BAB IV

METODOLOGI PENELITIAN

4.1 Jenis Penelitian

Jenis penelitian ini adalah penelitian true experimental design. Disebut

demikian karena peneliti dapat mengontrol kemungkinan munculnya semua

variabel luar yang dapat mempengaruhi proses, dan hasil penelitian. Hal ini

menyebabkan validitas internal dan validitas eksternal penelitian menjadi tinggi

(Sudibyo, 2013).

4.2 Rancangan Penelitian

Rancangan penelitian adalah rancangan randomised post test only control

design. Jenis rancangan ini adalah memilih kelompok penelitian yang dilakukan

secara acak baik kelompok kontrol maupun kelompok perlakuan, setelah dipilih

maka kelompok perlakuan dilakukan manipulasi dan kelompok kontrol tidak,

setelah itu baru diukur dilakukan post test untuk dibandingkan kedua kelompok

(Hidayat, 2011).

31
 32

KA.3 KA.3

KA KA.7 KA.7

KB.3
KB.3
SAMPEL KB

KB.7 KB.7

KC KC.3 KC.3

KC.7 KC.7

Keterangan:
KA : Kelompok 1 Kontrol.
KB : Kelompok 2 perlakuan dengan kombinasi kitosan gel 1% berat molekul rendah
dan ekstrak Aloe vera gel 50%.
KC : Kelompok 3 perlakuan dengan kombinasi kitosan gel 1% berat molekul tinggi
dan ekstrak Aloe vera gel 50%.
KA.3 : Kelompok kontrol tanpa pemberian kombinasi kitosan dan Aloe vera pada
pengamatan selama 3 hari.
KA.7 : Kelompok kontrol tanpa pemberian kombinasi kitosan dan Aloe vera pada
pengamatan selama 7 hari.
KB.3 : Kelompok perlakuan dengan kombinasi kitosan gel 1% berat molekul rendah
dan ekstrak Aloe vera gel 50% pada pengamatan selama 3 hari.
KB.7 : Kelompok perlakuan dengan kombinasi kitosan gel 1% berat molekul rendah
dan ekstrak Aloe vera gel 50% pada pengamatan selama 7 hari.
KC.3 : Kelompok perlakuan dengan kombinasi kitosan gel 1% berat molekul tinggi dan
Ekstrak Aloe vera gel 50% pada pengamatan selama 3 hari.
KC.7 : Kelompok perlakuan dengan kombinasi kitosan gel 1% berat molekul tinggi dan
ekstrak Aloe vera gel 50% pada pengamatan selama 7 hari.
KA.3 : Jumlah pembuluh darah mukosa labial tikus Wistar kelompok kontrol yang
dilukai hingga terbentuk ulcer pada pengamatan selama 3 hari.
KA.7 : Jumlah pembuluh darah mukosa labial tikus Wistar kelompok kontrol yang
dilukai hingga terbentuk ulcer pada pengamatan selama 7 hari.
KB.3 : Jumlah pembuluh darah mukosa labial tikus Wistar setelah dilukai hingga
terbentuk ulcer dan pemberian kombinasi gel kitosan 1% berat molekul rendah
dan ekstrak Aloe vera gel 50% dosis 0,1 mg dua kali dalam sehari selama 3
hari.
KB.7 : Jumlah pembuluh darah mukosa labial tikus Wistar setelah dilukai hingga
terbentuk ulcer dan pemberian kombinasi gel kitosan 1% berat molekul rendah
dan ekstrak Aloe vera gel 50% dosis 0,1 mg dua kali dalam sehari selama 7
hari.
KC.3 : Jumlah pembuluh darah mukosa labial tikus Wistar setelah dilukai hingga
terbentuk ulcer dan pemberian kombinasi gel kitosan 1% berat molekul tinggi
dan ekstrak Aloe vera gel 50% dosis 0,1 mg dua kali dalam sehari selama 3
hari.
 33

KC.7 : Jumlah pembuluh darah mukosa labial tikus Wistar setelah dilukai hingga
terbentuk ulcer dan pemberian kombinasi gel kitosan 1% berat molekul tinggi
dan ekstrak Aloe vera gel 50% dosis 0,1 mg dua kali dalam sehari selama 7
hari.

4.3 Sampel, Besar Sampel dan Teknik Pengambilan Sampel

4.3.1 Sampel

Populasi dan sampel yang digunakan dalam penelitian ini adalah tikus

Rattus Novergicus strain Wistar jenis jantan. Penelitian ini menggunakan tikus

Rattus Novergicus strain Wistar merupakan hewan paling umum digunakan

dalam penelitian biomedis dan penelitian karena mudah diperoleh, mempunyai

respon cepat, memberikan ilmiah yang mungkin terjadi pada manusia dan

harganya relatif murah (Sihombing dan Raflizar, 2010). Tikus betina tidak

digunakan untuk menghindari pengaruh hormon progesteron dan estrogen

terhadap proses penyembuhan luka. Tikus yang dipakai untuk penelitian adalah

tikus umur 2-3 bulan dengan berat sekitar 115- 150 gram. Dipakai umur 2-3 bulan

karena tikus masih dalam usia dewasa muda dan cukup besar sehingga gambaran

histologis selnya mudah dilihat (Yusuf et al, 2005). Berat badan tikus umur 2-3

bulan rata- rata 115 gram – 150 gram yang digunakan dalam penelitian

(Sihombing dan Raflizar, 2010).

4.3.2 Besar Sampel

Besar sampel hewan coba masing-masing sampel (n) diperoleh dari rumus

Federer (Hidayat, 2013).

(t-1)(r-1) ≥ 15
(6-1)(r-1) ≥ 15
(5) (r-1) ≥ 15
5r-5 ≥ 15
5r ≥ 20
 34

r≥4
Keterangan:
t = banyak kelompok perlakuan
r = jumlah replikasi

untuk mengantisipasi hilangnya unit eksperimen maka dilakukan koreksi

dengan 1/(1-f) di mana f adalah proporsi unit eksperimen yang hilang atau

mengundur diri atau drop out (Budianto, 2013). Jumlah replikasi minimal per

kelompok adalah 4.

n – r.
=4.
= 4.
= 4.
=4.1,11
= 4,44 ≈ 5
Keterangan:
n = besar sampel
r = jumlah replikasi
f = angka kemungkinan hewan coba mati (10%)

Dari hasil perhitungan jumlah sampel, terdiri atas 6 kelompok dengan

jumlah sampel tiap kelompok adalah 5.

4.3.3 Teknik Pengambilan Sampel

Teknik pengambilan sampel menggunakan simple random sampling dan

dibagi menjadi 6 kelompok secara acak dengan kriteria sebagai berikut:

1. Tikus Wistar.

2. Jenis Kelamin: jantan.

3. Berat badan 115 – 150 gram ( tidak kekurangan gizi).

4. Kondisi sehat (aktif dan tidak cacat).

 35

4.4 Variabel Penelitian: Klasifikasi Variabel dan Definisi Operasional

Variabel

4.4.1 Klasifikasi Variabel

Variabel bebas adalah kombinasi gel antara kitosan gel 1% dan ekstrak

Aloe vera gel 50%, Derajat Deasetilasi kitosan di atas 75 % dengan berat molekul

tinggi dan rendah.

Variabel terikat adalah jumlah pembuluh darah.

Variabel terkendali adalah

1. Hewan coba

2. Manajemen pemeliharaan hewan coba, yaitu perawatan yang

meliputi kesehatan fisik tikus, jenis pakan dan minuman tikus,

lingkungan laboratorium untuk pemeriksaan kandang dan sanitasi

kandang.

3. Perlakuan ulkus pada mukosa labial tikus Wistar.

4.4.2 Definisi Operasional Variabel

1. Kitosan gel 1% adalah gel terbuat dari suatu polimer jenis

polisakarida merk Sigma-Aldrich dengan derajat deasetilasi di atas

75%, berat molekul rendah (50.000-190.000 Da) dan berat molekul

tinggi (310.000-375.000 Da) dengan cara melarutkan 1 gr serbuk

kitosan dengan larutan asam asetat 100 ml

2. Ekstrak Aloe vera gel 50% didapat dengan 41 kg daging Aloe vera

diekstrak dengan 4 lt etanol yang menghasilkan ekstrak Aloe vera

gel 100%, dan 12,5 ml dari ekstrak Aloe vera gel 100% tersebut
 36

dicampur dengan 12,5 ml NaCMC 0,5% menghasilkan 25 ml

ekstrak Aloe vera gel 50%.

3. Kombinasi gel antara kitosan gel 1% dan ekstrak Aloe vera gel

50% adalah pencampuran 25 ml kitosan gel 1 % dan 25 ml ekstrak

Aloe vera gel 50% menggunakan pencampuran manual dan stirrer

magnetic hingga homogen (tanpa butiran kasar). Hasil campuran

tersebut dinetralkan dengan NaOH 1,25% sampai pH 6-7 agar tidak

mengiritasi jaringan mukosa rongga mulut.

4. Jumlah pembuluh darah mukosa labial tikus Wistar pada penelitian

ini adalah banyaknya pembuluh darah yang dikelilingi selapis sel

endotel berbentuk pipih dengan lumen mengandung eritrosit yang

terlihat dengan pengecatan rutin HE( Hematoksilin Eosin) dan

tampak representatif (angiogenesis lengkap, tidak terlipat atau

terpotong, irisan setempat tidak tebal, tidak ada sel yang

bertumpuk, dan sebaran sel merata serta tidak berkelompok).

Penghitungan dilihat pada hari ketiga dan ketujuh.

5. Pemberian ulkus pada penelitian ini adalah suatu lesi yang dibuat

pada mukosa labial tikus Wistar yang melibatkan kerusakan pada

lapisan epitelium sampai lamina propia dengan menggunakan

amalgam stopper yang telah dipanaskan di atas api biru pada

bunsen burner selama 35 detik dengan aplikasi 3 detik diameter 2

mm dan kedalaman 4 mm .

6. Penyembuhan ulkus secara makroskopik adalah selisih diameter

dari awal terbentuknya ulkus sampai hari ketiga dan ketujuh yang
 37

diukur dengan menggunakan kapiler digital dalam satuan milimeter

(mm) dimana diameter ulkus diukur pada batas tepi kemerahan

ulcer

4.5 Alat dan Bahan Penelitian

4.5.1 Alat Penelitian

Alat yang digunakan dalam penelitian ini meliputi: kandang tikus Wistar,

timbangan tikus, timbangan analitik, tabung kaca besar untuk tempat pemberian

anestesi secara inhalasi, amalgam stopper, spiritus burner, handscone, cotton

pellet, pinset anatomi, plastic filling instrument, label, kaca preparat, cover glass,

mikroskop cahaya dan kaliper digital.

4.5.2 Bahan Penelitian

Alkohol 70% untuk sterilisasi alat, aquadest steril, CMC-Na 3,5% sebagai

gelling agent, etanol 70%, gel Aloe vera, serbuk kitosan berat molekul tinggi dan

rendah, asam asetat 1%, pakan tikus (di lampiran 1), buffer formalin 10%, cotton

buds, Pewarnaan HE, Na OH 1,25%, Ketamine HCl 2%, Xylazine 2%.

4.6 Lokasi dan Waktu Penelitian

4.6.1 Lokasi Penelitian

1. Pemeliharaan hewan coba dilakukan di unit hewan coba Laboratorium

Biokimia Fakultas Kedokteran Gigi Universitas Airlangga Surabaya.

 38

2. Proses pembuatan kombinasi gel Kitosan dan Aloe vera dilakukan di

Laboratorium Farmasi Fakultas Farmasi Universitas Widya Mandala

Surabaya.

3. Pemrosesan jaringan serta pembuatan preparat dengan menggunakan

pewarnaan H.E. dilakukan di Laboratorium Patologi Anatomi Fakultas

Kedokteran Universitas Airlangga Surabaya.

4. Proses pengamatan hasil penelitian dilakukan di Laboratorium Patologi

Anatomi Fakultas Kedokteran Universitas Airlangga Surabaya.

4.6.2 Waktu Penelitian

Waktu penelitian sampai selesainya pelaporan hasil penelitian

dilaksanakan mulai dari bulan september 2015 hingga desember 2015.

4.7 Prosedur Perlakuan Hewan Coba

1. Prosedur adaptasi tikus.

Tikus Wistar sebanyak 30 ekor yang memenuhi kriteria dan diaklimatisasi

di dalam laboratorium. Masing-masing dikandangkan dengan makan dan

minum secara standard selama masa aklimatisasi (satu minggu) sampai

sebelum pembuatan preparat. Kandang hewan coba terbuat dari kotak

plastik dengan ukuran 40x30x15 cm dan ditutup dengan anyaman yang

bisa dilepas sehingga mudah dibersihkan. Setiap kandang diberi label

berupa nama kelompok, alas kandang diberi sekam dan diganti setiap dua

hari, diberi tempat makanan, dan botol yang ujungnya terdapat pipa untuk
 39

sedotan sebagai tempat minum tikus. Setiap kandang diisi 5 ekor tikus.

Makanan yang diberikan pada tikus dapat dilihat pada lampiran 2.

2. Pembuatan gel kombinasi kitosan dan Aloe vera sesuai dengan prosedur

yang dapat dilihat pada lampiran 2.

3. Selanjutnya sebelum dilakukan penelitian, terlebih dahulu dilakukan

pengambilan tikus secara random dari populasi sebanyak 30 ekor yang

sesuai dengan kriteria yang telah ditentukan, dibagi menjadi 6 (enam)

kelompok secara random yang masing –masing terdiri dari 5 ekor tikus.

Sebelum dilakukan pembuatan ulcer, semua alat yang digunakan harus

disterilkan. Pembagian kelompok tikus wistar tersebut setelah perlakuan

ulcer adalah sebagai berikut:

- kelompok KA, yakni kelompok yang hanya diberi pakan standar,

aquades

- kelompok KB, yakni kelompok yang diberi pakan standar,

aquadest, serta pemberian kombinasi gel kitosan 1% berat molekul

rendah dan ekstrak Aloe vera gel 50% dosis 0,1 mg dua kali dalam

sehari.

- Kelompok KC, yakni kelompok yang diberi pakan standar,

aquadest, serta kombinasi gel kitosan 1% berat molekul tinggi dan

ekstrak Aloe vera gel 50% dosis 0,1 mg dua kali dalam sehari

(Mendrofa et al., 2014; Mansour et al., 2013).

4. Cara perlakuan pembuatan ulkus :

Setiap tikus strain wistar sebelum mendapat perlakuan dilakukan

anestesi dengan kombinasi ketamine 2% 1 ml dan xylazine 2% 0,5 ml

 40

dicampur dan disuntikkan dengan dosis 0,5 ml/ 100 gr BB pada femur

dextra secara intramuscular (Puspita, 2015; Mahmudah, 2013). Setelah itu

mukosa labial tikus dibersihkan dengan chlorhexidine gluconate 0,12%,

dan dilakukan pembuatan ulkus traumatikus dengan amalgam stopper

diameter 2 mm dan ketinggian 4 mm yang dipanaskan dengan burner pada

api berwarna biru selama 35 detik. Fiksasi pada sentral mukosa labial

bawah tikus strain wistar dengan pinset anatomi kemudian amalagam

stopper panas disentuhkan pada mukosa labial tikus selama ± 3 detik.

Prosedur ini dilakukan untuk tikus yang lain, namun sebelum amalgam

stopper dipanaskan, hendaknya amalgam stopper dimasukkan ke dalam

air terlebih dahulu sampai dingin (Oei, 2012; Mansour et al., 2013).

Gambar 4.1 Gambar amalgam stopper yang telah dipanaskan ditempelkan pada
area interinsisif mukosa labial tikus

5. Pada hari pertama setelah dibuat ulkus dilakukan pengamatan apakah

sudah terbentuk ulkus atau tidak. Jika sudah terbentuk ulkus ditandai

dengan adanya lesi berbentuk bulat, berwarna putih, dengan sentral

kekuningan berisi eksudat fibrin dengan tepi kemerahan (Regezi, 2008).

Ulkus dikeringkan dengan cotton pellet steril dan dilakukan pengukuran

 41

diameter ulkus terlebih dahulu dengan menggunakan kaliper digital dan

dilakukan pencatatan diameter ulkus.

6. Kombinasi gel dipalikasikan pada ulkus tikus strain wistar bila pada hari

pertama setelah perlakuan ulkus terbentuk. Pemberian gel dengan

menggunakan plastic filling instrument steril sebanyak 0,1 ml kemudian

diratakan dengan menggunakan plastic filling instrument dan didiamkan

beberapa saat (±1menit) untuk memberi kesempatan pada gel untuk

meresap. Pengukuran, pemberian gel dan pencatatan diameter ulkus

dilakukan setiap hari satu kali sampai hari ke 3 dan hari ke 7 setelah

perlakuan ulkus (Mansour et al., 2013)

7. Selanjutnya dilakukan pengambilan jaringan mukosa labial tikus Wistar

yang telah dilukai dengan euthanasia. Euthanasia pada tikus menggunakan

Ketamine 75-100mg/kg BB + xylazine 5-10mg/ kg BB secara

intraperitoneal lalu dengan metode cervical dislocation dengan cara ibu

jari dan jari telunjuk ditempatkan di kedua sisi leher di dasar tengkorak.

Tangan lainnya ditempatkan pada pangkal ekor atau kaki belakang dan

dengan cepat ditarik sehingga mengakibatkan pemisahan antara tulang

ekor dan tengkorak (Leary et al., 2013). Tikus kontrol dan tikus perlakuan

dikorbankan pada hari ketiga dan ketujuh setelah pemberian perlakuan

ulkus. Lalu mukosa labial tikus wistar dipotong sampai sudut mulut tikus

mengikutkan bagian yang ulkus dan bagian yang normal lalu dimasukkan

dalam larutan fiksasi formalin 10% dan tikus yang telah mati dikubur.

9. Pembuatan preparat dan pengecatan HE ada di lampiran 4.

 42

10. Pengamatan dengan menggunakan mikroskop cahaya dengan pembesaran

400x. Pengumpulan data hasil penelitian yakni berupa data jumlah

pembuluh darah mukosa labial tikus Wistar seluruh

kelompok.Pemeriksaan terhadap jumlah pembuluh darah mukosa labial

tikus strain wistar dilakukan dengan mengamati dan menghitung jumlah

pembuluh darah yang dianggap representatif (jumlah pembuluh darah

lengkap, tidak terlipat atau terpotong, irisan setempat tidak tebal, tidak ada

sel yang bertumpuk tumpuk, dan sebaran sel merata serta tidak

berkelompok-kelompok). Pengamatan dan penghitungan jumlah pembuluh

darah dilakukan di bawah mikroskop cahaya pertama dengan pembesaran

40x untuk menentukan daerah perlakuan dan dengan pembesaran 400 x

untuk melihat sel. Penghitungan secara direct dan manual dilihat dalam 3

lapang pandang pada daerah perlakuan yang berisi sel padat dengan 1x

penghitungan dalam 1 lapang pandang. Data hasil pengamatan dan

penghitungan jumlah pembuluh darah tikus Wistar dikumpulkan dan

disajikan dalam bentuk tabel.

4.8 Analisis Data

Analisis data digunakan untuk membuktikan hipotesis yang telah disusun

terhadap data yang terkumpul dilakukan perbandingan jumlah pembuluh darah

mukosa labial tikus Wistar kelompok kontrol dan perlakuan. Selanjutnya dilakukan

uji hipotesis dengan menggunakan uji parametrik bila skala data adalah rasio.

Syarat uji statistik parametrik adalah uji normalitas data harus normal dan uji

homogenitas data harus homogen. Uji normalitas dilakukan dengan uji shapiro wilk
 43

karena jumlah sampel kurang dari 50. Uji homogenitas dilakukan dengan

menggunakan Levene statistic. Bila data terdistribusi normal dan memiliki varian

homogen kemudian data dianalisis secara analitik dengan SPSS menggunakan uji

One Way Anova dan Post Hoc LSD dengan taraf signifikansi 95% (0,05). Uji

Anova dilakukan karena sampel penelitian lebih dari 2 kelompok dan tidak

berpasangan (Dahlan, 2010).

Jika hasil ANOVA p< 0,05 maka Ho ditolak dan dilanjutkan dengan uji

LSD. Namun jika hasil ANOVA p>0,05, maka Ho diterima dan tidak dilanjutkan

dengan uji LSD. Bila data tidak terdistribusi normal atau variasi data tidak

homogen maka dilakukan uji non parametrik menggunakan uji Kruskal Wallis

dilanjutkan dengan uji Mann Whitney dengan taraf signifikan 95%.

 44

4.9 Alur Penelitian

Sampel Tikus

Aklimatisasi

Dianestesi kombinasi ketamine HCl 2% 1 ml dan xylazine 2% 0,5 ml

Pembuatan ulcer di mukosa labial dengan amalgam stopper

Irigasi aquadest steril dan dikeringkan

Pemberian gel Pemberian gel

Tanpa perlakuan
kombinasi ekstrak kombinasi ekstrak
(kelompok kontrol )
Aloe vera gel 50% Aloe vera gel 50%
dengan kitosan 1% dengan kitosan 1%
berat molekul rendah berat molekul tinggi

Hari ke-3 Pengambilan sediaan  dekaputasi

dan ke-7 tikus

Pembuatan preparat dengan blok parafin dan pemeriksaan histometri

jumlah pembuluh darah dengan HE

Pengambilan gambar 3 lapang pandang

Penghitungan jumlah pembuluh darah

Analisis data dengan uji Anova dan LSD