ISOLASI

DAN
PEMISAHAN PROTEIN

Pendahuluan

Protein adalah molekul organik yang terbanyak di dalam sel. Lebih dari 50% berat kering
sel terdiri atas protein. Selain itu, protein adalah biomolekul yang sesungguhnya,
karena senyawa ini yang menjalankan berbagai fungsi dasar kehidupan, antara lain
proses berkontraksi melakukan gerak, menjalankan berbagai proses metabolisme dalam
bentuk enzim. Protein dapat pula berperan membawa informasi dari luar ke dalam sel dan
di dalam bagian-bagian sel sendiri. Protein juga mengendalikan dapat tidaknya, serta
waktu yang tepat untuk pengungkapan informasi yang terkandung di dalam DNA, yang
diperlukan untuk sintesis protein itu sendiri. Jadi secara tidak langsung protein mengatur
perbanyakan diri sendiri dengan mengatur DNA, yang merupakan alat perekam informasi
untuk protein, sehingga dengan demikian operasinya di bawah kendali protein.

Secara kimia, protein adalah heteropolimer dari asam-asam amino, yang terikat satu
sama lain dengan ikatan peptida. Ada suatu universalisme di dalam molekul protein.
Protein apapun dan berasal dari makhluk apapun juga ternyata hanya tersusun dari
20 macam asam amino saja. Perbedaan protein yang satu dengan yang lain disebabkan
oleh jumlah dan kedudukan asam-asam amino tersebut di dalam tiap-tiap molekul. Kedua
puluh asam-amino itu mempunyai ciri umum sebagai berikut. Pertama, semuanya
mempunyai konfigurasi L. Kedua, sama-sama mempunyai 1 gugus COOH dan 1 gugus
NH2 yang terikat ke atom C . Perbedaan individual dari asam-asam amino ini disebabkan
oleh perbedaan rantai samping. Yang menyebabkan perbedaan kimia antara asam-asam
amino tersebut, pada gilirannya akan menyebabkan perbedaan sifat kimia dan biologis dari
molekul protein yang disusunnya. Rantai samping R ini tidak ikut membentuk ikatan
peptida. Muatan suatu protein dalam suatu larutan ditentukan oleh gugus NH2 bebas di
suatu ujung dan gugus COOH bebas di ujung yang lain serta jumlah rantai yang
bermuatan.
Molekul protein, melalui ikatan hidrogen, berinteraksi dengan molekul air membentuk
mantel air. Karena molekulnya besar, di dalam air protein membentuk larutan koloid.
Adanya sejumlah elektrolit dengan konsentrasi encer sanat meningkatkan kelarutan suatu
protein (salting in). Sifat ini, yaitu kelarutan dalam bentuk larutan koloid yang dipermudah
oleh mantel air dan elektrolit encer, dimanfaatkan untuk pemisahan protein. Selain itu, sifat
lain, yaitu ukuran molekul yang berbeda sebagai akibat dari jumlah asam amino yang
menyusun dan muatan yang tidak sama antar protein yang satu dengan yang lain karena
perbedaan jenis asam amino yang menyusunnya, menjadi dasar dari pemisahan protein
yang akan dilakukan pada praktikum berikut ini.

Tujuan Praktikum :
1. Mengenal reaksi umum berdasarkan adanya beberapa ikatan peptida pada suatu
protein dan mampu menggunakannya untuk melacak protein dalam suatu bahan
2. Melakukan pemisahan suatu protein dari kelompok protein lain secara reversibel
dengan menggunakan larutan garam divalen konsentrasi tinggi (salting out) dan
menerangkan mekanisme pemisahan tersebut.
3. Melakukan pemisahan protein secara reversibel, dengan menggunakan bahan
higroskopis dan menerangkan mekanisme pemisahan tersebut.
4. Melakukan pemisahan protein secara denaturasi ireversibel dengan menggunakan
pereaksi alkaloid, menerangkan mekanisme kerjanya dan mampu menggunakan
untuk melacak protein.
5. Memperlihatkan kemampuan logam berat dalam mengendapkan dan mendenaturasi
protein dan menjelaskan masalah yang ditimbulkan oleh logam berat sebagai
pencemar lingkungan.
 6. Mengetahui cara pemisahan suatu protein dari protein lain ataupun senyawa lain,
berdasarkan perbedaan berat molekul, dengan menggunakan cara kromatografi gel
penyaring molekul sederhana.

Percobaan Protein

1. Uji Biuret

Tujuan :
Memperlihatkan bahwa protein mempunyai ikatan peptida yang bereaksi positif dengan uji
biuret. Reaksi ini tidak terjadi pada makromolekul lain.

Dasar :
Ikatan-ikatan peptida yang menyusun protein dan polipeptida, dalam larutan bersuasana

alkali akan berwarna lembayung bila direaksikan dengan Cu++.

Bahan dan Pereaksi :

1. Larutan albumin atau putih telur
2. Air liur
3. Larutan pati 1%
4. NaOH 10%
5. Larutan CuSO4 0,1%

Cara Kerja dan Hasil :

Menyiapkan 4 tabung reaksi yang bersih. Mempipetkan ke dalam tabung reaksi, seperti
pada tabel 1.

Tabel 1. Prosedur Reaksi biuret

 Tabung 1 2 3 4
Larutan albumin (putih telur) 1 mL - - -
Air liur - 1 mL - -
Larutan pati - - 1 mL -
Air suling - - - 1 mL
NaOH 10% 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL
Larutan CuSO4 * 1 tetes 1 tetes 1 tetes 1 tetes
Warna lembayung Ya Tidak Tidak Tidak

* Bila belum terbentuk warna lembayung, CuSO4 dapat ditambahkan lagi, sampai 10 tetes.

Kesimpulan :
Dari hasil percobaan diatas, dapat disimpulkan bahwa larutan yang bereaksi positif dengan
menghasilkan warna ungu melalui uji biuret adalah larutan albumin. Uji biuret positif
terhadap larutan yang mengandung mengandung protein, namun negatif pada larutan yang
tidak mengandung protein.

Jawaban Pertanyaan :
1. Ya, uji ini akan positif terhadap asam amino yang mengandung protein dengan
memiliki ikatan peptida.
2. Asam amino yang menyusun protein antara lain : Glisin, Alanin, Valin, Leusin,
Isoleusin, Fenilalanin, Metionin, Prolin, Triptofan, Serin, Treonin, Tirosin, Asparagin,
Glutamin, Sistein, Aspartat, Glutamat, Arginin, Lisin, Histidin.
3. Pengelompokan asam amino : Simple dan Conjugated.
4. Asam Amino esensial adalah asam amino yang dibutuhkan oleh tubuh tapi tidak
diproduksi oleh tubuh. Contohnya : Arginin, Histidin, Isoleusin, Methionin,
Phenylalanine, Threonin, Triptofan, Valin, Leusin. Sedangkan asam amino non esensial
adalah asam amino yang tidak begitu dibutuhkan oleh tubuh. Contohnya :
Hydroxiproline, Hydroxilisine, Glysine, Proline, Serin, Tyrosin, Aspargin, Glutamat,
Glisin, Cystein, Alanine.
 2. Pengendapan Protein Dengan
Larutan Garam Konsentrasi Tinggi
(Salting Out)

Tujuan :
Memperlihatkan bahwa sebgai makromolekul yang larut dalam bentuk larutan koloid,
protein dapat dopisahkan satu dari yang lain, dengan menggunakan larutan garam divalent
konsentrasi tinggi.

Dasar :
Untuk larutan dalam air, suatu molekul harus dapat berinteraksi dengan molekul air
dengan cara membentuk ikatan hidrogen sehingga molekul tersebut tersebar rata
diantara molekul-molekul air. Adanya muatan listrik pada molekul terlarut sangat
membantu kelarutan, karena muatan yang sama saling menjauhi, sehingga agregasi
molekul tidak terjadi.
Protein merupakan makromolekul karena memiliki BM (berat molekul) besar. Pada
umumnya,protein mudah larut dalam air karena protein mempunyai kedua sifat berikut.
Gugus -CO- dan –NH- yang ada pada iktan peptida dapat berinteraksi dengan molekul air
melalui ikatan hidrogen, sedangkan berbagai rantai samping, yang diantaranya ada yang
hidrofilik,bahkan juga bermuatan, sangat mudah berinteraksi dengan molekul air. Selain
itu, muatan listrik yang sama dalam 2 partikel molekul protein yang sama, akan bertolakan,
sehingga membantu meningkatkan kelarutan protein (salting in).
Setiap keadaan yang menyebabkan ditariknya air yang mengelilingi molekul protein,
sangat mengurangi kelarutan protein, sehingga protein mengendap. Larutan garam
berkonsentrasi tinggi bersifat demikian. Selain itu, larutan garam berkonsentrasi tinggi
akan menetralkan muatan listrik, sehingga kelarutan akan makin berkurang.
Oleh karena pengendapan dengan cara ini hanya bersifat menarik air di sekeliling protein,
sedangkan molekul protein sendiri tidak mengalami perubahan kimia, maka perubahan
tersebut bersifat reversible. Kelarutan dan fungsi protein pada umumnya akan pulih
kembali bila dikembalikan ke keadaan semula.
Larutan garam divalent lebih efisien dalam mengendapkan protein, karena di dalam air
garam tersebut akan berdisosiasi menjadi 3 ion, yang masing-masing berinteraksi
sempurna dengan air. Sebagai contoh, globulin dapat diendapkan oleh (NH 4)2SO4
setengah jenuh, sedangkan NaCl baru dapat mengendapkan protein tersebut bila berada
dalam larutan jenuh. Albumin, yang baru akan mengendap oleh (NH4)2SO4 jenuh, tidak
dapat diendapkan oleh NaCl jenuh, kecuali dengan penambahan asam mineral dalam
jumlah yang sangat kecil. Pada gambar 2.1 diperlihatkan mekanisme terjadinya
pengendapan protein oleh garam dalam konsentrasi tinggi.

H O H
O
H H H H
O
O O
R -
R- O
H H
N C N C C + (NH 4)2SO4
NH 3+
R +
O

Protein terlarut

NH3+ COO-
COO- NH3+
NH3+ COO-
COO- NH3+

Protein beragregasi / mengendap

Gambar 1. Pengendapan Protein Dengan Cara Salting Out

Bahan dan Pereaksi :
1. Serum sapi
2. Larutan ammonium sulfat (NH4)2SO4 jenuh

3. Larutan NaOH 10%

4. Larutan CuSO4 0,1%

Cara Kerja dan Hasil :

Menyiapkan 3 tabung reaksi yang bersih dan kering. Melakukan prosedur seperti yang
tertera dalam tabel 2 :

Tabel 2. Percobaan salting out

Tabung 1
Serum sapi 1 ml
Amonium sulfat jenuh : tetes demi tetes 1 ml
Endapan : ada / tidak ada Ada endapan
Pisahkan endapan dengan menyaring
Lakukan uji biuret terhadap:
 Filtrat -
 Endapan +

Kesimpulan :
Protein dapat diendapkan dengan menggunakan garam konsentrasi tinggi melalui proses
salting out. Dengan penambahan ammonium sulfat yang jenuh akan mengendapkan serum
sapi sehingga larutan menjadi bersifat reversibel. Hal ini dikarenakan garam berdivalent
tinggi lebih kuat menarik mantel air daripada protein dalam serum.

Jawaban Pertanyaan :
1. Protein yang mengendap pada penambahan satu volume amonium sulfat jenuh ke
dalam satu volume serum adalah protein Albumin.
2. Yang tidak dapat diendapkan pada percobaan tersebut adalah Globulin.
3. Fungsi Albumin adalah mengikat Ligand, albumin disintesis di hati. Fungsi Protein
dalam darah = sebagai transport dan storage. Contoh : CO2 dan O2 dalam darah /
eritrosit.
4. Alkaptonuria, defisiensi enzim homogentisic acid dioxygenase.Ditandai dengan
perubahan warna urine yang menjadi gelap kalau didiamkan.
 3. Pemisahan Protein Dengan Etanol
Absolut

Tujuan :
Memperlihatkan, bahwa sebagai makromolekul yang larut, protein dapat dipisahkan
dengan mengendapkannya dengan penambahan etanol absolut.

Dasar :
Etanol absolut bersifat sangat kuat menarik air (higroskopis). Penambahan etanol absolut
pada suatu larutan protein, akan menyebabkan molekul air yang berinteraksi dengan
molekul protein melalui ikatan hidrogen ditarik oleh etanol. Akibatnya molekul-molekul
protein beragregasi satu sama lain sehingga mengendap. Bila agregat partikel protein
tersebut dibiarkan bersentuhan dengan etanol untuk waktu yang lama endapan yang
terbentuk tidak dapat dilarutkan lagi sehingga denaturasi yang terjadi irreversibel.
Dengan menggunakan etanol berbagai konsentrasi dan suhu yang rendah, Cohn pada tahun
empat puluhan telah berhasil memisahkan protein serum dalam 5 fraksi, dan fraksi V yang
diperoleh sebagian besar terdiri atas albumin.

Bahan dan Pereaksi :

1) Serum
2) Larutan albumin telur
3) Etanol absolut
4) Larutan NaOH encer
5) Larutan CuSO4

Cara Kerja dan Hasil :

Menyiapkan 3 tabung reaksi yang bersih dan kering. Lakukan prosedur yang tertera pada
tabel 3 :
 Tabel 3. Percobaan Pengendapan Protein Dengan Etanol Absolut

Tabung 1 2
Serum 1 ml -
Larutan albumin telur - 1 ml
Etanol absolut 1 ml 1 ml
Endapan: ada/tidak ada Ada endapan Ada endapan
Pisahkan endapan dengan menyaring
Uji biuret terhadap:
 Filtrat - -
 Endapan + +

Kesimpulan :
Protein dapat dipisahkan dengan mengendapkannya dengan penambahan etanol absolut.
Kemudian dipisahkan antara endapan dan supernatan, lalu dites biuret tetap memberikan
hasil positif. Demikian juga serum dan etanol absolut, ditandai dengan warna ungu.

Jawaban Pertanyaan :
 4. Pengendapan Protein Secara
Denaturasi Ireversibel

A. Pengendapan Dengan Pereaksi

Alkaloid

Tujuan :
Memisahkan protein dengan memisahkannya dengan senyawa yang bereaksi dengan
protein tersebut

Dasar :
“Pereaksi alkaloid” adalah asam-asam organik yang dapat mengendapkan alkaloid serta
protein. Pengendapan terjadi karena alkaloid dan protein mengandung nitrogen trivalen.
Asam trikloroasetat (TCA=tricgloracetic acid ) sering dipakai untuk deproteinisasi
(penyingkiran protein) dari suatu bahan. Asam sulfasalisilat sering dipakai unatuk melacak
ada tidaknya protein dalam urin patologis.

Bahan dan Pereaksi :

1. Serum
2. Asam triklosasetat (TCA: trichlos acetic acid) 10%
3. Asam sulfasalisilat 3%

Cara Kerja dan Hasil :

Siapkan dua tabung reaksi yang bersih dan kering. Lakukan prosedur yang tertera dalam
tabel 4.
 Tabel 4.A.

Pengendapan Protein Dengan Menggunakan Pereaksi Alkaloid

Tabung 1 2
Serum 1 ml 1 ml
TCA 10% 1 ml 1ml
As. Sulfasalisilat - -
Endapan ada / tidak ada Ada Ada

Kesimpulan :
Dari percobaan ini dapat disimpulkan bahwa serum merupakan protein yang mengandung
nitrogen trivalent yang apabila bereaksi dengan TCA atau asam sulfasalisilat akan
mengendap.

Jawaban Pertanyaan :
1. P
2. Urin normal tidak mengandung protein.
3. Proteinuria terlacak pada keadaan :
 Cystinuria. Ekskresi sistin dalam urine meningkat (bisa mencapai 30 x nilai
normalnya). Ekskresi Lysine, Arginine dan Gangguan reabsorpsi asam
amino dari
 Maple Syrup Urine Disease. Kadar Leusin, Isoleusin, Valine dan asam  -
ketonya dalam plasma dan urin meninggi. Defek pada keadaan tidak adanya
atau berkurangnya aktivitas enzim dekarboksilase asam  - keto. Terapinya :
penggantian protein dalam makanan dengan campuran asam amino yang tidak
mengandung Leusin, Isoleusin dan Valin.
 Sistinosis ( = Cystine Storage Disease ). Merupakan gangguan dalam jaringan
dan organ terutama sistem R.E. Biasa disertai amino asiduria dan pasien
biasanya meninggal karena gagal ginjal akut.
 B. Pengendapan protein dengan logam
berat

Tujuan :
Memperlihatkan, bahwa logam berat mengendapkan protein secara denaturasi ireversibel.

Dasar :
Protein bermuatan negatif membentuk garam dengan kation logam berat menjadikan
protein terdenaturasi dan mengendap.

Bahan dan Pereaksi :

1. Putih telur
2. larutan H9CL2 1%
3. Larutan Pb-asetat
Cara kerja dan Hasil :
Siapkan dua buah tabung reaksi, lakukan prosedur yang tertera dalam tabel 4.

Tabel 4.B.

Pengendapan Protein Dengan logam Berat

Tabung 1 2
Putih telur 1 ml 1 ml
H9CL2 Tetes demi tetes -
Pb-asetat - Tetes demi tetes
Endapan ada/tidak ada Ada Ada

Kesimpulan :
Protein apabila bereaksi dengan logam berat maka akan mengendap.

Jawaban Pertanyaan :
1. Ya, pada tiap kali penambahan logam berat selalu diikuti oleh penambahan endapan
protein. Hal ini dikarenakan logam berat mempunyai sifta pendenaturasi protein
dan kandungan kation logam berat akan bereaksi dengan molekul yang bermuatan
negatif yang dapat memicu pembentukan endapan pada protein.
2. Masing-masing dibutuhkan  5 tetes untuk proses pengendapan kedua kation.
3. Logam berat yang menjadi pencemar utama lingkungan adalah Pb dan sumber
pencemaran berasal dari asap kendaraan bermotor. Logam berat ini dapat
membahayakan sirkulasi pernafasan, sehingga terjadi infeksi saluran pernafasan.
 Cystinuria. Ekskresi sistin dalam urine meningkat (bisa mencapai 30 x nilai
normalnya). Ekskresi Lysine, Arginine dan Gangguan reabsorpsi asam
amino dari
 Maple Syrup Urine Disease
4. Hal yang dapat dilakukan bila terjadi keracunan logam berat yang akut adalah
dengan meminum susu untuk menetralisirnya.