TUGAS INDIVIDU UJIAN AKHIR SEMESTER

KULTUR JARINGAN

RANCANGAN PRODUKSI PODOPHYLLOTOXIN MELALUI KULTUR SEL

Disusun untuk memenuhi tugas ujian final matakuliah kultur jaringan

Dosen Pengampu : Muhammad Hajrul Malaka, S.Si., M.Si.

OLEH

YUGO ADE ANUGRAH TARUK PADANG

O1A1 14 108

JURUSAN FARMASI

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS HALU OLEO

KENDARI

2018
Soal

Rancang produksi podophyllotoxin melalui kultur sel (lengkap dengan rancangan

biosintesisnya. Jelaskan keunggulan dan kelemahan metode yang Anda ajukan

Jawaban
1. Podophyllotoxin (PTOX)
Podophyllotoxin (PTOX), 2,7'cyclolignan diperoleh terutama dari tanaman
Podophyllum hexandrum dan P. peltatum serta memiliki aktivitas anti-tumor. PTOX telah
digunakan sebagai senyawa awal untuk semi-sintesis dari obat-obatan sitotoksik seperti
etoposida (VP-16-213), teniposida (VM-26) dan etopofos, dan pada senyawa yang lebih
baru, 2 tafluposida, TOP53, NK611, GL -331 dan azatoxin obat hibrida yang saat ini
digunakan tunggal atau dikombinasikan dengan obat lain dan digunakan untuk mengobati
kanker paru-paru dan testis, leukemia dan rheumatoid arthritis. PTOX juga ditemukan pada
beberapa keluarga tumbuhan seperti Cupressaceae dari Gymnosperma, dan Berberidaceae,
Polygalaceae, Lamiaceae, dan Linaceae dari Angiosperms.

2. Hipotesis Biosintesis PTOX

Lignan merupakan dimer di mana kedua unit monomer C6-C3 dihubungkan oleh
ikatan ß-ß. Penggabungan DL- [ß-14 C] fenilalanin ke dalam PTOX menunjukkan bahwa
fenilalanin adalah salah satu titik awal biosintesa PTOX. Selain itu, degradasi bertahap
berikutnya ke 3', 4' – methylene dioxy - 3, 4, 5-trimethoxy benzophenone yang memiliki
label 14 C-karbonil membentuk sintesis in vivo kerangka karbon PTOX. Dua prekursor
propana fenil dari PTOX memiliki pola substitusi asam ferulic yang sama. Pada P.
hexandrum juga memperjelas konversi deoxypodo phyllotoxin ke PTOX, dan selanjutnya
dari PTOX sampai podophyllotoxone; meskipun reaksi kedua mungkin reversibel. Di antara
dua kemungkinan jalur hipotetis biosintesis dari konversi dari matairesinol ke PTOX
melalui yatein/ deoxypodophyllotoxin atau melalui thujaplicatin, transformasi dari
matairesinol ke yatein melibatkan
hidroksilasi, metilasi dan formasi jembatan dioksida metilena dan jembatan dioksida yang
baru diidentifikasi yang membentuk enzim sitokrom P450 mungkin merupakan langkah
maju dalam karakterisasi jalur PTOX. Jalur PTOX hipotetis juga telah disesuaikan, dimana
jalur fenilpropanoid menyediakan prekursor untuk biosintesis metabolit sekunder utama
pada tanaman, seperti lignin, lignan, anthocyanin, dan flavonoid. Fenilalanin amonia lyase
mengubah fenilalanin menjadi asam sinamat, dan cinnamate-4-hydroxylase mengubah asam
 sinamat menjadi asam p-koumarat. Selanjutnya, asam p-koumarat diubah oleh aksi 4-
hydroxycinnamate CoA ligase, hydroxycinnamoyl CoA: shikimate / quinate hydroxyl
cinnamoyl transferase, Caffeoyl CoA O -methyl transferase, dan cinnamoyl CoA reduktase
untuk membentuk coniferaldehyde yang dikatalisis oleh cinnamyl alcohol dehydrogenase
ke coniferyl alcohol. Kombinasi radikal fenoksi fenoksi stereokelektif Econiferyl alcohol
menjadi (+) - pinoresinol dimediasi oleh oksidase protein sentralbin, (+) - pinoresinol
selanjutnya dikonversi menjadi lariciresinol dan secoisolariciresinol oleh pinoresinol
reduktase. dan akhirnya diubah menjadi prekursor priptografi sekretolarikilinol yang
terakhir, oleh aksi secoisolariciresinol dehydrogenase.
3. Produksi PTOX melalui Kultur Sel
Kultur sel merupakan teknik yang secara luas digunakan pada studi metabolisme
manusia dan fisiologi manusia yang tidak mudah dilakukan secara in vivo. Sel dapat
diisolasi dari jaringan, lalu membiakkan kultur sel selama berhari-hari sampai berminggu-
minggu. Sel dapat diperoleh dari jaringan normal (contohnya, jaringan kulit) jika prosedur
klinis dan pertimbangan etis memungkinkan. Kultur sel biasanya dilakukan dalam bentuk
suspensi sel yang diambil dari jaringan asli (baik secara enzimatik, mekanik, atau disosiasi
kimia), kultur primer, atau cell line dan dilakukan di bawah kondisi laboratorium yang
steril dan lingkungan yang terkendali melibatkan suhu, gas, dan tekanan. Hal ini harus
menyesuaikan lingkungan in vivo dari sel tersebut sehingga sel mampu bertahan hidup dan
terjadi proliferasi secara terkendali.
Produksi podophyllotoxin yang dilakukan melalui kultur sel primer. Kultur sel primer
merupakan kultur sel yang langsung diperoleh dari jaringan tanaman. Adapun teknik yang
digunakan ialah teknik enzimatik. Teknik ini memiliki teknik keberhasilan yang tinggi
dengan berbagai variasi konsentrasi, kondisi enzimatiknya, serta konsentrasi kalsium dalam
medianya.
Tahapan dari kultur ini dimulai dari sel diisolasi dari jaringan tanaman dan
dikembangbiakkan pada kondisi yang sesuai. Setelah itu, sel harus di subkultur dengna
mentransfer sel tersebut ke medium baru untuk memberikan ruang pada pertumbuhan
selanjutnya.
a. Suspensi sel
Tahapan dari suspensi sel meliputi:
- Kalus dipotong kecil-kecil dan dimasukkan dalam tabung erlenmeyer yang brisi
media cair dengan penambahan enzim untuk memisahkan agregat sel menjadi sel
tunggal
 - Tabung lalu digojog dengan orbital shaker berkecepatan 80 rpm selama seminggu
- Media kemudian disaring sehingga sel yang terpisah akan lolos dari saringan dan
diperoleh suspensi sel murni
- Suspensi sel ditumbuhkan pada medium baru, digojog selama 6-8 jam sampai
terbentuk agregat sel kompak
- Dilakukan pengadukan kultur sel pada bioreaktor dengan kecepatan 100 rpm
b. Elisitasi Dengan Prekursor Jalur Ptox Dan Phytohormone MeJA
Senyawa pertahanan tanaman secara umum dapat diklasifikasikan sebagai senyawa
konstitutif terakumulasi atau senyawa diinduksi seperti phytoalexins. Meskipun
akumulasi PTOX di P. hexandrum belum dikaitkan dengan manfaat khusus yang
diberikan untuk tanaman, akumulasi PTOX adalah konstitutif dan telah dilaporkan
bervariasi dalam konten sesuai dengan ketinggian dan usia tanaman seperti yang dibahas
di bagian awal kami tentang konten PTOX. Namun, feeding kultur sel P. hexandrum
dengan hanya coniferin menyebabkan 12,8 kali lipat peningkatan dalam konten PTOX,
sementara penerapan prekursor PTOX jalur lain atau jalur fenilpropanoid presursors
seperti fenilalanin, tirosin, asam sinamat, asam caffeic, asam coumaric, dan asam ferulat
Untuk kultur sel P. hexandrum tidak menghasilkan peningkatan yang dapat diandalkan
pada PTOX. Pemberian kultur suspensi sel akar dari P. hexandrum dengan coniferyl
alcohol yang dikomplekskan dengan ß-Cyclodextrin untuk meningkatkan ketersediaan
prekursor di dalam sel juga menghasilkan peningkatan kandungan PTOX. Dalam
penelitian kami sebelumnya, kultur suspensi sel dari P. hexandrum dari kalus yang
diturunkan dari daun menghasilkan konsentrasi 10-100 μM dari phytohormon MeJA,
menghasilkan akumulasi 8-8 kali lipat dari PTOX setelah 9 hari pematangan.
 Gambar : rancangan biosintesis Podophyllotoxin (PTOX)

4. Keunggulan dan Kelemahan Metode yang Digunakan

a. Keunggulan
Keuntungan dari teknik enzimatik dalam kultur sel primer ialah tingkat keberhasilan
isolasi sel dengan berbagai variasi konsentrasi, kondisi enzimatiknya, serta
konsentrasi kalsium dalam medianya. Selain itu, pada teknik ini dapat dilakukan
manipulasi fisikokimia (seperti suhu, pH, tekanan osmotik, kadar O2 dan CO2), serta
 manipulasi lingkungan fisiologis (seperti hormon dan konsentrasi nutrien) di mana
sel berkembangbiak.
b. Kelemahan
Kelemahan dari metode ini yaitu :
1) Feeding kultur sel P. hexandrum dengan prekursor fenilalanin, tirosin, asam
sinamat, asam caffeic, asam coumaric dan asam feruulat tidak menghasilkan
peningkatan yang signifikan bila dibandingkan dengan feeding kultur sel dari
coniferin.
2) Melalui manipulasi bioteknologi terhadap kultur sel atau keseluruhan tanaman
juga saat ini tidak dimungkinkan karena kurangnya pengetahuan mengenai jalur
PTOX yang lengkap.
3) Lokalisasi enzim yang digunakan pada metode ini atau tempat fungsional
biosintesis PTOX di P. hexandrum belum dikonfirmasi sampai saat ini. Selain itu,
identifikasi berbeda isoforms enzim dalam jalur PTOX telah menghasilkan
ambiguitas dalam memastikan mana dari isoform yang secara khusus berfungsi
dan mengatur biosintesis ptox.