarkan selama 5 menit.
Sambil menunggu, ambilah tabung yang berisi 4 ml medium, letakkan pada
papan miring, biarkan menjadi dingin dan padat.
Sementara itu ambilah tabung medium yang berisi 12 ml medium yang
suhunya telah terekuilibrasi, dan tuangkanlah satu per satu ke dalam cawan
petri steril secara aseptik. Usahakan agar seluruh permukaan cawan petri
tertutup oleh medium.
Biarkan medium tersebut menjadi dingin dan padat. Setelah itu pada
permukaan luar dasar cawan tuliskan dengan pinsil lilin atau spidol nama,
tanggal dan singkatan nama medium (dalan hal ini NA). Setiap 10 cawan lalu
ditumpuk dan dimasukkan dalam kantung plastik kertas dan disimpan dalam
lemari es sampai diperlukan.
Lakukan hal yang sama seperti no.4 untuk agar miring, tempatkan pada
keranjang tabung.
10.2. Sterilisasi Bahan dan Peralatan
Tujuan
Untuk memahami berbagai macam prosedur sterilisasi.
Teori Singkat
Yang dimaksud sterilisasi dalam mikrobiologi ialah suatu proses untuk
mematikan semua organisme yang terdapat pada atau di dalam suatu benda. Ada tiga
cara sterilisas yang umum dipakai yaitu :

1. Sterilisas menggunakan panas (yang umum digunakan di Laboratorium

Mikrobiologi) Bila panas digunakan bersama-sama dengan uap air disebut
sterilisasi panas lembab atau sterilisasi basah, bila tanpa kelembaban disebut
sterilisasi panas kering (sterilisasi kering).
2. Sterilisasi menggunakan bahan kimia dapat dilakukan dengan menggunakan
gas atau radiasi.
3. Sterilisasi dengan cara penyaringan (filtrasi)
Sterilisasi basah biasanya dilakukan di dalam autoklaf (presure cooker) atau
sterilisasi uap yang mudah diangkat (portable) dengan menggunakan uap air jenuh
bertekanan pada suhu 1210C selama 15 menit. Dapat pula dipakai kombinasi suhu dan
waktu lain yang memberikan hasil sama.
Sterilisasi basah dapat digunakan untuk mensterilkan bahan apa saja yang
dapat
ditembus uap air karena uap air berkondensasi pada bahan-bahan yang disterilkan,
dilepaskan panas sebanyak 686 kalori per gram uap air pada suhu 1210C dan panas ini
mendenatutasikan atau mengkoagulasikan protein pada organisme hidup maka dengan
demikian mematikannya,
25
Contoh: mensterilkan media biakan yang umum, air suling, peralatan laboratorium,
biakan yang akan dibuang, media tercemar, bahan-bahan dari karet dan mensterilkan
barang-barang di rumah sakit seperti ramuan susu, sprei, dan berbagai macam
peralatan. Namun beberapa macam media seperti kaldu-kaldu fermentasi tertentu,
gelatin nutrienr dan susu litmus harus menggunakan suhu yang lebih rendah dan
tekanan yang lebih rendah pula karena bahan-bahan semacam ini akan rusak bila
dipanaskan sampai 1210C,
Syarat-syarat melakukan sterilisasi uap:
1. Udara harus dikosongkan betul-betul dari ruang sterilisaior.
2. Semua bagian bahan yang disterilkan harus terkenai uap.
3. Bahan-bahan yang berpori atau yang berbentuk cair harus permiabel terhadap
uap.
4. Suhu sebagaimana yang teruku oleh termometer harus mencapai 1210C dan
dipertahankan setingi itu selama 15 menit.
Sterilisasi panas kering adalah sterilisasi yang dilakukan pada apa saja yang
tidak rusak, menyala, hangus, atau menguap pada suhu selama sekurang-kurangnya
10 menit. Contohnya mensterilkan alat-alat pecah belah (pipet, tabung reaksi, jarum
suntik dan bahan-bahan yang tidak tembus uap seperti gliserin, minyak, vaselin dan
bahan-bahan berupa bubuk. Bahan-bahan yang disterilkan harus dilindungi dengan
cara dibungkus, menyumbat dan menaruhnya dalam suatu wadah tertutup untuk
mencegah kontaminasi setelah dikeluakan dari oven. Pipet misalnya disterilkan dalam
bumbung pipet.
Bahan-bahan yang menjadi rusak bila disterilkan pada suhu tinggi, dapat
disterilkan pada suhu kamar secara kimiawi (menggunakan gas atau radiasi) misalnya
mensterilkanbahan-bahan dari plastic dan dengan menyaring misalnya larutan atau

suspensi (serum, larutan bikarbonat, enzim, toksin bakteri media sintetik terdentu dan
antibiotika). Sterilisasi kimiawi dilakukan pada suhu kamar selama 2 sampai 18 jam.
Beberapa baban kimia yang dapat digunaka untuk sterilisasi gas ialah etilen okside,
asam parasetat, formaldehide, dan glutaraldehide alkalin.
Sterilisasi dengan radiasi dapat diakukan dengan sinar gamma.
Alat dan Bahan

bahan dan peralatan yang akan disterilkan

sterilisator uap portable

Prosedur Kerja
1. Tuangkan air suling secukupnya ke dalam tubuh sterilisator (jumlah tertera
pada buku alat yang bersangkutan).
2. Tatalah labu atau tabung-tabung berisi media di dalam wadah aluminium
bagian dalam sedemikian sehingga tersedia ruangan untuk bergeraknya uap air
secara bebas diantara labu-labu atau tabung-tabung selama sterilisas,
kemudian
letakkan
dalam
sterilisator.
26
3. Letkkn tutup sterilisator pada tubuh sterilisator dengan cara
mempertemukan tanda-tanda panah penunjuk dan memasukkan tabung
pengeluaran gas ke dalam saluran pengarah pada dinding bagian dalam wadah
aluminium dan kencangkan murnya.
4. Buklah pengatur klep pengaman, kemudian pasanglah pemanasnya.
5. Bila uap air mulai keluar dengan keras (mendidih) tutuplah klep pengaman.
Maka tekanan di dalam sterilisator pun akan naik dan dapat dibaca pada alat
pengukur tekarnan.
6. Sterilkan media yang akan digunakaa dengan cara tekanan 1 atm selama 15-20
menit. Untuk media seperti susu litmus, kaldu fermentasi dan gelatin nutrien
diperlukan suhu lebih rendah 1000C-1150C pada tekanan 0,5-0.7 atm selama
15-20 menit.
7. Pada akhir proses matikanlah pemanasan, dan tungguah sampai tekanan
kembali nol.
8. Bila alat tolok tekanan telah menunjuk pada angka nol dan suhu telah turun
sampai jauh di bawah 1000C, bukalah pengatur klep pengaman dengan cara
meluruskanmra untuk mengeluarkan sisa uap yang tertinggal di dalam.
Kendurkan mur lepaskan baut-bautnya, pytar tutupnya dan angkatlah.
9. Bila anda selesai menggunakan alat sterilisator, buanglah sisa air didalamnya
dan keringkan semua bagiannya.
Perhatian : Pada waktu mencuci tutupnya, jagalah agar alat tekanan tidak
tercelup air. Jangan sekali-kali menuangkan air yang dingin sekali koe dalam
sterilisator yang masih panas.
10.3. Teknik Pemindahan Biakan Mikroba Secara Aseptik

Tujuan
Menguasai teknik pemindahan bakteri dari satu wadah ke wadah yang lain secara
aseptik.
Teori Singkat
Mikroorganisme luar yang tidak dikehendaki dapat masuk ke dalam biakan
murni melalui kontak langsung dengan permukaan atau tangan anda yang tercemar,
tersentuhnya media atau permukaan tabung bagian dalam oleh benda yang belum
disterilkan ataupun melalui aliran udara. Dengan teknik aseptik dapat mencegah
tercemarnya biakan murni sekaligus akan dapat pula melindungi anda dari infeksi diri
dan melindungi orang-orang di sekeliling anda dari pencemaran di laboratorium.
Biakan murni adalah biakan yang hanya terdiri dari satu spesies tunggal. Maka
dengan. melakukan teknik aseptik secara baik maka yang akan tumbuh dalam biakan
hasil pemindahan hanyalah organisme yang diinginkan (yang dipindahkan). dengan
perkataan lain tidak tercemar.
27
Alat dan Bahan

rak tabung
2 tabung reaksi kosong bersumbat
1 agar miring nutrient agar (NA)
3 tabung nutrient broth (NB)
biakan agar miring Serratia marcescens
lup inokulasi

Presedur Kerja
1. Siapkan lup inokulasi.
2. Peganglah kedua tabung nutrien broth (NB steril di tangan kiri anda) Tandaiah
tabung-tabung ini NB1 dan NB2.
3. Pijarkan lup Inokulasi di atas bunsen sampai seluruh kawatnya pijar.
Gerakkanah dengan ceaat lup tersebut ke arah bawah di atas api sehingga
sebagian dari tangkainya tersebut yang berbatasan dengan jarum ikut
terpanasi. Biasakanlah untuk mumulai memanaskan ujung lup di dalam
kerucut api sebelah dalam yang berwarna lebih biru (lebih dingin daripada
kerucut api sebelah luar yang berwarna lebih muda) selama 1-2 detik pertama
untuk mencegah terjadinya "percikan". Biarkan lup mendingin selama lebih
kurang 30 detik sebelum dipakai, untuk mencegah matinya bakteri yang akan
dipindahkan ataupun terjadinya percikan.

4. Angkatlah sumbat kedua tabung satu demi satu. Mulailah dengan Sumbat
tabung yang terdekat dengan tangan kanan Anda (dalam hal ini tabung 2)
dengan melingkarkan jari kelingking tanpa membasahi sumbat tabung.
5. Angkatlah sumbat tabung yang lain (tabung l) dengan cara serupa namun
Dengan jari manis.
6. Panaskan mulut kedua tabung yang tidak tersumbat tersebut dengan cara
melalukannya bolak balik dua kali di atas api. Jagalah agar sudut kemiringan
tabung tidak melebihi 450 bila tidak tersumbat.
7. Inokulasikan sejumlah kecil bakteri dari tabung 2 ke dalam tabung 1.
8. Panaskan kembali mulut kedua tabung tersebut seperti cara ke-6.
9. Kembalikan sumbat tabung satu persatu dimulai dengan tabung yang terdekat
dengan tangan kanan Anda (yaitu tabung 2).
10. Pijarkan kembali lup untuk mematikan sisa bakteri yang masih melekat
padanya.
11. Ulangi pemindahan aseptik ini untuk memindahkan sejumlah kecil bakteri S.
Marcescens (dari biakan agar miring yang disediakan) ke dalam tabung
berisikan kaldu nutrien steril. Tandailah tabung ini NB3.
12. Ulangi pemindahan aseptik untuk memindahkan sejumlah kecil bakteri S.
Marcescens ke dalam tabung berisikan agar miring NA steril. Cara
menglsolasikan agar miring, dimulai dengan meletakkan lup yang
mengandung biakan pada dasar kemiringan agar lalu ditarik ke atas dengran
gerakan zig-zag.
28
13. Kembalikanlah semua tabung dan lup inokulasi ke rak tabung.
14. Berilah etiket pada semua tabung Anda yang batru saja diinokulasikan (lihat
contoh) dan letakkanlah tabung-tabuag tersebut di tempat-tempat yang telah
disediakan untuk diinkubasikan pada suhu 300C selama 48 jam.
Contoh penulisan etiket :
300c

IVAN
6/5/96
Serratia marcescens
Aseptis
Kegiatan3
NA

15. Bila Anda melakukan teknik pemindahan tersebut dengan baik maka tabung
tabung akan tampak keruh sedangkan NBI dan NB2 harus tetap jernih, pada
agar miring NA akan tampak koloni berwarna merah dan seragam tidak
tercemar oleh koloni lain. Tunjukkanlah hasi anda pada asisten yang bertugas
untuk dinilai.
10.4. Isolasi Bakteri Dari Suatu Campran
Tujuan

Mempelajari cara-cara nengisolasi bakteri dari suatu campuran dengan teknik cawan
gores dan cawan tuang.
Teori Singkat
Di alam amat jarang dijumpai mikroba sebagai satu spesies tunggal umumnya
terdapat dalam populasi campuran. Sedangkan semua metode mikrobioogis yang
digunakan unuk nenelaah atau mengidentifikasi mikroorganisme, temasuk
penelaahan ciri-ciri kultural, morfologis, fisiologs, maupun serologis, memerlukan
suatu populasi yang terdiri dari satu macam mikroorganisme saja atau disebut biakan
murni (yaitu biakan yang sel-selnya berasal dari pembelahan salu sel tunggal).
Ada beberapa metode unluk memperoleh biakan murni dari suatu biakan
campuran. Metode yang paling umum digunakan adalah teknik cawan gores dan
cawan tuang. Kedua metode ini menggunakan prinsip yang sama yaitu mengencerkan
mikrooganisme sedemikian sehinga individu spesies dapat dipisahkan dari lainnya,
dengan anggapan bahwa setiap koloni terpisah yang tampak pada cawan petri setelah
inkubasi berasal dari satu sel tunggal.
Dalam kegiatan ini, Anda akan memisahkan tiga spesies bakteri yang
berlainan
dari suatu tabung berisi biakan campuran. Perbedaan utama antara ketiga spesies
tersebut ialah wama koloninya: Serratia marcescens, berwarna merah, Micrococcus
luteus berwarna kuning, dan Escherichia coli berwarna putih.
29
Metode Cawan Gores
Metode ini mempunyai dua keuntungan yaitu: menghemat bahan dan waktu.
Dua macam kesalahan yang umum dilakukan oleh mahasiswa yang baru
mempelajari mikrobiologi ialah: (1) tidak memanfaatkan permukaan medium dengan
sebaik-baiknya untuk digores sehingg pengenceran mikroorganisme menjadi kurang
lanjut, (2) cenderung untuk menggunakan inokulum terlalu banyak sehingga
menyulitkan pemisahan sel-sel yang digoreskan. Bila anda menggunakan teknik
menggores yang baik maka pada suatu arena tertentu pada permukaan medium yang
digores, sel-sel bakkeri akan terpisahkan satu dari yang lainnya. Se-sel tunggal yang
terpisahkan seperti ini disebut sel induk. Pada waktu inkubasi setiap sel induk berbagi
diri dengan membelah biner (reproduksi aseksual) dalam waktu 20-30 menit menjadi
dua sel anak, pada 20-30 menit berikutnya setiap sel anak membagi diri lagi sehingga
kini terdapat 4 sel anak. Sel-sel baru itu terus berbagi diri dalam eksponensial menjadi
bermilyar-milyar sel anak yang saling bertumpukan di atas dan disampingnya
membentuk satu koloni. Bila setelah masa inkubnsi koloni-koloni tersebut saling
terpisahkan cukup jauh sehingga tidak bersentuhan,maka diperoleh koloni murni. Satu
koloni murni terdiri dari bermilyar-milyar koloni anak, karena kebanyakan bakteri
setelah masa inkubasi selama 24 jam, satu koloni dapat terdiri dari 50-72 generasi sel
yang timbul dari satu se iduk tunggal. Dengan demikian dikatakan bahwa
pertumbuhan bakteri sesungguhnya merupakan pertumbuhan jumlah sel dan bukan

ukuran sel. Pada metode cawan gores ini, ada beberapa cara menggoreskan inokulum
pada permukaan medium agar, dalam kegiatan ini akan menggunakan
metode penggoresan kuadran.
Alat dan Bahan

1 suspensi Serratia marcescens, Escherichia coli, dan Micrococcus luteus.

2 cawan nutrienn agar (NA, agar nutrien)
lup inokulasi
jarum pindah
3 agar miring NA

Prosedur Kerja
1. Tuliskan nama anda, nomor kegiatan, dan tanggal pada tutup cawan petri
Anda.
2. Baliklah cawan petri Anda dan dengan menggunakan pinsil lilin atau spido,
bagilah seluruh area cawan menjadi empat yaitu sektor 0 (lebih kecil daripada
sector-sektor lainnya)adalah tempat anda mula-mula meletakkan inokulum
dengan lup inokulasi, sector I adalah tempat meletakan inokulum pengenceran
pertama, sektor II merupakan usaha pengenceren kedua. dan sektor III
merupakan usaha pengencean terakhir.
3. Goreskanlah biakan campuran yang disediakan pada cawan petri Anda sebagai
berikut :
Letakkan cawan petri Anda di meja dengan tutupnya terletak di sebelah atas
30
0
dan sektor 0 di sebelah kiri anda (ubah posisi ini 180 bila Anda kidal)
Kocoklah tabung berisi biakan campuran dengan gerakan ke samping (bakteri
cenderung mengendap di dasar tabung bila dibiarkan agak lama) sehingga
suspensi tampak rata). Jagalah agar sumbatnya tidak terbasahi.
Dengan menggunakan lup inokulasi, pindahkan secara aseptic satu lup penuh
biakan campuran bakteri pada sector 0 dan goreskanlah lup anda tanpa
ditekan bolak balik beberapakali di area permukaan agar. Lingkungan
pada ujung lup anda harus terletak datar dan horizontal mungkin terhadap
permukaan agar. Bila biakan campuran tersedia dalam media agar padat,
jagalah agar jumlah inoculum yang anda pindahkan tidak terlalu banyak
cukup menyentuh lup anda saja pada biakan yang akan digores.
Pijarkan lup anda dan biarkan mendingin. Suhu lup dapat diperiksa
dengan cara menyentuhkan pada bagian permukaan agar bagian tepi
yang belum diinokulasi. Bila
mendesis artinya lup tersebut masih
panas. Pemijaran lup mematiakn sel-sel yang tersisa padanya dan
dengan demikian membantu pengenceran jumlah sel.
Goreskan lup Anda ke sektor 0 disusul gerakan ke tpi luar sektor I, lalu
kembali ke sektor 0 dan seterusnya, bolak-balik sebanyak 2-3 kali. Kemudian

selesaikan penggoresan tersebut di sektor I tanpa menyentuh lagi sektor 0

sampai sektor I penuh terisi goresan yang tidak bertumpang tindih.
Putarlah cawan petri sehingga sektor I terletak di sebelah kiri Anda.
Ulangi langkah 3e untuk mengencerkan biakan dari sektor I ke sektor II.
Putarlah cawan petri Anda sehingga sektor II terletak di sebelah kiri Anda.
Ulangi langkah 3e untuk mengencerkan biakan dari sektor II ke sektor III.
Perhatian : jangan lupa memijarkan kembali lup Anda setiap kali Anda berpindah
sektor.
Lakukan penggoresan yang sama (langkah 3a-3i) dengan menggunakan biakan
campuran yang sama pada cawan petri kedua.
Letakkan cawan-cawan petri Anda dalam posisi terbalik daam keranjang
yang telah disediakan untuk diinkubasikan pada suhu 300C selama 48 jam.
Metode Cawan Tuang
Adalah cara untuk memperoleh koloni murni dari populasi koloni campuran
mikroorganisme dengan pengenceran specimen dalam medium agar yang telah
dicairkan dan didinginkan (500) yang kemudian dicawankan. Karena konsentrasi selsel mikroba di dalam spesimen pada umumnya tidak diketahui sebelumnya, maka
pengenceran perlu dilakukan beberapa tahap sehinggra sekurag-kurangnya satu di
antara cawan-cawan tersebut mengandung koloni-koloni terpisah di atas permukaan
ataupun di dalam agar.
Metode ini memboroskan bahan dan waktu tetapi tidak memerlukan ketrampilan
yang terlampau tinggi.

31
Alat dan Bahan

Suspense campuran Serratia mercescens, Escherichia coli, dan Micrococcus

luteus.
3 cawan petri steril
3 tabung nutrien agar yang suhunya telah diinkubasikan dalam penangas air
bersuhu 500C
Lup inokulasi

Prosedur Kerja
1. Tuliskan nama anda, kelompok praktikum, nomor kegiatan dan tanggsl pada
permukaan luar dasar cawan petri Anda.
2. Beri cawan-cawan petri tersebut nomor 1, 2 dan 3
3. Ambillah 3 tabung agar nutria dari penangas air, keringkan bagian luar dengan
kain penyeka, berilah nomor 1, 2 dan 3, lalu letakan dalam rak tabung.

4. Kocoklah tabung berisi suspensi biakan campuran dengan gerakan kesamping

sehingga kekeruhannya tampak rata. Hati-hati jangan sampai sumbatnya
terbasahi.
5. Pijarkan lup inokulasi dan dengan menggunakan teknik aseptik pindahkan dua
lup penuh suspensi biakan campuran ke dalam tabung NA no. l. Campurkan
inokulum tersebut sampai dengan cara metmutarkan tabung tersebut di antara
ke dua telapak tangan (jangan dikocok untuk menghindari timbulnya
gelembnng-gelembung udara).
6. Dengan cara yang sama pindahkan dua lup penuh biakan dari tabung no. I ke
dalam tabung no 2. Campurkan pula hingga rata seperti pada langkah 5.
7. Dengan cara yang sama pindahkan dua lup penuh biakan dari tabung no. 2 ke
dalam no. 3. Campurkan pula hingga rata seperti langkah 5.
8. Secata aseptik luangkan agar dari tabung yang bernomor I, 2, dan 3 masingmasing ke dalam cawan-cawan petri yang bernomo l, 2, dan 3. Biarkan agar
tersebut menjadi padat.
9. Letakkan cawan-cawan petri tersebut dalam posisi terbalik di dalam kerenjang
yang telah disediakan untuk diinkubasikan pada suhu 300C selama 48 jam.
10.5. Teknik Biakan Penyuburan
Tujuan
Mempelajari beberapa cara untuk menyediakan kondisi pembiakan yang
memungkinkan diisolasinya suatu spesies tertentu yang dikehendaki dari suatu
populasi campuran.

32
Teori Singkat
Untuk memperoleh spesies tertentu yang diminati dan jumlahnya amat sedikit, sangat
sulit jika hanya menggunakan teknik-teknik rutin seperti metode cawan gores atau
cawan tusng. Maka untuk itu dapat digunakan teknik penyuburan untuk memperbesar
kemungkinan terisolasinya organisme tersebut. Teknik ini pada hakekatnya suatu
lingkungan, yaitu komposisi medium atau kondisi fisik yang bersifat seleklif terhadap
spesies yang dikehendaki. Dalam kegiatan ini Anda akan mengisolasi dua jenis
bakteri yaitu bakteri koliform tinja dari air limbah dan khamir fermentatif dari sari
buah.
1. Koliform Tinja
Organisme ini sesungguhnya penghuni usus manusia dan hewan. Bakteri Escherechia
Coli biasanya digunakan sebaaia indikator pencemaran persediaan air oleh Tinja. Ada
dua macam medium yang sangat selektif untuk mengisolasi koliform tinja yaitu :
(1) lauryl tryptose broth (LTB), betsifat selektif karena menghambat pertumbuhan
bakteri Gram positif dan mendorong pertumbuhan bakteri Gram negatif yang dapat
menggunakkan lactose. (2) mediun agar eosin methylene blue (EMB), bersifat selektif

dan diferensial. Selektif terhadap orgenisme Gram negatif karena zat warna yang
terkandung di dalamnya melancarkan efek bakteriostatik terhadap bakteri Gram
positif. Dan diferensial karena dapat membedakan antara bakteri peragi laktose (yaitu
bakteri Gram negatif akan mengambil sebagian dari zat warna yang terkandung di
dalam sehingga koloninya akan tampak ungu atau gelap di bagian tengahnya dan
tidak berwarna dibagian tepinya) dan bakteri yang bukan peragi lactose.
Koloni bakteri dari genus Escherichia dan Enterobakter seringkali menampilkan
warna hijau logam sedangkan koloni organisme yang tidak dapat menfermentasi
laktose tampak tidak berwarna.
Alat dan Bahan

contoh air selokan

pipet 1 ml
tabung Durham berisi lauryl tryptose broth (LTB)
cawan agar eosin methylene blue (EMB)
lup inokulasi
kaca obyek dan kaca tutup
vaselin
seperangkat pewarna Gram
kertas serap
mikroskop majemuk, minyak celup dan kertas lensa

Prosedur Kerja
1. Inokulasikan 0,5 ml air selokan ke dalam tabung Durham berisi LTB.
Inkubasikan pada suhu 440C selama 24-48 jam.
2. Bila terlihat adanya pembentukan gas, kocoklah balak-balik biakan tersebut
dan secara aseptic goreskanlah satu lup penuh biakan pada cawan agar EMB
33
dengan menggunakan metode kuadran. Inkubasikan cawan tersebut dalam
posisi terbalik pada suhu 370C selama 48 jam.
3. Amatilah cawan Anda dan pilihlah sebuah koloni yang terpisah baik vang
menampakkan kilauan logam pada permukaannya, Lakukanlah pewarnaan
Gram terhadap olesan yang dibuat dari koloni tersebut.
Perhatian: lakukan langkah ini secara aseptik sehingga koloni tersebut tidak
tercemar.
4. Bila preparat Gram Anda menunjukkan organisme Gram negatif berbetuk
batang secara aseptik inokulasikan koloni yang sama pada cawan tadi ke
dalam tabung Durham berisi medium LTB. Inkubasikan pada suhu 44 0C
selama 24-48 jam.
5. Bila pada tabung tersebut terlihat adanva pembentukan gas, secara aseptic
goreskanlah satu lup penuh biakan tersebut pada cawan EMB. Inkubasikan
pada posisi terbalik pada suhu 440C selama 48 jam.

6. Serahkanlah pada asisten Anda. biakan murni dalaim cawan EMB dan
preparat Gram. Disamping itu tunjukkanlah pula preparat basah Anda di
bawah mikroskop agar dapat diperiksa dan dinilai oleh asisten Anda.
II. Khamir Fermentatif
Cendawan jenis ini paling banyak ditemukan pada buah-buahan dan hasil
fermentasinya yang bersifat asam.
Alat dan Bahan

nenas untuk diambil sarinya

tabung reaksi
paraffin
lup inokulasi
kaca obyek beserta kaca tutup
vaselin
Cawan agar dekstrose yang telah diasamkan dengan 0,15% asam tartarat
tabung Durham berisi nutrien broth (NB;kaldu nutrien) + 2% dekstrose
seperangkat pewarna gram
kertas serap
mikroskop majemuk minyak celup dan kertas lensa.

Prosedur kerja
1. Hancurkan nenas, ambil sarinya sebanyak 10 ml, masukkan ke dalam tabung
reaksi dan segel dengan parafin, lalu inkubasikan pada suhu kamar selama
beberapa hari.
2. Bila terlihat adanya pembentukan gas dalam tabung tersebut, ambillah sedikit
sampel dari dasar tbung untuk membuat lekapan basah dan amatilah ada
tidaknya sel-sel khamir di bawah mikroskop.
34
3. Bila teramati adanya sel-sel khamir pada siapan basah Anda, maka
goreskanlah satu lup penuh cairan sari buah tersebut (juga diambil dari dasar
tabung) dengan metode kuadran pada cawan agar dekstrose yang telah
diasamkan dengan asam tartarat. Inkubasikan cawan Anda dengatl posisi
terbalik pada suhu kamar selama 48 jam.
4. Amatilah cawan Anda. Koloni khamir akan tampak bundar dengan tepian licin
dan permukaan seperti berlendir. Pilihlah dua koloni semacam itu yang
terpisah baik dan masing-masing inokulasikan pada tabung Durham berisi
kaldu nutrien + 2% Dekstrose. Inkubasikan pada suhu kamar selama 48 jam.
5. Amati tabung Durham Anda. Bila Anda melihat pembentukan gas, buatlah lagi
siapan basah dan amati apakah Anda memiliki sel-sel yang tampak seragam.
Bila demikian maka goreslah lagi satu cawan berisi medium baru yang
menunjukkan bahwa koloni-koloni khamir Anda memang hanya terdiri dari

satu macam (gunakan inokulum dari salah satu tabung Durham, pilih yang
terbaik).
6. Serahkan pada asisten Anda. biakan murni dalam agar cawan, biakan dalam
tabung Durham dan preparat Gram. Disamping itu tunjukkanlah pula preparat
basah Anda di bawah mikroskop agar dapat diperiksa dan dinilai oleh asisten
Anda.

35
HASIL PENGAMATAN

Kegiatan 11
Kuantitasi Mikroba : Hitungan Cawan
Tujuan
Melatih Anda melakukan pengenceran serial dan menentukan konsentrasi suspensi
bakteri dengan metode hitungan cawan.
Teori Singkat
Dasar metode hitungan cawan dengan anggapan bahwa setiap sel yang dapat
hidup akan berkembang menjadi satu koloni. Jadi jumlah koloni yang muncul pada
cawan merupakan suatu indeks bagi jumlah organisme yang dapat hidup yang
terkandung daam sampel. Cawan yang dipilih untuk penghitungan koloni adalah

yang mengandung antara 30-300 koloni. Untuk memperoleh sekurng-kurangnya satu

cawan yang mengandung koloni dalam jumlah yang memenuhi syarat maka harus
dilakukan sederetan pengenceran dan pencawanan. Organisme yang terdapat daam
sampel asal ditentukan dengan mengalikan jumlah koloni yang terbentuk dengan
faktor pengenceran pada cawan yang bersangkutan.
Dalam kegiatan ini Anda akan mencoba dua macam prosedur hitungan cawan
yaitu :
1. metode penyebaran
2. metode penuangan
Alat dan Bahan

biakan Escherichia coli dalam nutrien broth (NB,kaldu nutrien)

botol blanko pengencer @ 99 ml
botol blanko pengencer @ 90 ml
pipet 1ml yang steril
pipet 0,1 ml yang steril
batang kaca penyebar
alkohol 95% daam gelas piala
cawan nutrient agar (NA, agar nutrient)
tabung masing-masing berisi 12 ml NA cair bersuhu 500C
cawan petri kosong steril
alat penghitung koloni Quebec
penghitung mekanis

Prosedur Kerja
Metode Penyebaran
1. Siapkanlah pengenceran serial :
Siapkan keempat botol berisis blanko pengencer dan susunlah berderet (botol
36
pertama,kedua, dan keempat masing-masing berisi 99 ml larutan pengencer,
sedangkan botol ketiga berisi 90 ml larutan pengencer). Tuliskan pada
dinding-dinding botol tersebut sesuai dengan urutannya, 1:100, 1:10.000,
1:100.000, 1:1.000.000
Catatan : blanko pengencer ialah tabung atau botol berisi sejumlah tertentu
cairan pengencer steril (biasanya larutan garam fisiologis) dengan
sumbat ulir atau sumbat karet yang rapat. Tabung biasanya berisi 9 atau 9,9 ml
sedangkan botol berisi 90 atau 99 ml.
Kocoklah suspensi bakteri E. coli baik-baik sampai kekeruhannya rata. Lalu
secara aseptik pipetlah 1 ml sampel dan masukkan ke dalam blanko pengencer
1:100. Letakkan pipet dalam wadah berisi disinfektan. Dengan siku tangan
anda di atas meja, kocoklah tabung tersebut 25 kali, setiap kalinya melintasi
jarak kurang lebih 30 cm, sehingga bakteri tersebar rata di dalam larutan

2.
3.

4.

5.

6.

7.

pengencer. Setiap kali sebelum pengocokan periksalah terlebih dahulu apakah

sumbat telah terpasang rapat.
Secara aseptik pipetlah 1ml sampel dari botol pengencer 1:100 dan masukkan
ke dalam blanko pengencer 1:10.000. Letakkan pipet dalam wadah yang
disediakan dan kocoklah tabung pengenceran ini seperti di atas.
Secara aseptik pipetlah 10 ml sampel dari tabung pengencer 1:10.000 dan ke
dalam blanko pengencer 1:100.000. Letakkan pipet dalam wadah yang
disediakan dan kocoklah tabung pengencer ini seperti di atas.
Secara ascptik pipetlah 1 ml sampel dari tabung pengencer 1:10.000 dan
masukkan ke dalam blanko pengencer 1:1.000.000. Letakkn pipet dalam
wadah yang disediakan dan kocoklah tabung pcngencer ini seperti diatas.
Pada masing-masing permukaan luar dasar keempat cawan petri berisikan agar
itu tuliskanlah l:200.000, 1:1.000.000, 1:2.000.000 dan 1:10.000.000.
Secara aseptik, lakukanlah pemindahan sampel dari botol pengencer l:1.
000.000 ke dalam cawan-cawan agar nutrien sebagai berikut :
Dengan pipet 1 ml yang steril pindahkanlah 0,5 ml sampel ke dalam cawan
berfuliskan 1:2.000.000.
Dengan pipet 1 ml yang steril, pindahkanlah 0,1 ml sampel ke dalam cawan
Letakkan pipet dalam wadah yang disediakan.
Sterilkan batang kaca penyebar dengran cara mencelupkannya ke dalam gelas
piala berisi alkohol 95%, lalu bakarlah di atas api. Setelah alkohol yang
menempel padanya terbakar habis, gunakanlah batang kaca penyebar itu untuk
menyebarkan cairan pada cawan petri dengan pengenceran tertinggi, yaitu
1:10.000.000.
Perhatian : jagalah agar tetesan alkohol menyala tidak jatuh ke dalam gelas
piala Anda, tetapi bila sampai alkohol dalam gelas piala Anda terbakar
karenanya, janganlah panik dan segeralah beritahukan pada asisten yang
bertugas.
Ulangi langkah 4 untuk cawan petri bertuliskan 1:2.000.000 Catatan: langkah
ini dapat dilakukan tanpa perlu mensterilkan kembali batang kaca penyebar
karena penyebaran dilakukan pada sampel dari botol pengenceran yang sama
37
dan mula-mula dilakukan pada cawan yang menerima sampel dalam jumlah
lebih kecil.
Secara aseptik, lakukanlah pemindahan sampel dari botol pengencer 1:100.000
ke dalam cewan-cawan agar nutrien sebagai berikut :
Dengan pipet 1 ml yang steril pindahkanlah 0,5 ml sampel ke dalam cawan
bertuliskan 1:200.000.
Dengan pipet 0,1 ml yang steril pindahkanlah 0,1 ml sampel ke dalam cawan
bertuliskan 1:1.000.000. Letakkan pipet dalam wadah yang disediakan.
Sebarkan inokulum pada kedua cawan petri dengan mengikuti cara pada
langkah 4 dan 5, mua-mula sebarkan sampel pada cawan 1:1.000.000 diikuti
dengan penyebaransampel pada cawan 1:200.000.
Perhatian : sampel sejumlah 0,1 ml biasanya segeta tersearap oleh
mediumsetelah disebarkan, namun tidak demikian halnya dengan sampel

sejumlah 0,5 ml. Bila Anda menyebarkan 0,5 ml sampel, sampai sampel
tersebut terserap seluruhnya oleh medium sebelum Anda membalikkan cawan
petri Anda. Kalau tidak maka sebagian dari sampel tersebut akan mengalir ke
tutup cawan dan dengan demikian menggagalkan pekerjaan Anda.
8. Jangan lupa bubuhkan nama anda, nomor kegiatan dan tnggal pada cawancawan petri anda seperti biasa. Letakan cawan-cawan petri tersebut dengan
posisi terbalik dalam keranjang yang telah disediakan untuk diinkubasikan
pada suhu 370C selama 24 jam
Metode Penuangan
1. Lakukan langkah 1.1.
2. Lakukan langkah 1.2 pada keempat cawan petri steril yang masih kosong.
3. Lakukanlah langkah 1.3 pada cawan-cawan petri yang dimaksudkan namun
belum diisi medium.
4. Ambillah 2 tabung berisi medium agar nutrien cair dari penangas air bersuhu
500C. Sekalah bagian luar tabung supaya kering. Secara aseptik tuangkan
medium tersebut satu per satu ke dalam kedua cawan petri tersebut di atas.
Putar-putarkan cawan-cawan petri tersebut satu demi satu di atas meja Anda
perlahan-lahan sebanyak 20 kali sehingga inokulum tercampur rata dengan
medium tetapi tidak sampai keluar dari cawan.
5. Lakukan langkah 1.6 pada cawan-cawan petri yang dimaksudkan namun
belum diisi medium.
6. Lakukanlah langkah 11.4. Segera setelah selesai menuang, isilah tabung Yang
kini kosong itu dengan air kran dan letakkan di tempat cuci.
7. Biarkan agar dalam cawan-cawan petri itu menjadi padat. Setelah itu letakkan
dalam posisi terbalik dalam keranjang yang telah disediakan untuk
diinkubasikan pada suhu 370C selama 24 jam.

38
Kegiatan 12
Ciri-Ciri Fisiologis Bakteri
Tujuan
Mengamati secara langsung atau tidak langsung produk. kegiatan enzimatik bakteri.
Teori Singkat
Secara morfologis, biakan maupun sel bakteri yang berbeda dapat tampak
serupa. Karena itu ciri fisiologis atau biokimiawi merupakan kriteria yang amat
penting di dalam idntifikasi spesimen yang tak dikenal. Dalam kegiatan ini akan
dilakukan 13 macam uji fisiologi yang mana 6 diantaranya: yaitu fermantasi gula
dalam tabung Durham, fermentasi asam campuran (uji merah metil), fermentasi-

butandiol (uii Voges Proskauer), merupakan reaksi produksi katalase reduksi nitrat
dan uji oksidase merupakan reaksi biooksidasi (reaksi-reaksi enzimatik yang
berkaitan dengan respirasi dan fermentasi). Tiga uji berikutnya yaitu hidrolisis
triptofan (uji indol), hidrolisis urea dan hidrolisis pati merupakan reaksi hidrolisis
yang disebabkan oleh ekstraselular. Sedangkan uji-uji lainnya merupakan uji yang
secara rutin juga seringkali diperlukan untuk membantun usaha identifikasi.
Bila nanti Anda menggunakan uji-uji ini untuk mengidentifikasi spesimen tak
dikenal, maka Anda tidak perlu menggunakun semua uji setiap kali Anda
mengidentifikasi suatu organisme melainkan Anda harus dapat memilih uji mana
yang perlu digunakan.
PERIODE I
Alat dan Bahan

biakan dalam trypticase soy broth (TSB) berumur 24 jam:

Escherichia coli, Enterobacter aerogenes, pseudomonas aeruginosa, Proteus
vulgaris, Bacillus subtilis, bacillus cereus, streptococcus mitis, streptococcus
pyogenes, streptococcus faecalis.
biakan dalam agar miring trypticase soy agar (TSA); Staphylococcus aureus.
tabung Durham berisi kaldu glucose dengan indikator merah fenol.
tabung medium MR-VP (Methyl Red-Voges Proskauer)
tabung agar miring sitrat Siminons
tabung kaldu tripton
tabung kaldu nitrat
cawan TSA
cawan agar pati
cawan agar darah
plasma kelinci
hidrogen perokside
39
kertas plumbum asetat
tabung kaldu urea

Prosedur Kerja
1. Pada semua tabung dan cawan yang akan diinokulasi bubuhkan nama Anda,
nomor kegiatan, tanggal, serta nama organisme yang digunakan sebagai
inokulum.
2. Inokulasikan berbagai macam organisme pada media yang telah ditentukan
seperti terdaftar di bawah ini dengan memperhatikan beberapa catatan penting
yang disertakan di bawahnya :
E. coli
: kaldu glukose dalam tabung Durham
: medium MR-VP

: agar miring sitrat Simmons

: kaldu tripton
: kaldu nitarat
E. aerogenes : medium MR-VP
: agar miring sitrat Simmons
: kaldu tripton
P. aeruginosa : cawan TSA
P. vulgaris
: TSB
: kaldu urea
B. substilis
: cawan agar pati
B. cereus
: kaldu nitrat
S. mitis
: cawan agar darah
S. pyogenes : cawan agar darah
S. faecalis
: cawan awar darah
Catatan :
a. Media kaldu cukup diinokulasi dengan satu lup penuh inokulum.
b. Pada tabung TSB yang diinokulasi dengan P. vulgaris setelah selesai inokulasi
sisipkanlah secarik kertas plumbum asetat diantara sumbat dengan mulut
tabung sedemikian sehingga setelah sumbat dipasang kembali maka beberapa
millimeter kertas tersebut terlihat menggantung dibawah sumbat di dalam
tabung.
c. Inokulasi pada agar miring sitrat Simmons dilakukan dengan jarum inokulasi.
(bukan lup). MuIa-mula buatlah goresan ig-zag seperti biasa, lalu tusukkan
jarum Anda pada bagian medium yang tebal pada dasar tabung.
d. Inokulasi pada cawan agar pati dilakukan dengan menggoreskan satu lup
penuh biakan yang dimaksud satu kali saja membentuk satu garis di tengahtengah cawan dimulai dari kiri ke kanan.
e. Inokulasi pada cawan agar darah dilakukan dengan metode penggoresan
kuadran.
f. Letakkan tabung-tabung dan cawan-cawan pada tempat yang disediakan untuk
diinkubasikan
pada
370C
selama
24-48
jam.
40
3. Uji koagulase
a. Gunakan biakan S. aureus dalam agar miring TSA.
b. Letakkan setetes air pada kaca obyek yang bersih. Secara aseptik
pindahkanlah dengan lup inokulasi sedikit biakan bakteri ke atasnya dan aduk
sampai diperoleh suspensi yang rata.
c. Secara aseptik pindahkanlah 2 lup penuh plasma kelinci ke atas suspensi
bakteri (jangan lupa memijarkan lup Anda diantara perpindahan). Campurkan
baik-baik.
d. Bila organisme tetsebut koagulase positif , maka dalam waktu 5-15 detik akan
terlihat gumpalan-gumpalan fibrin. Catatla hasil pengamatan Anda pada tabel
hasil pengamatan.
e. Letakkan kaca obyek tersebut dalam wadah yang telah diberi disinfektan.

4. Uji katalase
a. Gunakan biakan S. aureus dalam agar TSA.
b. Letakkan dua tetes hidrogen perokside 3% pada kaca obyek yang bersih.
Secara aseptik pindahkanlah dengan lup inokulasi sedikit biakan S. aureus ke
atasnya dan campurkan baik-baik.
c. Uji positif ditandai dengan terbentuknya gelembung-gelembung oksigen yang
menunjukkan bahwa organisme yang bersangkutan menghasilkan enzim
katalase yang mengubah Hidrogen Perokside menjadi air dan oksigen.
Cata(lah hasil pengamatan Anda pada tabcl hasil pengamatan
d. Letakkan kaca obyek dalan wadah yang telah diberi desinfektan
keterangan :
Kebanyakan bakteri aerobik dan anaerobik fakultatif yang menggunakan oksigen
menghasilkan Hidrogen Perokside yang sesungguhnya bersifat racun bagi sistemsistem enzimnya sendiri. Namun mereka dapat tetap hidup dengan adanya anti
metabolit tersebut karena dihasilkannya enzim katalase yang dapat mengubah
Hidrogen Perokside menjadi air dan oksigen
katalase
2H2O2

2H2O + O2

Matinya bakteri-bakteri anaerobik obligat bila ada oksigen disebabkan karena tidak
adanya pembentukan enzim katalase sehingga H2O2 meracuni bakteri itu sendiri. Ada
tidaknya pembentukan enzim katalase dapat membantu pembedaan kelompokkelompok bakteri tertentu.
PERIODE II
Alat dan Bahan

tabung reaksi berukuran 13 x 100 mm

indikator merah metil
41

reagen Barritt (larutan A dan B)

reagen uji nitrit (larutan A dan B)
debu seng (Zn)
tusuk gigi
reagen uji oksidase
reagen Kovac
iodium Gram

Prosedur Kerja
1.
Uji fermentasi karbohidrat

Amalilah biakan dalam tabung durham berisi kaldu glukose dengan indicator
merah fenol. Bila Warna medium berubah menjadi kuning, artinya bakteri
tersebut membentuk asam dari fermentasi glukose. Bila pada tabung kecil
yang diletakkan terbalik di dalam tabung media itu terdapat gelembung,
artinya dari fermentasi tersebut terbentuk pula gas. Catatlah hasil pengamatan
Anda dalam table hasil pengamatan.
Keterangan : merah fenol adalah indicator pH di atas 7, indicator ini berwarna
merah dan pada pH diatas 7 berwarna kuning.
2.
Uji MR (methyl red, merah metil)
Ambilah 2 tabung bersih berukuran 13 x 100 mm
Ambillah kedua biakan MR-VP Anda. Tuanglah kedua biakan tersebut
masing-masing setengahnya ke dalam tabung-tabung bersih itu. Jangan lupa
memberi tanda pada tabung. Agar tabung Anda tidak tertukar. Simpanlah
sisanya untuk uji berikutnya (uji VP).
Pada salah satu tabung MR-VP dari setiap organisme tambahkan 3-4 tetes
indikator merah metil. Bila warna medium berubah menjadi merah, artinya
terbentuk asam. Catatlah hasil pengamatan Anda dalam tabel hasil
pengamatan.
Keterangan :
Sejumlah besar bakteri gram negatif penghuni usus dapat dikenali berdasarkan
produk akhir yang dihasilkannya bila memfermentasi (meragi) glukose di dalam
medium MR-VP. Genera bakteri seperti Escherichia, Salmonella, Proteus dan
Aeromonas memfermentasi glukose dan menghasilkan banyak sekali- asam laktat,
asetat, suksinat, dan format disamping C0 2, H2 dan etanol. Akumulasi asam-asam
ini menurunkan pH sampai 0,5 atau kurang, bila indicator merah metil
ditambahkan pada biakan tersebut dengan pH serendah itu maka indikator tersebut
menjadi merah. Hal ini menandakan bahwa organisme yang bersangkutan adalah
peragi asam campuran (mixed acid fermenter). Pada umumnya organismeorganisme ini adalah juga penghasil gas yang istimewa karena rmenghasilkan
enzin format hidrogenliase yang memecahkan asam format menjadi CO2 dan H2O
dalam jumlah sebanding.
HCOOH
CO2 + H2
Karena enzim inilah, maka pada umumnya asam format di dalam medium terdapat
dalam jumlah yang sedikit.
42
3.

Uji VP (Voges-Proskauer)
Pada sisa biakan dalam medium MR-VP masing-masing organisme tambahkan
reagen Barritt yaitu 10 tetes larutan A dan 10 tetes larutan B. Kocoklah
tabung-tabung tersebut keras-keras selama 20-30 detik, Bila terlihat merah
muda artinya terjadi pembentukan 2,3-butandiol atau reaksi Voges-Proskauer
positif. Kadang-kadang diperlukan waktu 2 jam untuk memperoleh dari hasik
uji ini. Catatlah hasil pengamatan Anda dalam tabel Hasil Pengamatan.
Keterangan :

Bila pengujian merah metil menunjukkan hasil maka mungkin sekali organisme
yang Anda uji itu tidak menghasilkan asam melainkan 2,3-butandiol dan Etanol.
Bakteri yang melakukan hal semacam itu meliputi semua spesies Enterobacter,
Serraria, dan beberapa spesies Erwinia, Bacillus dan Aeromonas.
Sesungguhnya tidak ada uji yang dapat secara langsung mendeteksi adanya 2,3butandiol di dalam biakan. Namun reagen Barritt dapat dengan mudah mendeteksi
adanya asetoin (asetil-metil dan karbinol), yaitu prekusor 2,3-butandiol. Reagen
ini terdiri dari -naftol dan KOH. Bila reagen ini ditambahkan pada biakan MRVP berumur 48 jam dan setelah dibiarkan beberapa waktu lamanya terlihat
perubahan warna medium menjadi merah muda atau merah, maka artinya dalam
biakan tersebut terdapat asetoin. Karena asetoin dan 2,3-butandiol hampir selalu
terdapat bersama-sama maka uji ini dianggap sah. Metode tak langsung yang
menguji ada tidaknya 2,3-butandiol ini disebut uji Voges-Proskauer.
4.

Uji nitrit
a. Ambillah tabung-tabung biakan Anda dalam kaldu nitrat
b. Tambahkan ke dalamnya masing-masing 2-3 tetes larutan A (asam sulfanilat)
dan 2-3 tetes larutan B (dimetil--naftilamin).
Perhatian : dimetil-a-naftilamin jangan sampai mengenai kulit Anda karena
bersifat karsinogenik
c. Bila dalam biakan yang diuji trdapat nitrit maka segara terbentuk warna
merah; artinya uji ini positif
d. Bila tidak terlihat perubahan warna, dengan menggunakan tusuk gigi
tambahkanlah sedikit debu seng ke dalam tabung biakan. Bila terbentuk warna
merah artinya uji tersebut negatif, sedangkan bila tidak terjadi perubahan
wanna artinya uji tersebut positif.
Keterangan :
Banyak bakteri anaerobik fakultatif dapat mengunakan nitrit. Reaksi
enzitnatik ini dikendalikan oleh suatu enzim indusibel yang disebut Nitrase.
nitrase
NO3- + 2e- + 2H
NO2- + H2O
Karena adanya oksigen menghambat terjadinya reduksi nitrat, organisme yang
tumbuh aktif akan menghabiskan oksigen yang tersedia lebih dahulu, baru kemudian
menggunakan nitrat. Karena itu seringkali digunakan metode anaerobik untuk
menumbuhkan biakan guna keperluan uji ini.
Kadang-kadang nitrit yang terbentuk di dalam biakan mengalami reduksi lebih
43
lanjut menjadi gas N2. Dalam hal ini maka penambahan reagen ke dalam biakan tidak
menimbulkan perubahan warna. Karena itu uji yang tampak negatif dapat berarti
betul-betul negatif (tidak terjadi pembentukan nitrit), tetapi dapat pula merupakan uji
yang sesungguhnya positif namun nitrit yang terbentuk sudah mengalami reduksi
lebih lanjut.
Hal ini dapat diperiksa dengan menambahkan debu seng. Bila terbentuk warna
merah artinya uji teisebut betul-betul negatif karena seng bereaksi dengan nitrat yang
tidak tereduksi, bila tetap tidak terjadi perubahan warna maka uji tersebut adalah

positif nitrat telah tereduksi secara lanjut dan tidak tersedia lagi untuk bereaksi dengan
seng.
5.

Uji oksidase
a. Ambilah biakan P. Aeruginosa dalam cawan TSA Anda
b. Genangi beberapa koloni bakteri dalam cawan tersebut dengan reagen uji
oksidase (larutan dimetil-p-fenildiamin hidrokloride 1%).
c. Uji positif ditandai dengan berubahnya koloni meniadi merah muda, lalu
merah tua, merah gelap dan akhirnya hitam.
Keterangan:
Kemampuan suatu oragnisme menghasilkan oksidase sangat membantu usaha
identifikasi organisme-oraanisme yang tergolong ke dalam kelompok tersebut.
Semua spesies Neisseria dan sebagian besar spesies Pseudomonas adalah
penghasil oksidase.
Prosedur rutin yang digunakan untuk mengidentifikasi N. Gonorrhoeae (penyebab
penyakit gonorea) dan N. Meningitidis (penyebab radang selaput Otak) seringkali
memanfaatkan oksidase ini.
Reagen yang digunakan dalam uji ini berumur pendek dan karenanya paling baik
bila disiapkan pada hari akan dipergunakan. Namun bila disimpan dalam lemari
es, reagen tersebut bertahan sampai satu minggu.

6.

Uji indol
a. Ambiilah biakan-biakan anda TSB.
b. Tamhahkan dalamnya masing-masing 10-20 tetes reagen Kovac. Bila dalam
biakan tersebut terdapat indol, maka dibagian atas biakan akan segera
terbentuk lapisan berwarna merah. Catatlah hasil pengamatan Anda dalam
tabel hasil pengamatan.
Keterangan :
Bakteri tertentu seperti E. Coli dapat menghidrolisis asam amino triptofan menjadi
indol dan asam piruvat melalui kerja enzim triptofanase. Adanya indol dapat
diketahui dengan menggunakan reagen Kovac; uji positif ditunjukan pula oleh
terbentuknya lapisan berwarna merah di atas biakan. Untuk uji ini biasanya
dipakai kaldu pepton yang berasal dari kasein yang mengalami perombakan
pankreatik.

7.

uji Hidrolisis Urea

Amatilah tabung biakan kaldu urea anda. Uji poditif ditunjukan oleh
terbentuknya warna merah keunguan setelah inkubasi, catatlah hasil pengamatan anda
44
pada table hasil pengamatan.
Keterangan :
Didalam identifikasi bakteri-bakteri patogen penghuni usus dapat dibedakannya
kelompok proteus dari patogen gram negatif lainnya merupakan suatu hal yang amat
penting. Salah satu ciri khas Proteus ialah kemampuannya menghasilkan enzim
urease yang dapat melepaskan amoniak dari molekul urea. Ciri ini tidak dimiliki oleh

bakteri lain yang mungkin dikelirukan dengan Proteus. Kaldu urea merupakan larutan
ekstraks khamir dan urea yang diberi larutan penyangga (buffer). Medium tersebut
juga mengandung merah fenol sebagai indikator pH. Karena urea bersifat tidak stabil
dan mengalami peruraian di dalam autoklaf pada tekanan uap atmosfer maka
seringkali medium ini disterilkan dengan cara filtrasi. Medium ini ditaruh dalam
jumlah sedikit dalam tabung-tabung kecil untuk mempercepat tampaknya reaksi. Bila
organisme yang Anda uji menghasilkan urease, maka amoniak yang dilepaskan ke
dalam medium akan
menaikkan pH. Bila pH menjadi makin tinggi maka merah fenol akan berubah warna
dari kuning (pH 6,8) menjadi merah keunguan (pH 8,1 atau lebih).
8.

Uji hidrolisis pati

Ambillah cawan agar pati Anda. Genangi seluruh permukaan agar dengan
iodium Gram. Uji positif ditandai dengan tarnpaknya area jernih di sekitar
pertumbuhan
organisme yang Anda goreskan. Catatlah hasil pengamatan Anda pada label hasil
pengamatan.
Keterangan :
Uji ini umum dilakukan karena banyak bakteri dapat menghidrolisis pati. Molekul
pati berukuran besar dapat terdiri dari dua komponen : amilose yaitu suatu polilner
berantai lurus yang terdiri dari 200-300 unit glukose, dan amilopektin yaitu polimer
yang lebih besar serta bercabang dan mempunyai gugus posfat. Bakteri penghasil
enzim amylase dapat menghidrolisis pati menjadi molekul-molekul maltose, glukose,
dan dekstrin.
Larutan iodium Gram adalah indikator pati. Bila medium yang mengandung pati
diberi larutan iodium, maka akan tampak warna biru. Bila pati terhidrolisis, maka
tempat-tempat yang tidak mengandung pati lagi akan tampak jernih.
9.

Uji hidrogen sulfide

Amatilah tabung biakan TSB yang disisipi kertas plumbum asetat. Bila pada
kertas tersebut tampak warna hitam kecoklatan, artinya uji tersbut positif. Catatlah
hasil pengamatan Anda pada tabel hasil pengamatan.
Keterangan:
Bakteri tertentu seperti Proteus vulgaris menghasilkan hidrogen sulfide dari asam
amino sistem melalui kerja enzim sistein desulfurase. Produksi H2S merupakan
langkah awal di dalam proses deaminasi sistein. H2S yang terbentuk akan bereaksi
dengan plumbum asetat menghasilkan plumbum sulfide yang berwarna hitam.
10.

Uji penggunaan sitrat

Amatila biakan agar miring sitrat Simmons Anda, apakah ada perubahan
warna dan apakah ada petumbuhan. Catatlah hasil pengamatan Anda pada tabel hasil
pengamatan.
45
Keterangan:
Kemampuan beberapa organisme seperti Enterobacter aerogenes dan Salmonella
typhimurium untuk menggunakan sitrat sebagai sumber karbon satu-satunya dapat

merupakan ciri pembeda yang sangat berguna bila Anda bekerja dengan bakteribakteri usus. Agar sitrat Simmons adalah salah satu medium yang umum digunakan
untuk menguji kemampuan semacam itu sebagai sumber karbon satu-satunya,
sedangkan sebagai sumber nitrogennya digunakan garam amonium dan bukan asam
amino. Agar sitrat Simmons juga mengandung indikator biru bromtimol yang dapat
berubah warna dari hijau menjadi biru bila keadaan menjadi alkalin.
Bila organisme yang Anda uji dapat tumbuh dengan menggunakan sitrat
sebagai sumber karbon satu-satunya maka Anda akan melihat adanya pertumbuhan
pada permukaan agar miring yang Anda gores disamping berubahnya warna medium
menjadi biru.
11.

Uji hemolisis darah

Pada setiap cawan agar darah, amatiah area disekitar koloni atau pertumbuhan.
Bila area tersebut jernih artinya terjadi hemolisis sel-sel darah secara lengkap atau
hemolisis beta; bila area tersebut hijau artinya terjadi hemolisis sebagian pada sel-sel
darah atau disebut hemolisis alfa, bila urea tersebut tidak menunjukan perubahan
warna artinya tidak terjadi hemilisis pada sel-sel darah atau disebut hemolysis gama.
Catatlah hasil pengamatan pada tabel hasil pengamatan.

46
KEGIATAN 13
Isolasi Dan Identifiknsi Bakteri Tak Dikenal

Tujuan

Mengisolasi biakan murni dari biakan (suspensi) campuran.

Menerapkan pengetahuan Anda mengenai morfologi sel, ciri-ciri biakan serta,
ciri-ciri fisioiogisnya untuk mengidentifikasinya.
Belajar menggunakan kunci identifikasi dikotom.
Melatih Anda membuat catatan hasil percobaan dengan baik.

Teori Singkat

Agar dapat melakukan pencirian untuk identifikasi, pertama-tama Anda harus

memperoleh biakan murni masing-masing organismenya. Untuk mengidentifikasi
bakteri tersebut, skema klasifikasi yang paling terkenal dan paling umum digunakan
ialah yang dipaparkan dalarn Bergey's Manual Of Determinative Bacferiology; edis
yang terakhir (edisi-8 tahun 1974). identifikasi dapat dengan menggunakan kunci
pada halaman 18 di dalam buku itu atau dengan menggunakan kunci komprehensif
Skerman sebagaimana tercantum dalam apendiks buku tersebut. Di dalam kegiatan ini
begi Anda disediakan kunci dikotom yang cukup sederhana untuk diikuti, yang telah
disusun berdasarkan keterangan-keterangan yang tercanturn di dalam buku yang
sama.
Di dalam penggunaan kunci taksonomi dikotom, harus mulai dari awal kunci.
Pada setiap langkah, salah satu dari dua pilihan ciri taksonomis yang tersedia akan
ditinggalkan. Sedangkan pilihan yang sesuai dengan hasil pengamatan Anda tentang
organisme yang sedang diidentifikasi itu diikuti untuk menentukan pengamatan atau
uji apa yang perlu dilakukan berikutnya, dengan demikian maka Anda tidak
melakukan pengujian secara membabi buta melainkan secara selektif sesuai dengan
keperluan. Bila prosedur demikian ini Anda ikuti maka pada akhirnya Anda akan
sampai pada pilihan yang menyatakan nama organisme yang Anda identifikasikan.
Sebagai contoh: suatu organisme yang tidak berbenfuk filamen, Gram positif,
berbentuk batang, menghasilkan endospora, katalase positif, aerobik, nitrit negatif,
dan VP negatif ialah Bacillus megaterium.
Alat dan Bahan

pinsi lilin atau spidol

lidi penyeka terendam dalam biakcan bakteri
4 cawan trypticase soy agar (TSA)
4 agar mirig TSA
2 tabung trypficase soy broth (TSB)
kaca Obyek dan kaca tutup
kaca Obyek cekung
47

lup inokulasi dan jarum inokulasi

vaselin
kertas serap
mikroskop majemuk, minyak celup, dan ketlas lensa
mikrometer ocular
seperangkat pewama Gram
media/atau bahan lain sepeti berikut sesuai dengan keperluan/pesanan:
2 tabung Durham berisi phenol red laclose broth (kaldu lactose merah fenol)
2 tabung Durham berisi phenol red maltose broth
2 tabung Durham berisi phenol red sucrose broth
2 tabung Durham berisi phenol red mannitol broth
2 tabung kaldu natrium kloride 6,5%
2 tabung kaldu tioglikolat
2 tabung reaksi bersih berukuran 13 X 100 mm

Prosedur Kerja
Periode I
1. Tuliskan nama, tanggal, serta nomor kode biakan isolat pada sctiap cawan dan
tabung yang Anda inkubasikan; demikian pula pada kaca obyek bila Anda
perlu menyimpan hasil pewarnaan Anda untuk sementara waktu.
2. Dengan menggunakan metode penggoresan kuadran, goreskan biakan
campuran Anda pada 2 cawan TSA. Inkubasikan cawan-cawan tersebut dalam
keadaan terbalik pada suhu 370 C selama 24 jam.
3. Lakukan pewarnaan Gram pada biakan campuran Anda dan catatlah hasilnya
pada catatan Anda.
Periode II
1. Periksalah hasil goresan Anda dan amatilah koloni-koloni yang terisolasi.
Tandalah dengan lingkaran dan nomori 2 koloni yang tampak berbeda yang
mewakili kedua genus bakteri yang Anda selidiki (jangan menandai
kontaminan yang biasanya jumlahnya amal sedikit). Goreskanlah masingmasing koloni ke dalam cawan TSA baru untuk memurnikannya (cukup satu
cawan untuk setiap macam koloni).
2. Lakukanlah pewamaan Gram dan pengamatan morfologi sel terhadap kolonikoloni yang sama (koloni-koloni yang digoreskan kembali). Catatlah hasilnya
pada catatan Anda.
3. Bila Anda tidak menemukan dua macam koloni berbeda yang sel-selnya
menunjukkan reaksi Gram serta morfologi seperti yang Anda amati mulamula secara langsung pada biakan campuran Anda, maka Anda harus
melakukan goresan ulang pada 2 cawan TSA baru. Sebagai inokulum
gunakanlah koloni campuran dari cawan Anda sendiri.
inkubasikan cawan-cawan TSA yang baru diinokulasi itu pada suhu 37 0C
selama 24 jam
48
Periode III

1. Bila Anda sudah memperoleh biakan murni dari masing-masing bakteri

pertama-tama goreskanlah masing-masing pada agar miring TSA (2 agar
miring untuk setiap macam koloni, yang satu untuk Anda pergunakan di dalam
pemeriksaan pengujian, yang satu lagi untuk menjaga bila yang petama tadi
terkontaminasi). Inkubasikan tabung-tabung tersebut pada 37 0C selama 24
jam.
2. Lakukanlah pengamatan morfologi koloni, morfologi sel serta pewarnaan
Gram pada masing isolat Anda dan periksalah apakah hasilnya sama dengan
yang Anda peroleh sebelumnya. Catatlah hasil pengamatan Anda.
Perhatian:
Janganlah melakukan pewarnaan Gram dari pengamatan morfologi sel pada
koloni-koloni yang tumbuh pada medium diferensial atau selektif karena zat
penghambat yang terdapat di dalam medium semacam itu dapat memberikan hasil
pewarnaan yang keliru dan dapat pula mengubah bentuk sel. Untuk mengamati
penataan sel, Anda perlu menumbuhkan bakteri Anda di dalam kaldu nutrien atau
kaldu tioglikolat.
3. Tentukanlah uji-uji apa yang selanjutnya harus Anda kerjakan dengan cara
menggunakan kunci identifikasi yang tersedia. Bila uji-uji tersebut telah
ditetapkan, pesanlah bahan-bahan yang Anda perlukan pada asisten yang
bertugas untuk dipergunakan pada periode berikutnya.
4. Bila pada periode ini Anda belum juga memperoleh koloni-koloni yang
terisolasi, hubungi asisten Anda.
Periode IV
1. Setelah Anda memperoleh bahan-bahan yang Anda pesan, lakukanlah
pengujian-pengujian fisiologis seperti yang Anda rencanakan.
perhatian:
inokulum untuk pengujian-pengujian semacam ini hendaknya diambil dari biakan
agar miring stok dan bukan dari cawan. Inkubasikan hasil inokulasi Anda
sebagaimana mestinya.
2. Lakukanlah pewarnaan Gram pada biakan-biakan dari agar miring Anda untuk
meyakinkan sekali lagi bahwa Anda memperoleh hasil yang sama dengan
yang terdahulu.
Period V
1. Amati hasil pengujian Anda dan catatlah.
2. Lanjuikan dengan pengujian-pengujian lain yang diperlukan.
Periode VI
1. Amatilah hasil pengujian Anda dan catatlah.
2. Serahkan catatan anda lengkap dengan nama organisme yang berhasil Anda
isolasi dan yang diidetifikasikan.
Catatan:
Kaldu karbohidrat yang mengandung pheno red (merah fenol) dimaksudkan
49

untuk menguji kemampuan organisme memfermenlasi karbohidrat yang

bersangkutan. indikator merah fenol berwarna kuning pada keadaan asam (pH
6,8) dan berwarna merah pada keadaan alkalin (pH 8,4).
Kaldu natrium kloride 6,5% dimaksudkan untuk menguji toleransi organisme
terhadap garam.

50

KEGIATAN 14
Moist Chamber (Medium Jamur Basah)
Tujuan
Untuk mempelajari pertumbuhan jamur menggunakan metode mikrokultur medium
jamur basah.
Alat dan Bahan
cawan petri
kertas saring
gelag obyek dan kaca penutup
agar Sabouraud
vaselin
aquades steril
mikroskop, minyak celup dan kertas lensa
Prosedur Kerja
1. Sediakan cawan petri yang telah dialasi kertas saring. Dalam cawan petri ini
ditaruh gelas obyek dan kaca penutup. Kemudian sterilkan alat ini.
2. Teteskan secukupnya perbenihan agar Sabouraud pada kaca obyek biarkan
membeku.
3. Setelah beku satu sisi dari tetesan Sabouraud tadi dipotong.
4. Tanamkan jamur pada bagian sisi Sabouraud yang dipotong tadi.
5. Oleskan vaselin pada tiga bagian sisi kaca penutup, kemudian tutup tetesan
Sabouraud yang telah ditanami ituu dengan kaca penutup, dengan cara bagian
yang tidak diberi vaselin tepat diatas irisan agar yang telah ditanami (dengan
maksud untuk memberikan suasana aerob).
6. Untuk memberi suasana lembab, diteteskan aquades steril ke atas kertas saring
yang ada di dalam cawan petri.
7. Inkubasikan mikro kultur tadi selama 24-48 jam pada temperature kamar.
8. Setelah diinkubasikan, mikrokultur tersebut siap diperiksa langsung dibawah
mikroko setiap saat. Biasanya perbesaran yang dipakai 10x atau 40x, dengan
kondensor diturunkan dan diafragma agak ditutup atau ditutup sesuai
keperlukan sehingga obyek dapat terlihat dengan jelas.
Catatan :
Semua pekerjaan di atas dilakukan secara aseptis.

51
HASIL PENGAMATAN

PENUNTUN PRAKTIKUM
MIKROBIOLOGI FARMASI

Disusun oleh :

Dra. Hj. Dewi Rusmiati

Dra. Hj. Sulistianingsih, M, Kes
Dr. Tiana Milanda, M.Si.
Sri Agung Fitri Kusuma, M.Si.
Tina Rostinawati, M.Si.
Dr. Med. Melisa Intan Barliana

UNIVERSITAS PADJADJARAN
FAKULTAS FARMASI
LABORATORIUM MIKROBIOLOGI
JATINANGOR
2015

KATA PENGANTAR
Penuntun Praktikum Mikrobiologi Farmasi disusun sebagai penuntun bagi
mahasiswa dalam melakukan praktikum di Laboratorium Mikrobiologi Farmasi
Fakultas Faramasi Universitas Padjadjaran. Tujuan utama penulisan penuntun ini
adalah untuk membantu mahasiswa dalam mempelajari teknik dan prosedur
Mikrobiologi Farmasi.
Materi Praktikum meliputi penentuan MIC (Minimum Inhibitory Control),
penetapan koefisien fenol, tes resistensi dan penentuan potensi. Materi-materi tersebut
disusun dari berbagai buku-buku Mikrobiologi, baik text book maupun penuntun
praktikum.
Penyusun menyadari bahwa penuntun ini masih jauh dari sempurna. Oleh
karena itu, tegur sapa dan koreksi untuk perbaikan ini sangat kami harapkan.

Jatinangor, Februari 2015

Penyusun

i
DAFTAR ISI

KATA PENGANTAR....

DAFTAR ISI..

ii

I.

II.

III.

IV.

PENENTUAN MINIMUM INHIBITOR CONCENTRATION (MIC)

DARI SUATU SEDIAAN UJI YANG BERPOTENSI SEBAGAI
ANTIBIOTIK............................
A. METODA MIC CAR..
B. METODA MIC PADAT.

1
1
3

PENENTUAN KERENTANAN SUATU BAKTERI TERHADAP

BERBAGAI SEDIAAN ANTIBIOTIKA.

PENENTUAN DAYA HAMBAT DARI SUATU SEDIAAN

YANG BERPOTENSI SEBAGAI ANTISEPTIK ATAU
DESINFEKTAN TERHADAP BAKTERI UJI
PENENTUAN POTENSI ANTIBIOTIKA..
A. UJI POTENSI DUA DOSIS
B. UJI POTENSI TIGA DOSIS

7
11
11
14

ii

I.

PENENTUAN MINIMUM INHIBITORY CONCENTRATION (MIC)

DARI SUATU SEDIAAN UJI YANG BERPOTENSI SEBAGAI
ANTIBIOTIK

TUJUAN
Menentukan Minimum Inhibitory Concentration (MIC) suatu sediaan uji
terhadap bakteri Gram positif maupun Gram negatif, dengan menggunakan metoda
MIC cair atau MIC padat.
TEORI
Suatu antibiotik mempunyai MIC yang berlainan terhadap bakteri tertentu.
Kepekaan mikroba terhadap antibiotik dapat dilihat dari konsentrasi minimum untuk
diinhibisi oleh suatu antibiotika terhadap mikroba tertentu. Penetapan MIC dapat
dilakukan dengan menguji sederetan konsentrasi yang dibuat dengan pengenceran,
metode yang digunakan dapat dengan cara turbidimetri (dengan melihat kekeruhan)
ataupun cara difusi agar. Konsentrasi terendah dimana pertumbuhan bakteri terhambat
dinyatakan sebagai konsentrasi minimum untuk inhibisi (MIC).
Penentuan kepekaan mikroba terhadap antibiotika dilakukan secara in vitro
yang dinyatakan dalam MIC dan aktivitas penghambatannya pada MIC tersebut. MIC
ini tidak dapat dianggap akan setara dengan MIC in vivo karena dalam tubuh manusia
terjadi biotrasformasi antibiotika, terjadi penguraian atau fiksasi antibiotika pada
protein plasma sehingga aktivitas antibiotika akan berkurang. Setiap antibiotika
mempunyai sifat farmakokinetik yang berbeda tergantung pada sifat fisikokimianya
dan karakteristik fisiologi individual pemakai.
A. METODA MIC CAIR
Alat dan Bahan
l. Mortir dan stamfer
2. Tabung reaksi besar dan kecil
3. Rak tabung
4. Volume pipet berukuran 1 ml dan 10 ml
5. Labu ukur 100 ml
6. Ose dan lampu spirtus
7. Inkubator
8. Sediaan uji
9. Berbagai suspensi bakteri Gram positif maupun Gram negatif
10.Nutrient Broth (NB) double strength
11.Nutrient Broth (NB)
12.Pelarut sediaan uji
13.Air suling
1
PROSEDUR

1. Masukkan sediaan uji ke dalam labu ukur, larutkan dengan sedikit pelarutnya.
Kemudian tambahkan air suling steril sampai tanda batas. Jika sediaan uji
berbentuk padat, gerus dahulu dalam mortir, sebelum dimasukan dalam labu
ukur.
2. Rencanakan pengenceran dan hitung konsentrasi campuran pada masingmasing tabung besar dan tabung-tabung kecil.
3. Buat pengenceran bertingkat larutan sediaan uji dengan air suling steril dalam
tabung-tabung reaksi besar
4. Isi tabung reaksi kecil pertama dengan 1 ml NB double strength, sedangkan
tabung-tabung reaksi selanjutnya dengan 1 ml NB biasa
5. Pipet 1 ml hasil pengenceran terakhir ke dalam tabung 1 berisi NB double
strength, kocok sampai homogen
6. Pipet 1 ml campuran dari tabung 1 ke tabung 2, kocok sampai homogen
7. Ulangi langkah tersebut sampai tabung terakhir. Buang 1 ml campuran dari
tabung terakhir
8. Tambahkan 1 ose bakteri ke dalam masing-masing tabung kecil, kocok sampai
homogeny
9. Buat 1 kontrol postif dan 1 kontrol negatif. Kontrol positif terdiri dari 1 ml NB
dan 1 ose bakteri. Kontrol negatif hanya berisi 1 ml NB
10. Inkubasikan semua tabung kecil pada suhu 370C selama 18-24 jam, Amati
kekeruhan yang terjadi, bandingkan dengan kontrol positif dan negative.
11. Tentukan dimana MIC nya. MIC terletak pada tabung bening yang terakhir,
atau sebelum tabung keruh pertama.
PERHITUNGAN KONSENTRASI (uraikan)

2
HASIL PENGAMATAN

PENGAMATAN

TABUNG REAKSI
3
4

KEKERUHAN
Keterangan :
(-) : bening
(+): keruh

B. METODA MIC PADAT

Alat dan Bahan
1. Mortir dan stamfer
2. Tabung reaksi besar
3. Rak tabung
4. Cawan petri
5. Volume pipet berukuran 1 ml dan 10 ml
6. Labu ukur 100 ml
7. Ose dan lampu spirtus
8. Inkubator
9. Sediaan uji
10. Berbagai suspensi bakteri Gram positif maupun Gram negatif
11. Nutrient Agar (NA)
12. Pelarut sediaan uji
13. Air suling
PROSEDUR
1. Masukkan sediaan uji ke dalam labu ukur, larutkan dengan sedikit pelarutnya.
Kemudian tambahkan air suling steril sampai tanda batas. Jika sediaan uji
berbentuk padat, gerus dahulu dalam mortir, sebelum dimasukkan dalam labu
ukur.
2. Rencanakan pengenceran dan hitung konsentnsi campuran pada masingmasing tabung besar dan cawan-cawan petri.
3. Buat pengenceran bertingkat larutan sediaan uji dengan air suling dalam
tabung-tabung reaksi besar.
4. Bagi permukaan dasar cawan menjadi area-area sama besar. Beri label nama
bakteri yang akan digunakan pada setiap area.
5. Pipet 1 ml masing-masing pengenceran ke dalam cawan-cawan petri.
Tambahkan 19 ml NA cair bersuhu 40-500C, goyangkan beberapa saat, lalu
diamkan sampai membeku.
6. Goreskan masing-masing bakteri pada area yang terpisah dengan
menggunakan
3

ose. Buat Kontrol positif yang terdiri dari 20 ml NA dalam cawan petri, yang
digores oleh bakteri-bakteri yang digunakan di area yang terpisah.
7. Inkubasikan semua cawan petri pada suhu 37 0C selama 18-24 jam. Amati
pertumbuhan bakteri dari koloni-koloni yang tampak. Bandingkan morfologi
koloni-koloni tersebut dengan kontrol positif.
8. Tentukan dimana MIC nya. MIC terletak pada cawan petri terakhir yang tidak
tampak koloni bakteri.
PERHITUNGAN KONSENTRASI : (uraikan)

HASIL PENGAMATAN
JENIS BAKTERI

CAWAN PETRI
2

Keterangan :
(-) : tidak ada pertumbuhan
(+) : ada pertumbuhan
4
II.

PENENTUAN KERENTANAN SUATU BAKTERI TERHADAP

BERBAGAI SEDIAAN ANTIBIOTIKA

TUJUAN
Menentukan kerentanan suatu bakteri terhadap berbagai sediaan antibiotika, melalui
tes resistensi dengan metoda cakram kertas (Paper Disk Plate).
TEORI
Resistensi bakteri terhadap antibiotika membawa masalah tersendiri yang dapat
menggagalkan terapi dengan antibiotika. Resistensi dapat merupakan masalah
individual dan epidemiologik. Resistensi adalah ketahanan mikroba terhadap
antibiotika tertentu yang dapat berupa resistensi alamiah, resistensi karena adanya
mutasi spontan (resistensi kromosomal) dan resistensi karena adanya faktor R pada
sitoplasma (resistensi ekstrakromosomal) atau resistensi karena pemindahan gen yang
resisten atau faktor R atau plasmid (resistensi silang).
Beberapa mikroba tidak peka terhadap antibiotika tenentu karena sifat
mikroba secara alamiah tidak dapat diganggu oleh antibiotika tersebut. Hal ini
disebabkan oleh tidak adanya reseptor yang cocok atau dinding sel mikroba tidak
dapat ditembus oleh antibiotika. Resistensi kromosomal terjadi karena mutasi spontan
pada gen kromosom. Resistensi kromosomal dapat dibagi dalam dua golongan yaitu :
1. Resistensi kromosomal primer, dimana mutasi terjadi sebelum pengobatan
dengan antibiotika dan selama pengobatan terjadi seleksi bibit yang resisten.
2. Resistensi kromosomal sekunder, dimana mutasi terjadi selama kontak dengan
antibiotika kemudian terjadi seleksi bibit yang resisten
Kecepatan timbulnya resistensi bervariasi untuk berbagai antibiotika. Kelompok
aminoglikosida, makrolida dan rifampisin termasuk kelompok yang cepat
menimbulkan resistensi mikroba, sedangkan kelompok tetrasiklin dan kelompok
kloramfenikol digolongkan ke dalam kelompok yang tidak terlampau cepat
menimbulkan resistensi. Kelempok yang lambat menimbulkan resistensi umumnya
karena terjadi mutasi langsung dan kelompok lain umumnya termutasi setelah
berkembangbiak beberapa tahap.
Penyebab terjadi resistensi mikroba adalah penggunaan antibiotika yang tidak
tepat, misalnya penggunaan dengan dosis yang tidak memadai, pemakaian yang tidak
teratur atau tidak kontinu, demikian juga waktu pengobatan yang tidak cukup lama.
Maka untuk mencegah atau memperlambat timbulnya resistensi mikroba, harus
diperhatikan cara penggunaan antibiotika yang tepat.

5
Alat Dan Bahan

1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.

Cawan petri
Lidi kapas dan lampu spirtus
Inkubator
Jangka sorong
Suspensi bakteri uji
Nutrient Agar (NA)
Bebagai cakram kertas antibiotika dengan kuantum tertentu

PROSEDUR
1. Tuangkan 20 ml NA cair bersuhu 40-50 0C ke dalam masing-masing cawan
petri, lalu diamkan sampai membeku.
2. Dengan menggunakan lidi kapas steril, ulaskan suspensi bakteri uji ke seluruh
permukaan agar dalam cawan-cawan petri sampai merata. Biarkan selama
kurang lebih 30 menit.
3. Letakkan cakram-cakram antibiotika pada permukaan agar dengan jarak
sedemikian rupa, sehingga diharapkan tidak terjadi penumpukan zona inhibisi.
4. Inkubasikan semua cawan petri pada suhu 370C selama 18-24 jam. Ukur zona
inhibisi yang terjadi dengan menggunakan jangka sorong.
HASIL PENGAMATAN
CAWAN PETRI

ZONA INHIBISI (mm)

B
C
D

1
2
Keterangan :
A, B, C, D, E : cakram-cakram antibiotika dengan kuantum tertentu

6
III.

PENENTUAN DAYA HAMBAT DARI SUATU SEDIAAN YANG

SEBAGAI ANTISEPTIK ATAU DESINFEKTAN

TERHADAP BAKTERI UJI
TUJUAN
Menentukan daya hambat suatu sediaan yang berpotensi sebagai antiseptik atau
desinfektan, dengan membandingkannya terhadap standar fenol (koefisien fenol).
TEORI
Untuk menentukan kualitas desinfektan yaitu menentukan daya bunuh
desinfektan terhadap kuman adalah dengan menggunakan metode koefisien fenol.
Fenol adalah jenis desinfektan yang paling kuno dan karena kekuatannya telah
diketahui maka kualitas desinfektan selalu dibandingkan dengan fenol.
Koefisien fenol adalah bilangan pecahan yang menunjukkan perbandingan
kekuatan daya bunuh dari desinfektan dibandingkan dengan kekuatan daya bunuh dari
fenol sebagai pembanding dalam kondisi yang sama, yaitu jenis bakteri yang sama
dan waktu kontak yang sama. Waktu untuk menguji antibiotika adalah 18-24 jam,
sedangkan untuk mata tidak mungkin selama itu. Oleh karena iu, digunakan waktu
tertentu dengan metode kontak secara konvensional, waktu yang paling tepat adalah
2,5 menit, paling lama 15 menit. Kekuatn fenol untuk menguji desinfektan adalah
tidak lebih besar dari 5%.
Ciri-ciri suatu desinfektan yang ideal adalah memenuhi hal-hal sebagai
berikut:
1. Aktivitas antimikrobial, pada konsentrasi rendah harus mempunyai aktivitas
antimikrobial dengan spektrum luas.
2. Kelarutan, harus dapat larut dalam air atau pelarut lain sampai taraf yang
diperlukan untuk dapat digunakan secara efektif.
3. Stabilitas, perubahan yang terjadi pada substansi bila dibiarkan beberapa hari
harus seminimal mungkin dan tidak boleh menghilangkan sifat
antimikrobialnya secara nyata.
4. Tidak bersifat racun
5. Homogen
6. Tidak bergabung dengan bahan organik
7. Aktivitas antimikrobial pada suhu kamar
8. Tidak menimbulkan karat dan warna
9. Kemampuan menghilangkan bau yang kurang sedap
10. Memiliki kemampuan sebagai deterjen/pembersih
11. Tersedia dalam jumlah yang besar dengan harga yang pantas.
Alat dan Bahan
1. Mortir dan stamfer
2. Tabung reaksi besar dan kecil
7
3. Rak tabung

4. Volume pipet berukuran 1 ml dan 10 ml

5. Labu ukul 100 ml
6. Ose dan kompor spirtus
7. Stopwatch
8. Inkubator
9. Sediaan uji
10. Bakteri uji
11. Nutrient Broth (NB)
12. Fenol
13. Air suling
14. Pelarut sediaan uji
PROSEDUR
1. Buat larutan sediaan uji dan larutan standar fenol dengan konsentrasi 5 % b/v
atau 5 % v/v
2. Rencanakan pengenceran dan hitung konsentrasi larutan pada masing-masing
tabung besar.
3. Buat 6 pengenceran bertingkat larutan sediaan uji dan larutan standar fenol
dengan air suling steril dalam tabung-tabung reaksi besar, sebagai berikut:
Tabung

Kekuatan
fenol

Larutan fenol
5% yang dipipet

Aquades steril
yang
ditambahkan

Total yang
diperlukan

Yang
dibuan
g

A
B
C
D
E
F

1/20
1/30
1/40
1/50
1/60
1/70

5
4
4
2
2
2

0
2
4
3
4
5

5
5
5
5
5
5

0
1
3
0
1
1

4. Isi 36 tabung reaksi kecil dengan 1 ml NB.

5. Susun tabung-tabung besar dan kecil dalam rak tabung. Baris pertama terdiri
dari 6 tabung besar yang berisi hasil pcngenceran, beri tanda A,B,C,D,E dan F.
Baris kedua berisi 6 tabung kecil berisi NB double strength, beri tanda al, bl,
cl, dl, el dan fl. Baris ketiga sampai keenam masing-masing berisi 6 tabung
kecil berisi NB biasa, beri tanda a2, b2, c2, d2, e2, f2 sampai a6, b6, c6, d6, e6
dan f6. Buat susunan ini untuk sediaan uji dan standar fenol.
6. Masukkan 0,2 ml suspensi bakteri uji pada masing-masing tabung besar secara
berurut, dengan rentang waktu 30 detik
7. Masukkan masing-masing 1 ose larutan dari tabung A secara berurut ke tabung
al, a2, a3; a4, a5 dan a6 sccara berurut, selana 2,5 menit. Lakukan juga untuk
tabung-tabung B,C,D,E dan F.
8. Buat 1 kontrol postif dan 1 kontrol negatif. Kontrol positif terdiri dari 1 ml NB
dan 1 ose bakteri (salah satu saja). Kontrol negatif hanya berisi 1 ml NB.
9. Inkubasikan semua tabung kecil pada suhu 370C selama 18-24 jam. Amati
8
kekeruhan yang terjadi, bandingkan dengan kontrol positif dan negatif.
10. Tentukan dimana koefisien fenolnya :

Koefisien fenol = (kosentrasi bening pertama + konsentrasi bening terakhir) sediaan

uji
(kosentrasi benng pertama + konsentrasi bening terakhir) standar
fenol
Bagan Pengerjaan Koefisien Fenol

9
PERHITUNGAN KONSENTRASI : (uraikan)

HASIL PENGAMATAN
Waktu

2,5 menit

5 menit

7,5 menit

10 menit

12,5 menit

15 menit

Konsentras
i
A
B
C
D
E
F
Keterangan :
(- ) : bening
(+) : keruh

10
IV.

PENENTUAN POTENSI ANTIBIOTIKA

TUJUAN
Menentukan besarnya potensi sampel antibiotika di pasaran terhadap antibiotika
standar.
TEORI
Dalam Farmakope Indonesia dinyatakan bahwa potensi adalah perbandingan
dosis sediaan uji dengan dosis larutan standar atau larutan pembanding yang
menghasilkan derajat hambatan pertumbuhan yang sama pada biakan jasad renik yang
peka dan sesuai. Aktivitas (potensi) antibiotik dapat ditunjukkan pada kondisi yang
sesuai dengan efek daya hambatannya pada mikroba. Suatu penurunan aktivitas
antimikroba juga akan dapat menunjukkan perubahan kecil yang tidak dapat
ditunjukkan oleh metode kimia, sehingga pengujian secara mikrobiologi atau biologi
biasanva merupakan suatu standar untuk mengatasi keraguan tentang kemungkinan
hilangnya aktivitas. Farmakope Indonesia menentukan bahwa potensi antibiotika
standar berkisar antara 95-105%. Namun potensi tersebut dapat menurun karena
kadaluwarsa, penyimpanan yang tidak benar dan terjadinya penguraian obat yang
menghasilkan zat lain yang tidak memiliki efek lagi.
Aktivitas suatu antibiotika dapat dilihat pada dua kriteria yaitu MIC dan besar
diameter hambatan. Makin rendah MIC makin kuat potensialnya, demikian pula
semakin besar diameter hambatan, makin kuat pula potensialnya. Namun pada
umumnya, antibiotik yang mepunyai potensi tinggi memilki MIC yang rendah dan
diameter yang besar.
Ada dua metode umum pengujian potensi antibiotika yang dapat digunakan :
1. Metode penetapan dengan lempeng silinder :
Metoda ini berdasarkan difusi antibiotika dari silinder yang dipasang tegak
lurus pada lapisan agar padat dalam cawan petri atau lempeng, sehingga
mikroba yang ditambahkan dihambat pertumbuhannya pada daerah berupa
lingkaran atau zona disekeliling silinder yang berisi larutan antibiotika.
2. Metode Turbidimetri :
Metode mi berdasarkan hambatan pertumbuhan biakan mikroba dalam larutan
serbasama antibotika, dalam media cair yang dapat menumbuhkan mikroba
dengan cepat bila tidak terdapat antibiotika.
A.

UJI POTENSI DUA DOSIS

Alat Dan Bahan

1. Mortir dan stamfer
2. Tabung reaksi besar
3. Cawan petri
11
4. Rak tabung

5. Volume pipet berukuran 1 ml dan 10 ml

6. Labu ukur 100 ml
7. Lampu spirtus
8. Spatel
9. Pinset
10. Mikropipet
11. Perforator
12. Inkubator
13. Jangka sorong
14. Sediaan antibiotika standar dan sampel
15. Media nutrien agar
16. Berbagai suspensi bakteri Gram positif maupun Gram negatif
17. Pelarut sediaan uji
18. Air suling steril
19. Larutan desinfektan
PROSEDUR
1. Siapkan suspensi bakteri dalam Nutrien broth yang berumur 18-24 jam,
bakteri ini harus homogeny
2. Siapkan perbenihan nutrien agar dengan cara melarutkan sejumlah tertentu
nutrien agar dalam aquades kemudian disterilkan dalam otoklaf selama 15
menit pada 1210C.
3. Masukkan sediaan uji ke dalam labu ukur, larutkan dengan sedikit pelarutnya.
Kemudian tambahkan air suling steril sampai tanda batas. Jika sediaan uji
berbentuk padat, gerus dahulu dalam mortir, sebelum dimasukkan dalam labu
ukur.
4. Rencanakan pengenceran larutan sampel dan larutan standar hingga didapat
variasi dua seri dosis yang diinginkan (dosis tinggi dan dosis rendah).
5. Dibuat larutan inokulum dengan cara memasukkan suspensi biakan bakteri ke
dalam nutrien agar yang telah disterilisasi. Dalam keadaan masih cair,
tuangkan nutrien agar yang telah mengandung suspensi bakteri tersebut ke
dalam cawan petri secara aseptis sebanyak 20 ml. Biarkan sampai membeku.
6. Bagi permukaan dasar cawan menjadi empat area sama besar. Beri label
masing-masing area tersebut tergantung variasi seri dosis yang akan
digunakan.
7. Buat empat cetakan reservoir (lubang) pada masing-masing cawan petri
dengan menggunakan perforator secara aseptis. Buat reservoir tersebut
dengan cara membuang agar yang ada dalam cetakan reservoir tersebut
dengan menggunakan spatel. Masukkan hasil buangan tersebut ke dalam
larutan desinfektan yang telah disediakan.
8. Masukkan larutan sampel dan standar pada masing-masing reservoir sesuai
dosis yang ditentukan dengan menggunakan mikropipet secara aseptis.
9. Inkubasikan dalam inkubator pada suhu 370C selama 18-24 jam.
10. Ukur dan catat diameter daerah bening (zone lisis) yang terjadi di sekeliling
12

reservoir yang telah mengandung antibiotika tersebut dengan menggunakan

jangka sorong.
11. Hitung potensi antibiotik.
PERHITUNGAN KONSENTRASI : (uraikan)

HASIL PENGAMATAN
Cawan

Standar (mm)
SH

Sampel (mm)
SL

UH

UL

1.
2.
Jumlah
Rata-rata
Keterangan:
SH
: Baku dengan dosis tinggi
SL
: Baku dengan dosis rendah
UH
: Sampel dengan dosis tinggi
UL
:
Sampel
13

dengan

dosis

rendah

B.

UJI POTENSI TIGA DOSIS

Alat Dan Bahan

1. Mortir dan stamfer
2. Tabung reaksi besar
3. Cawan petri
4. Rak tabung
5. Volume pipet berukuran 1 ml dan 10 ml
6. Labu ukur 100 ml
7. Lampu spirtus
8. Spatel
9. Pinset
10. Mikropipet
11. Perforator
12. Inkubator
13. Jangka sorong
14. Sediaan antibiotika baku dan sampel
15. Media nutrien agar
16. Berbagai suspensi bakteri Gram positif maupun Gram negatif
17. Pelarut sediaan uji
18. Air suling steril
19. Larutan desinfektan
PROSEDUR
1. Siapkan suspensi bakteri dalam Nutrien broth yang berumur 18-24 jam,
bakteri ini harus homogen.
2. Siapkan perbenihan nutrien agar dengan cara melarutkan sejumlah tetentu
nutrien agar dalam aquades kemudian disterilkan dalam otoklaf selama 15
menit pada 1210C.
3. Masukkan sediaan uji ke dalam labu ukur, larutkan dengan sedikit pelarutnya.
Kemudian tambahkan air suling steril sampai tanda batas. Jika sediaan uji
berbentuk padat, gerus dahulu dalam mortir, sebelum dimasukkan dalam labu
ukur.
4. Rencanakan pengenceran larutan sampel dan larutan baku hingga didapat
variasi tiga seri dosis yang diinginkan (dosis tinggi, dosis sedang dan dosis
rendah).
5. Dibuat larutan inokulum dengan cara memasukkan suspensi biakan bakteri ke
dalam nutrien agar yang telah disterilisasi. Dalam keadaan masih cair,
tuangkan nutrien agar yang telah mengandung suspensi bakteri tersebut ke
dalam cawan petri secara aseptis sebanyak 20 ml. Biarkan sampai membeku.
6. Bagi permukaan dasar cawan menjadi empat area sama besar. Beri label
masing-masing area tersebut tergantung variasi seri dosis yang akan
digunakan.

7. Buat enam cetakan reservoir (lubang) pada masing-masing cawan petri dengan
menggunakan
perforator
secara
aseptis.
14
Buat resevoir tersebut dengan cara membuang agar yang ada dalam cetakan
reservoir tersebut dengan menggunakan spatel. Masukkan hasil buangan
tersebut ke dalam larutan desinfektan yang telah disediakan.
8. Masukkan larutan sampel dan baku pada masing-masing reservoir sesuai dosis
yang ditentukan dengan menggunakan mikropipet secara aseptis.
9. Inkubasikan dalam inkubator pada suhu 370C selama 18-24 jam.
10. Ukur dan catat diameter daerah bening (zone lisis) yang terjadi di sekeliling
reservoir yang telah mengandung antibiotika tersebut dengan menggunakan
jangka sorong.
11. Hitung potensi antibiotik.
PERHITUNGAN KONSENTRASI : (uraikan)

HASIL PENGAMATAN
Baku (mm)
Cawan
BT
BS

Jumlah
Rata-rata
Keterangan :
BT
: Baku dengan dosis tinggi
BS
: Baku dengan dosis sedang
BR
: Baku dengan dosis rendah
ST
: Sampel dengan dosis tinggi
SS
: Sampel dengan dosis sedang

BR

ST

Sampel (mm)
SS

SR

SR

: Sampel dengan dosis rendah

15