Journal Phytochemistry 140 (2017) 45-51

Isolasi Fenolik Antioksidan

dari Schinopsis brasiliensis
Berdasarkan profil LC-MS

FARIDAH TSURAYA
01311750010003

Program Pascasarjana
Departemen Biologi
Institut Teknologi Sepuluh Nopember
Surabaya
2017
1. Pendahuluan
Schinopsis brasiliensis Engl. adalah tanaman golongan Anacardiaceae, hidup pada habitat
arboreal, dengan tinggi kurang lebih 15 m. Tanaman ini merupakan tanaman asli Brasil pada hutan
Caatinga dan Atlantik. Daun, buah, dan terutama kulit kayu pada tanaman ini digunakan dalam
pengobatan tradisional seperti pengobatan untuk peradangan, influenza, batuk, diare, disentri, dan
sebagainya. Daun dan ekstrak kulit kayu dari S. brasiliensis memiliki aktivitas antioksidan dan
antimikroba, sedangkan ekstrak kulit batang digunakan untuk pestisida.
Penelitian sebelumnya menyatakan bahwa daun S. brasiliensis mengandung senyawa tanin
dan polifenol, seperti metil gallate, asam gallic, turunan asam ellagic dan flavonoid. Pada ekstrak
dengan MeOH pada batang terkandung biflavonoid dan chalcone, sedangkan dari kulit kayu terdapat
alkil fenol dan turunan steroid. Tujuan penelitian ini adalah untuk memvalidasi beberapa aktivitas
biologis pada S. brasiliensis.

2. Metodologi

2.1 Instrumen
 Identifikasi senyawa dilakukan dengan pengukuran IR menggunakan spektrometer Bruker IFS-
48 dan pengukuran UV menggunakan spektrofotometer UVevisible.
 Percobaan NMR menggunakan spektrometer Bruker DRX-600 dan 2D-NMR (DQF-COZY, HSQC,
dan HMBC). Data NMR diproses menggunakan TOPSPIN 3.2 software.
 Pemisahan HPLC dilakukan pada waters 590 sistem yang dilengkapi dengan detektor indeks bias
waters R401, Kolom Waters XTerra Prep MSC18 (300 x 7,8 mm i.d.), dan Injektor Rheodyne.
 Spektrum HRESIMS dilakukan oleh LTQ Orbitrap XL mass spectrometer dalam mode ion negatif.

2.2 Bahan Tumbuhan

 Kulit kayu Schinopsis brasiliensis Engl. (Anacardiaceae) dikumpulkan pada Februari dan Agustus
2014 di musim panas dan musim dingin
 Di kota Piranhas, Alagoas, Brazil, dengan koordinat GPS (935054.3700 S and 3746008.3100 W).
 Identifikasi dilakukan oleh ahli Biologi, Marta Maria Cristina Farias dan specimen (24442 ASE)
disimpan di herbarium Department of Biology , Federal University of Sergipe.

2.3 Ekstraksi
 Kulit kayu S. brasiliensis (4 Kg) dikeringkan pada suhu ruang, dijadikan bubuk dan diekstraksi
menggunakan ethanol-air (9:1) selama 5 hari.
 Disaring dan diuapkan dari pelarutnya sampai kering dalam vacum, diperoleh 420 g ekstrak
hydralcoholic.

2.4 Penentuan Jumlah Total Fenol

 Ekstrak etanol dilarutkan pada MeOH untuk mendapatkan konsentrasi 0.5 mg/mL. Folin-
Ciocalteu phenol reagent (0.5 mL) ditambahkan ke tabung sentrifuse yang mengandung 0.5 mL
ekstrak.
 Konten dicampurkan, dan 1 mL sodium carbonate jenuh ditambahkan pada masing-masing tube,
sampai volumenya 10 mL dengan distilled water.
 Konten dilarutkan dengan vortex, dalam suhu ruang,selama 45 min (sampai berwarna blue) dan
disentrifugasi pada 3000 rpm selama 5 menit.
 Absorbansi supernatant diukur pada 517 dengan UVevisible spectrophotometer.
 Kontrol tanpa reagen FC and blank dengan methanol dimasukkan pada assay.
 Total konten fenol dihitung setara dengan gallic acid, dihitung dengan kurva kalibrasi (y ¼
0.0027xþ0.0982 R2 ¼ 0.9929).

1
2.5 Aktivitas Antioksidan (Uji TEAC)

 Nilai TEAC berdasarkan kemampuan antioksidan untuk mencari kation radikal 2,20-azinobis(3-
ethylbenzothiazoline-6-sulfonate) ABTS dengan analisis spectrophotometric.
 Penambahan 1,5 mL ABTS yang diencerkan dengan 15 mL larutan sampel.
 Aktivitas antioksidan dibandingkan dengan aktivitas TEAC

2.6 Analisis LC-ESI (Orbitrap) MS

LC MS merupakan teknik kimia analitik yang menggabungkan kemampuan pemisahan fisik
dari kromatografi cair (HPLC) dengan kemampuan analisis massa spektrometer massa. Senyawa
dipisahkan atas dasar interaksi relatif dengan lapisan kimia partikel (fase diam) dan elusi pelarut
melalui kolom (fase gerak). Komponen elusi dari kolom kromatografi kemudian diteruskan ke
spektrometer massa melalui antarmuka khusus. Sumber ion untuk LC MS adalah ESI (ionisasi
elektrospray) yang merupakan metode yang menghasilkan semprotan tetesan (droplet) dalam
medan listrik.
Pada penelitian ini digunakan HPLC dilengkapi spektrometer massa LTQ-Orbitrap XL. Kerja
HPLC prinsipnya adalah pemisahan analit-analit berdasarkan kepolarannya yang terdiri atas kolom
(fase diam), dan larutan tertentu sebagai fase gerak. Gradien elusi dilakukan dengan menggunakan
asam format 0,1 % sebagai eluen A dan asetonitril sebagai eluen B.

2.7 Prosedur Isolasi

 Ekstrak hidroalkohol dikeringkan dengan vacum dan 3 g difraksinasi dengan kolom Sephadex
LH-20 , menggunakan MeOH sebagai fase gerak, memberikan 91 fraksi (8 mL), dan dimonitor
dengan TLC. Gel sephandex (LH 20) merupakan adsorben dalam pemisahan flavonoid dimana
dirancang untuk digunakan pelarut organik.
 Fraksi dikromatografi dengan HPLC semipreparative untuk 91 fraksi.

2.8 Analisis spektroskopi IR, NMR, HRESIMS

Spektroskopi digunakan untuk identifikasi senyawa.

2.9 Hidrolisis Asam

Hidrolisis jaringan tumbuhan dengan suasana asam membebaskan sejumlah asam fenolat
yang larut dalam eter. Campuran senyawa 8 (5 mg), 10 (3 mg), 11 (3 mg), 12 (3 mg) dan 14 (5 mg)
dipanaskan pada suhu 60 ° C dengan HCl-dioksan (3 mL) selama 2 jam, lalu diuapkan dalam vakum.
Larutan diekstrak dengan CH2Cl2-H2O, dan lapisan H2O dinetralisir dengan Amberlite MB-3. Lapisan
H2O kemudian dipekatkan dan dilewatkan melalui kolom silika gel, menggunakan CHCl3-MeOH-H2O
untuk mendapatkan glukosa.

2.10 Sel Kanker

Karsinoma basal alveolar manusia (A549 dan sel HeLa (human epitheloid cervix carcinoma),
dikultur dalam media DMEM yang dilengkapi dengan serum janin bovine 10% (Invitrogen), 1%
penisilin / streptomisin dan 2 mM L-glutamin.

2.11 Analisis Viabilitas Sel

Sel A549 (5x103), dan sel Hela (5x103) diletakkan pada 96 well dan diinkubasi selama 48 jam
dengan senyawa 1-16 (pada konsentrasi 12,5, 25, 50, 100 mM). Kelayakan sel ditentukan dengan
MTT assay untuk mendeteksi mitokondria fungsional dalam sel hidup. 25 ml MTT (5 mg /mL)
ditambahkan ke masing-masing well dan sel-sel diinkubasi selama 3 jam. Setelah itu, sel dilisis
dengan 100 ml larutan mengandung 50% N, N-dimetilformamida dan 20% SDS (pH 4.5). Optikal
densitas (OD) dari masing-masing well diukur dengan mikroplate spektrofotometer.

2
3. Hasil dan Pembahasan
Ekstrak etanol kulit batang S. brasiliensis yang dikumpulkan di Musim panas menunjukkan
kandungan total fenol yang tinggi dan setara dengan asam galat (403.26 mg GAE / g ekstrak).
Sehingga dapat dilakukan metode fraksinasi, pemurnian, dan uji-uji biologis lainnya.
Radikal bebas merupakan suatu atom atau molekul yang mempunyai elektron tidak
berpasangan, sehingga mempunyai sifat tidak stabil, paramagnetik, dan sangat reaktif. JIka radikal
bebas ini sudah terbentuk di dalam tubuh, maka akan terjadi reaksi berantai dan menghasilkan
radikal bebas baru yang pada akhirnya jumlahnya akan terus bertambah. Radikal bebas dalam tubuh
akan sangat reaktif dan dapat merusak komponen-komponen sel, sehingga dapat menyebabkan
penyakit berbahaya seperti kanker dan kardiovaskular. Oksidan atau radikal bebas melibatkan
senyawa oksigen reaktif (ROS), seperti radikal hidroksi, peroksida, hidroksi peroksida, dan lain
sebagainya.
Senyawa fenolik umumnya mempunyai aktivitas antioksidan. Semakin banyak gugus hidroksi
yang terikat pada cincin aromatis akan semakin tinggi pula aktivitas antikosidannya. Pada penelitian
ini digunakan salah satu metode menguji aktivitas antikosidan suatu senyawa, yaitu dengan uji TEAC.
Ekstrak etanol kulit batang S. brasiliensis diuji dengan TEAC menghasilkan aktivitas yang signifikan
pada scavenging radikal bebas (3,04 mg / mL). Produksi scavenging reaktif oksigen (ROS) atau
nitrogen (RNS) spesies telah ditunjukkan untuk pengembangan beberapa penyakit berbahaya.
Polifenol mampu bereaksi langsung dengan ROS dan RNS dan dapat mencegah agar tidak mencapai
tingkat intraseluler yang berbahaya.

Analisis LC-ESIMSn dalam mode ionisasi negatif ekstrak etanol kulit batang S. brasiliensis
menunjukkan adanya enam belas puncak.

3
 Untuk menjelaskan secara jelas struktur senyawa-senyawa oleh percobaan NMR, ekstrak
etanol dimurnikan dengan size exclusion kromatografi, dilanjutkan dengan tahap pemurnian lebih
lanjut oleh fase terbalik HPLC-RI, untuk mendapatkan enam belas senyawa. Struktur tersebut
dibentuk oleh eksperimen 1D dan 2D-NMR dengan analisis ESIMS dan HRESIMS (Gambar 2).

4
 Perbandingan dengan data NMR yang dilaporkan dalam literatur memungkinkan kami
mengidentifikasi senyawa yang dikenal sebagai asam gallic 4-O-β-D-glucopyranoside (1) (Fotiric Aksic
et al., 2015), asam gallic 4-O-β-D- (60-Ogalloyl) - glukopiranosida (2) (Lee et al., 2011), nikoenosida
(3) (Meng et al., 2010), etil-O-β-D- (60-O-galloyl) -glucopyranoside (4) (Kang et al., 2008), 4-hidroksi-
3-methoxyphenol-1-O- (60-O-galloyl) - β-D-glukopiranosida (5) (Shi et al., 2010), 4-hidroksi-2-
methoxyphenol-1-O-β-D- (60-O-galloyl) glukopiranosida (6) (Saijo et al., 1989), asam 3,4-di-O-galloyl-
quinic (7) (Zhu et al., 2012), catechin (9) (Benavides et al., 2006), 4,9-dihydroxypropiophenone- 9-O-
β-D-glukopiranosida (13) (Meng et al., 2010), 4-hidroksi-2- methoxyphenol-1-O-β-D-glucopyranoside
(15) (Shi et al., 2010) dan schizandriside (16) (Kim et al., 2012).

Profil kualitatif Ekstrak S. brasiliensis diuji apakah dipengaruhi oleh perubahan musim.
Ekstrak etanol dari kulit batang yang dikumpulkan di musim dingin. Namun, tidak adanya perubahan
profil kualitatif di ekstrak musim dingin. Hal ini membuktikan bahwa musiman bukanlah faktor yang
mempengaruhi terjadinya unsur kimia tanaman. Aktivitas antioksidan senyawa 1-16 diuji oleh Uji
TEAC. Hasilnya menunjukkan bahwa sebagian besar senyawa (2, 5-7, 10 dan 12) menunjukkan
scavenging radikal bebas yang lebih tinggi aktivitasnya dari kuersetin 3-O-glukopiranosida. Senyawa
8, 10-12 dan 14 yang tidak pernah diteliti sebelumnya juga menunjukkan aktivitas scavenging radikal
bebas yang baik di kisaran 1.10-1.86 mM.
Aktivitas sitotoksik senyawa 1-16 yang sudah didapatkan tersebut diuji pada dua macam sel
kanker, A549 dan Hela, oleh metode MTT kadar logam. Tidak terdapat senyawa dalam kisaran
konsentrasi antara 12,5 dan 100 mM yang dapat menyebabkan penurunan jumlah sel kanker secara
signifikan.