Ekstraksi, isolasi dan identifikasi flavonoid dari Chenopodium

bagian udara album

abstrak
Chenopodium album L., (C. album) (keluarga: Chenopodiaceae) adalah semak tahunan yang
banyak ditanam di Asia, Afrika, Eropa dan Amerika Utara. Ini umumnya dikenal sebagai
Bathua (dalam bahasa Hindi), pigweed, ayam gemuk atau lambours. Daun C. album
diterapkan sebagai tapal untuk gigitan serangga, sengatan matahari, sendi rematik dan
sebagai pencahar ringan. Flavonoid yang terkandung dalam C. bagian aerial album diekstraksi,
diidentifikasi dan ditandai. Ekstraksi soxhlet berurutan menjadi sasaran skrining fitokimia
awal dan kuantifikasi flavonoid. Hasil penelitian menunjukkan bahwa hasil maksimum
flavonoid (7,335 mg / g) diperoleh dari ekstrak aseton. Ekstrak aseton ini dikenai kromatografi
flash untuk isolasi flavonoid. Karakterisasi flavonoid yang diisolasi dilakukan oleh UV, IR, 1H &
13C NMR dan MS. Atas dasar struktur analisis kimia dan spektral telah dijelaskan sebagai 2-
(3, 4-dihidroksifenil) -3, 5, 7- trihidroksi-4H-chromen-4-satu, flavonoid.
1. Perkenalan
Polifenol tampaknya menjadi modulator metabolik penting berdasarkan kemampuan mereka
untuk mempengaruhi beberapa jalur seluler dan molekul yang telah dilaporkan sebagai target
potensial untuk senyawa polifenol. Flavonoid adalah "kelompok senyawa polifenol yang
paling umum dalam makanan manusia dan ditemukan di mana-mana dalam tumbuhan ”.
Meskipun lebih dari 4000 flavonoid telah diidentifikasi, beberapa tampaknya merupakan
komponen penting dari banyak buah dan sayuran. Menurut perbedaan dalam kelompok
fungsional dan posisi relatif mereka dari kerangka 15-karbon (aglikon), flavonoid
diklasifikasikan menjadi beberapa subkelompok seperti flavon, flavanon, flavonol,
isoflavonoid, anthocyanidin, dan chalcone.1 Flavonol, bioflavonoid asli seperti quercetin, juga
ditemukan di mana-mana, tetapi dalam jumlah yang lebih sedikit. Flavonoid, subkelas
polifenol, adalah kelompok phytochemical yang merupakan antioksidan paling kuat dan
berlimpah dalam diet kita dan juga memiliki berbagai aktivitas seperti anti inflamasi, anti
kanker, dll.
Chenopodium album L., (C. album) (keluarga: Chenopodiaceae) adalah semak tahunan
yang banyak ditanam di Asia, Afrika, Eropa dan Amerika Utara. Ini umumnya dikenal sebagai
Bathua (dalam bahasa Hindi), pigweed, fathen atau lamb-quarters. Daun album C. diterapkan
sebagai tapal untuk gigitan serangga, sengatan matahari, sendi rematik dan ringan pencahar.
Tanaman ini digunakan dalam pengobatan tradisional di berbagai belahan dunia sebagai
diuretik, pencahar, penenang, hepato-pelindung dan antiparasit. Daun memiliki sifat
anthelmentic, antiphlogistic, antirheumatic, agak pencahar dan odontalgic, diterapkan
sebagai mencuci atau tapal untuk gigitan serangga, sengatan matahari, sendi rematik dan
bengkak feets. Selain itu, rebusan bagian aerosanya dicampur dengan alkohol digunakan
dalam rematik. Asam amino amida., Flavonoid dan apocarotenoids juga telah diisolasi dari
spesies ini. Flavonoid dari C. album memiliki potensi yang signifikan untuk mengais radikal
bebas, penghambatan NF kappa B, anti-inflamasi, dan maka telah mendapat potensi
antirematik. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengisolasi flavonoid menggunakan Flash
Chromatography dan dicirikan melalui spektral mereka. analisis seperti IR, 1H, 13C NMR dan
MS.
2. Bahan dan metode
2.1. Bahan kimia dan obat-obatan standar
Semua bahan kimia dan pelarut yang digunakan adalah kelas analitik, Silica gel (G) 60 F dan
0,25 lembaran aluminium readymade (Merck, Jerman), Rutin dan Quercetin dari SD fine
Chem. Ltd. Mumbai.
2.2. Bahan tanaman dan persiapan ekstrak
Bagian-bagian udara dikumpulkan dari wilayah Ramtek pada bulan Agustus, disahkan oleh Dr.
(Ibu) Alka Chaturvedi, Departemen Botani, R.T.M. Universitas Nagpur, Nagpur. Spesimen
kupon telah disimpan di Herbarium Departemen Botani, dengan nomor koleksi RA 9576.
Bagian udara C.album dikeringkan di bawah naungan dan dihancurkan menjadi bubuk kasar.
Bahan mentah bubuk (1 kg) dihilangkan lemaknya dengan petroleum eter dan kemudian
diekstrak berturut-turut dengan etil asetat, aseton dan metanol menggunakan ekstraktor
Soxhlet diikuti dengan maserasi dingin (7 hari) dengan 50% metanol. Ekstrak dipekatkan
menggunakan rotary vacuum evaporator untuk menghasilkan ekstrak etil asetat (EACA; hasil:
3,9% b / b), ekstrak aseton (ACCA; hasil: 4,79% b / b), ekstrak metanol (MECA; hasil: 13,58 %
w / w) dan 50% ekstrak metanol (HACA; hasil: 12,76% b / b). Ekstrak ini kemudian dikenakan
skrining fitokimia dan estimasi kuantitatif.
2.3. Skrining fitokimia
Ekstrak disaring untuk kehadiran phytochemical yang berbeda menggunakan teknik
kromatografi lapis tipis (KLT). Pelat lapisan tipis yang diawali dengan silika gel G (Merck,
ketebalan 0,25 mm) digunakan. Pengembangan dilakukan dengan sistem pelarut yang
berbeda seperti etil asetat: metanol: air (100: 13,5: 10, v / v / v), etil asetat: asam format:
asam asetat: air (100: 11: 11: 26, v / v / v / v), kloroform: metanol: air (70: 30: 4, v / v / v),
toluena: etil asetat: dietilamina (70:20:10, v / v / v) dan etil asetat: metanol: air: asam asetat
(65: 15: 15: 10, v / v / v / v). Setelah pengembangan kromatogram dalam pelarut, piring
dikeringkan dan disemprotkan dengan reagen AlCl3 untuk mendeteksi flavonoid. Visualisasi
dilakukan di bawah sinar tampak dan UV (l: 366 nm). Estimasi kuantitatif flavonoid dalam
ekstrak EACA, ACCA, MECA dan HACA dilakukan masing-masing.
2.4. Penentuan flavonoid (TFA)
Kandungan flavonoid ditentukan dengan metode aluminium klorida.10 Secara singkat, untuk
1 ml larutan uji (1 mg / ml), 1,5 ml alkohol 95%, 0,1 ml 10% aluminium klorida heksahidrat
(AlCl3.6H2O), 0,1 ml 1 M natrium asetat (CH3COONa) dan 2,3 ml air suling ditambahkan.
Setelah inkubasi pada suhu kamar selama 40 menit, absorbansi campuran reaksi diukur pada
435 nm terhadap blanko yang sesuai, disiapkan dengan cara yang sama tanpa menambahkan
AlCl3. Rutin digunakan sebagai standar referensi dan hasilnya dinyatakan sebagai mg
ekuivalen rutin (RE) / g ekstrak. Semua penentuan dilakukan dalam rangkap tiga.
2.5. Isolasi menggunakan kromatografi flash11
Kromatografi kolom Flash dilakukan pada gel silika bulat, C-18; 40e63 mikron (230e400
mesh), ukuran pori 60Å, rentang pH 6.5e7.5, dalam kolom kaca yang dirancang untuk FCC.
Sorbent Technologies (Atlanta, GA, USA) menyediakan gel silika. Kolom flash kaca secara
manual dikemas kering menggunakan C-18 silika. Setelah kolom dikemas dan dipasang pada
instrumen, volume campuran pelarut awal didorong melalui silika untuk menghilangkan
udara dan untuk mengeringkan dan menyeimbangkan kolom. Sampel (Ekstrak atau fraksi)
sebelumnya triturated dengan tiga kali silika kolom dan dikeringkan ditempatkan di antara
Teflon disk di pemuatan sampel padat peluru. Sampel dimuat kartrid ditempatkan di atas
kepala kolom sebelum elusi. Pecahan dikumpulkan dalam tabung reaksi, diluluskan dengan
volume dan nomor pecahan. Berbagai kondisi kromatografi flash yang digunakan untuk
pemisahan senyawa disebutkan pada Tabel 1.
2.6. Karakterisasi gabungan
Untuk karakterisasi senyawa UV, IR, NMR dan Spektrum massa dilakukan. Penyerapan UV dari
konstituen terisolasi ditentukan dalam metanol selama rentang pemindaian 200e800 nm.
Senyawa dilarutkan dalam metanol untuk memperoleh konsentrasi yang diperlukan dan
spektrum dicatat. Spektrum serapan inframerah dari konstituen yang terisolasi sebagai KBr
disc telah ditentukan pada FTIR-8101A (Shimadzu) dan puncak serapan dalam bentuk nomor
gelombang (cm? 1) dicatat. Spektrum 1H NMR diperoleh pada spektrometer Bruker DSX-300,
menggunakan program pulsa standar ‘lc1pnf2’, yang didasarkan pada versi satu dimensi dari
urutan NOESY dan memungkinkan pra-saturasi ganda, untuk menekan puncak air. Titik data
32k direkam di atas lebar sapuan 9191 Hz, dengan 512 scan. Perluasan garis eksponensial 1
Hz dikenakan pada akumulasi data sebelum transformasi Fourier. Percobaan NMR 13C
diperoleh pada 400,23 MHz pada Bruker Biospin Ultrashield ditambah instrumen AV-400
MHz. Sampel dilarutkan dalam metanol terdeuterasi. Spektroskopi massa dari konstituen
yang terisolasi dilakukan menggunakan spektrometer massa TOF MS ES dan eksperimen
diperoleh dengan menggunakan teknik LIFT potensial berdasarkan percepatan pasca-
peluruhan dan pasca-kerusakan dari fragmen ion. Spektra MS dianotasikan menggunakan
perangkat lunak Analisis Flex dan ditransfer ke BioTools untuk evaluasi urutan. Spektrometer
dioperasikan dalam mode refleksi yang dioptimalkan untuk ion positif dengan massa dari 0
hingga 2000 Da dengan tegangan percepatan 25 kV. Frekuensi pemadaman laser nitrogen
ditetapkan pada 10 Hz. Kekuatan laser dioptimalkan untuk mendapatkan rasio signal-to-noise
yang baik setelah rata-rata 100 sinyal-shot spectra. Spektrum massal diperoleh di National
Institute of Pharmaceutical Education & Research, Kolkata, India.
3. Hasil dan Pembahasan
3.1. Skrining fitokimia
Skrining fitokimia ekstrak EACA menunjukkan adanya tanin, sterol dan flavonoid, sementara
ekstrak ACCA mengungkapkan keberadaan terutama protein, tanin dan flavonoid. Lebih
lanjut, ekstrak MECA dan HACA juga menunjukkan adanya protein, karbohidrat, tanin,
saponin dan flavonoid.
3.2. Penentuan flavonoid
Kandungan flavonoid (mg / g) ditentukan oleh persamaan regresi dari kurva kalibrasi (y ¼
0,018x - 0,001, r2 ¼ 0,990) dan dinyatakan dalam kesetaraan rutin (RE) dan ditemukan dalam
urutan menurun dari ACCA. > HACA> EACA> MECA.

3.3. Flash isolasi kromatografi flavonoid

Dalam penelitian ini untuk pemisahan molekul bioaktif, ekstrak kaya Flavonoid dari C. album
mengalami kromatografi flash otomatis pada ISCO-combiflash (Teledyne Isco, Inc.Nebraska,
USA). Untuk pemisahan fase terbalik, pemilihan fase gerak dan optimalisasi profil gradien
dilakukan oleh memilih fase gerak yang digunakan untuk HPLC untuk pemisahan kelas spesifik
dari senyawa atau tanaman yang sedang diselidiki, dan meningkatkan waktu elusi gradien
dengan faktor fase gerak RP-TLC 4 atau 5.12e14 adalah penggunaan terbatas karena buruknya
keterbasahan lempeng . Namun, untuk pemisahan pemisahan fasa pemisahan yang normal
pada silika gel, fase gerak dipilih secara trial-and-error untuk memberikan nilai Rf dari
Senyawa antara 0,5 dan lebih dari 0,1. Jadi tergantung pada fase kebalikan atau pemisahan
fasa yang normal, fase bergerak yang berbeda dipilih. Pemisahan pemisahan kromatografi
fase balik reverse dari ekstrak ACCA menghasilkan pemisahan senyawa tunggal, yang
direpresentasikan sebagai puncak 1 dalam kromatogram flash (Gbr.1). Puncak 1 (P1)
dikumpulkan sebagai fraksi 3e9; fraksi ini dikumpulkan bersama dan terkonsentrasi di bawah
vakum. Pada pengeringan, puncak 1 menghasilkan serbuk berwarna kuning (13 mg),
memberikan tes positif untuk flavonoid. Parameter metode kromatografi flash yang
digunakan tercantum pada Tabel 1. Senyawa serbuk berwarna kuning telah diberi nama kode
ACCA 1. Senyawa bubuk berwarna kuning pucat adalah diperoleh setelah pemurnian dan titik
lebur 312e315? C. Spektrum UVspectra, IR, Massa dan 13C dan proton NMR direkam.
3.4. Identifikasi dan analisis spektral dari flavonoid yang terisolasi
Spektrum UV dari senyawa ACCA-1 menunjukkan spektral maxima pada 373 nm dan 256 nm
dan lmax ditemukan menjadi 373 nm. Spektrum UV-Vis khas flavonoid termasuk dua pita
serapan. Band A terletak pada kisaran 310e350 nm untuk flavon, sedangkan untuk flavonol
adalah antara 350 dan 385 nm. Band B, ditemukan dalam kisaran 250e290 nm.15 Jadi
spektrum UV menunjukkan bahwa senyawa tersebut mungkin termasuk kategori flavonol
flavonoid. Akibatnya, kedua subkelompok ini tidak dapat dibedakan dengan analisis UV-Vis
sederhana. Flavonol menunjukkan absorbansi maksimum pada non panjang gelombang
spesifik antara 270 dan 290 nm, di mana banyak phenolic menyerap, sehingga tidak
memungkinkan deteksi selektif mereka (Gbr. 2). Spektrum UV / Vis yang diperoleh juga sesuai
dengan spektrum UV spektrum Quercetin yang dipublikasikan.16 Spektrum spektrum IR
memuncak pada 3624, 3473, 3295 cm? 1 (OH), 1616 cm? 1 (Aromatik C] C Bend), 1458 cm?
1, (CH2 dan CH3; RCH2CH3), 1165 cm? 1 (C-CO-C Peregangan dan lentur di Ketone), Puncak
mengungkapkan jumlah kelompok fungsional dan sifat ikatan. 1H NMR spektra ACCA-1
menunjukkan puncak pelarut mengamati pada d 5.1.
Singlet peak at d 6.20 dan 6.40 menunjukkan proton H-6 dan H-8 flavonol. Puncak doublet
lain pada d 6.89 dan 6.91 mengindikasikan adanya proton H-50 dari flavonol. Puncak pada
jam 7.59 hingga 7.66 menunjukkan proton H-20 dan H-60 flavonol (Gbr. 3). Sementara
spektrum C13 NMR mengungkapkan Sinyal pada 175,92 ppm mengindikasikan karbon
karbonil (C-4) pada posisi medan rendah normal. Sinyal lain di 164.14, 161.08, 156.80 dan
158.30 ppm menunjukkan C-7, C-5, C-40 dan C-30 posisi flavonol karbon. Singlet di 147,35
dan 146,60 ppm dikaitkan untuk C-20 dan C60 posisi karbon, sinyal pada 135,85 ppm
mengindikasikan karbon aromatik oksigen C-3. Sinyal lain pada 122,73 ppm mengindikasikan
atom karbon C-1 dari flavonol. Sinyal di 114,82, 114,58 ppm menunjukkan posisi C-1 dan C-
10 dari atom karbon yang tidak mengandung oksigen. Sinyal pada 103,11 ppm menunjukkan
posisi karbon C-10. Sinyal lain pada 97,83 dan 93,06 ppm mengindikasikan posisi karbon C-6
dan C-8. (Gbr. 4).
Spektrum TOF MS ES of dari senyawa terisolasi ACCA 2 dilakukan dalam mode ion positif dan
puncak ion molekul diamati pada m / z 303,12 (M þ H) þ (Gambar 5). Berat molekul senyawa
adalah 302.12. Sementara fragmen pada m / z 325 mewakili (M þ Na) þpeak. Fragmen lain
diamati pada m / z 287, 196, 149. Fragmen pada m / z 287 (Sesuai dengan 285 m / z) adalah
(M þ HH2O) þmenunjukkan hilangnya satu molekul air atau (M þ H) þ produk ion mengalami
dehidrasi hingga (M þ H-H2O) þ.16 Puncak fragmen pada m / z 196 (Sesuai dengan 193 m / z)
mewakili (M þ HB-ring) ,ion, mengkonfirmasi dihidroksi-pengganti A-ring. Fragmen pada m /
z 149 menunjukkan bahwa reaksi cincin C menghasilkan fragmen 1, 3B þ yang dengan m / z ¼
149. (B mewakili cincin utuh sementara superskrip di sebelah kiri menunjukkan ikatan yang
rusak dari molekul terprotonasi) 15 , 17 dan fragmen lainnya di 365, 413 dan 467 adalah hasil
dari beberapa formasi adduct. Penentuan spektral massa dan Identifikasinya dilaporkan pada
Tabel 2 dan Gambar. 6. Menyimpulkan studi yang telah disebutkan di atas, dianalisis bahwa
tanaman yang diteliti mengandung flavonoid. Skrining fitokimia senyawa yang diisolasi
menyarankannya menjadi molekul flavonoidal. TLC dengan standar juga dilakukan dan itu
menunjukkan nilai Rf yang sama. Titik leleh senyawa terisolasi sama dengan Quercetin. Dari
senyawa data spektral yang diisolasi adalah kemiripan dengan Quercetin.

Ekstrak disaring untuk kehadiran phyto kimia yang berbeda dengan menggunakan teknik
kromatografi lapisan tipis (TLC). Pelat lapisan tipis yang didahului dengan silika gelG (Merck,
ketebalan 0,25mm) digunakan. Pengembangan dilakukan dengan
sistem pelarut seperti etilasetat: metanol: air (100: 13,5: 10,
v / v / v), ethylacetate: formicacid: aceticacid: water (100: 11: 11: 26,
v / v / v / v), kloroform: metanol: air (70: 30: 4, v / v / v), toluene: etil
acetate: diethylamine (70: 20: 10, v / v / v) dan etilasetat: metanol:
air: aceticacid (65: 15: 15: 10, v / v / v / v) .Setelah pengembangan
kromatogram dalam pelarut, piring dikeringkan dan disemprotkan
dengan Dragendorff, AlCl3, hydroxylamine-ferricchloride, ninhidrin
dan reagen trichloride antimon untuk mendeteksi alkaloid,
flavonoid, lakton / ester, protein / asam amino, sterol tak jenuh
dan triterpene secara bijak. Deteksi thraquinones, saponin,
tanin, karbohidrat dan / atau glikosida dilakukan menggunakan KOH,
anisaldehyde-sulphuricacid, ferricchloride dan naphthoresorcinol
reagen masing-masing. Visualisasi dilakukan undervisibleand
Sinar UV (λ: 366nm). Metabolit sekunder yang penting seperti
polifenol total, flavonoid dan flavonon dikuantifikasi di EACA,
ACCA, MECA dan HACA ekstrak masing-masing.