BIOLOGI MOLEKULAR
PROGRAM STUDI FARMASI FKUB
DISUSUN OLEH:
Valentina Yurina, M.Si
Dra. Diana Lyrawati, M.Si. Ph D. Apt.
Ferri Widodo, S.Si., Apt.
Rudy Salam, S.Farm. Apt.
dr. Dewi Santosaningsih, M.Kes
dr. Dwi Yuni Nurhidayati, M.Kes
0
KATA PENGANTAR
Panduan praktikum Biologi Molekular ini disusun bagi mahasiswa Program Studi Farmasi,
FKUB yang melaksanakan praktikum Biologi Molekular sebagai penunjuang dari mata kuliah
Biologi Molekular.
Praktikum Biologi Molekular diharapkan dapat menambah wawasan dan ketrampilan mahasiswa
dalam teknik-teknik dasar biologi molekular yang umum digunakan.
Semoga buku panduan praktikum ini dapat berguna bagi mahasiswa dan pengguna lain.
Biologi Molekular
1
TATA TERTIB PRAKTIKUM BIOLOGI MOLEKULAR
Mahasiswa yang mengikuti praktikum Biologi Molekular diwajibkan mematuhi Tata Tertib
sebagai berikut:
1. Diwajibkan hadir tepat waktu sesuai jadwal praktikum yang telah ditentukan.
2. Mengenakan pakaian sopan dan sepatu tertutup.
3. Mengenakan jas praktikum.
4. Membawa perlengkapan yang tidak tersedia di laboratorium, seperti: tissue, sarung tangan
lateks sekali pakai, dll.
5. Berada dalam laboratorium selama praktikum, kecuali mendapatkan izin dari dosen yang
bertugas.
6. Menjaga kebersihan dan keutuhan alat laboratorium. Bagi mahasiswa yang merusak atau
menghilangkan alat laboratorium diwajibkan mengganti sesuai dengan spesifikasi alat
tersebut maksimum 1 hari sebelum praktikum selanjutnya. Apabila hingga praktikum berikut
belum mengganti alat tersebut maka sanksinya adalah tidak diperbolehkan mengikuti ujian
praktikum.
7. Bekerja dengan jujur dan tertib.
8. Berbicara seperlunya dan tidak gaduh.
9. Maksimum ketidakhadiran mahasiswa dalam praktikum adalah 1 kali pertemuan, apabila
mahasiswa tidak hadir lebih dari 1 kali praktikum sanksinya adalah dianggap tidak lulus
dalam praktikum Biologi Molekular dan harus mengulang praktikum ini pada tahun
berikutnya. Izin yang diterima adalah izin yang tertulis dan dengan alasan yang dapat
dipertanggungjawabkan.
10. Mengembalikan alat laboratorium dalam keadaan bersih dan lengkap.
11. Membuat dan mengumpulkan laporan praktikum sesuai dengan draft yang telah ditentukan.
12. Meninggalkan ruang praktikum dalam keadaan bersih dan rapi.
2
MATERI PRAKTIKUM BIOLOGI MOLEKULAR
No. Materi
Kuantifikasi protein
Persentase penilaian:
Diskusi : 10%
Pengerjaan : 50% penilaian dari proses dan produk (hasil)
Post test : 10%
Laporan : 10%
Ujian akhir : 20%
3
BAB I
TEKNIK PIPETTING
Tujuan:
Alat:
Bahan:
Prinsip Dasar:
Penelitian Biologi Molekuler pada umumnya berkaitan dengan volume yang sangat kecil, yaitu
dalam skala microliter. Untuk mendukung penelitian tersebut dibutuhkan suatu peralatan khusus
untuk mengukur dan mengambil sejumlah tertentu larutan, yaitu mikropipet. Penggunaan
mikropipet yang baik dan benar akan meningkatkan keberhasilan suatu penelitian. Mikropipet
yang tersedia saat ini dapat mengambil suatu volume larutan mulai dari 0,25 µL hingga 1000µL.
Ada dua macam mikropipet yang umum digunakan, yaitu single channel dan multi channel
(Gambar 1.1)
Gambar 1.1. Variasi mikropipet (A) Manual single channel micropipette (B) Manual multi
channel micropipette (C) Electronic multi channel micropipette
4
Mikropipet terdiri dari beberapa bagian utama, yaitu: plunger (tombol untuk
menarik/mengeluarkan cairan), ejector button (tombol untuk melepaskan disposable tip), volume
indicator (menunjukkan jumlah cairan yang dipipet), volume adjustment (bagian pengaturan
jumlah cairan yang dipipet), tip attachment (bagian penempelan disposable tip). (Gambar 1.2)
Prosedur:
Mikropipet tersedia dalam berbagai rentang volume yang berbeda, yaitu 0,5-10 μL (P-
10), 2-20 μL (P-20), 20-200 μL (P-200), 200-1000 μL (P-1000). Penggunaan pipet harus
tepat sesuai dengan volume cairan yang hendak dipipet.
0 0 0
4 4 4
7 7 7
4.7 μL 47 μL 470 μL
5
A) P-1000 1
0 5
8 0
8 _____ μL
_____ μL
F) P-____
B) P-200
8 19.5 uL
_____ μL
C) P-____
940 μL
D) P-____
50 μL
E) P-20
6
Tentukan volume yang hendak dipipet dengan mengatur tombol adjusment.
Jangan memutar tombol adjusment lebih besar daripada volume yang tertera di
bagian atas pipet!!
Tekan pipet pada kotak tips. Penekanan harus cukup kuat untuk mendapatkan
suatu kondisi kedap udara tetapi jangan menggunakan kekuatan berlebihan.
Tekan bagian plunger hingga pemberhentian pertama, masukkan ujung tip hingga
kurang lebih 2 mm dari permukaan cairan dalam keadaan pipet vertikal. Lepaskan
plunger secara perlahan, tarik ujung tip dari permukaan cairan. Jangan pernah
memegang pipet dalam kondisi horisontal saat tip berisi cairan !!
Sentuhkan ujung tip pada bagian sisi dalam mikrotube kosong, tekan plunger
hingga pemberhentian kedua. Upayakan semua cairan keluar keluar dari tip
Buang tip dengan menekan tombol ejector
7
BAB II
Tujuan:
Prinsip:
DNA total dapat diperoleh dari sel tanaman, bakteri, atau dari organismen lain yang hendak
dipelajari. Secara garis besar, proses isolasi DNA total terdiri dari empat tahap, yaitu:
Lisis sel, baik dengan metode fisik (secara mekanik) atau kimiawi (menggunakan
senyawa tertentu yang menyebabkan sel lisis, misalnya lisosim dan EDTA)
Ekstraksi DNA sehingga terpisah dari komponen sel lain, dapat digunakan
menggunakan pelarut organik (misalnya fenol dan kloroform) atau dengan metode
kromatografi
Pemekatan DNA total, pada umumnya menggunakan presipitasi etanol
Bahan:
Alat:
Sentrifuga
Water bath
Mikropipet
Wadah penampung
8
Prosedur isolasi DNA dari sel bukal manusia:
1. Peserta praktikum yang hendak diambil sampelnya berkumur dengan cairan saline 10 mL
selama 60 detik. Keluarkan cairan saline dan tampung dalam wadah yang disediakan.
2. Putar wadah perlahan untuk meresuspensi sel kemudian ambil sampel sebanyak 1,5 mL
dan masukkan ke dalam mkirotube
3. Sentrifuga cairan sampel selama 2 min pada kecepatan maksimal.
4. Buang supernatannya kemudian ulangi prosedur 2 dan 3 sebanyak 2 kali.
5. Resuspensi sel bukal dengan 140 uL buffer lisis kemudian homogenasikan dengan
vorteks, tambahkan 10uL proteinase K 20mg/mL
6. Inkubasi sampel pada waterbath selama 15 min pada suhu 55⁰C
7. Homogenasikan sampel dengan vorteks selama 20 detik
8. Inkubasikan sampel pada waterbath selama 15 min pada suhu 99⁰C
9. Sentrifuga sel lisat selama 2 menit pada kecepatan 6000 rpm
10. Pindahkan supernatan pada tabung mikrosentrifuga
11. DNA siap digunakan untuk proses selanjutnya (simpan di suhu - 20⁰C)
Gambar 2.1. Prosedur isolasi DNA total dari sel bukal manusia (Sumber: VNTR Human
DNA typing Using PCR (Edvotek))
9
Prosedur isolasi DNA dari rambut manusia:
Gambar 2.2. Prosedur isolasi DNA total dari rambut manusia (Sumber: VNTR Human
DNA typing Using PCR (Edvotek))
10
BAB III
KUANTIFIKASI DNA
Tujuan:
Prinsip:
DNA murni memiliki kemampuan untuk menyerap absorbansi pada panjang gelombang 260 nm
karena adanya basa-basa purin dan pirimidin yang menyusun DNA. Untuk menghitung
konsentrasi DNA dalam suatu sampel dapat digunakan penilaian berikut ini:
Di lain pihak, senyawa fenol dan protein dapat menyerap absorbansi pada panjang gelombang
280 nm. Dengan demikian adanya kontaminan protein/fenol pada sampel DNA/RNA dapat
dihitung dengan menggunakan persamaan:
𝑛𝑖𝑙𝑎𝑖 𝑎𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑠𝑖 𝑝𝑎𝑑𝑎 260 𝑛𝑚
Nilai kemurnian DNA/RNA = 𝑛𝑖𝑙𝑎𝑖 𝑎𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑠𝑖 𝑝𝑎𝑑𝑎 280 𝑛𝑚
DNA atau RNA yang murni memiliki nilai kemurnian antara 1,8-2,0. Adanya kontaminasi
menyebabkan nilai yang diperoleh akan lebih kecil dari 1,8 sehingga mengurangi nilai
kepercayaan dalam penghitungan konsentrasi DNA atau RNA yang sebenarnya.
11
Alat:
Prosedur:
12
BAB IV
Tujuan:
Prinsip:
Polymerase chain reaction (PCR) merupakan suatu metode amplifikasi atau perbanyakan DNA
pada suatu daerah terget tertentu yang dibatasi oleh sepasang primer (primer forward dan primer
reverse). Pada umumnya proses amplifikasi dilakukan oleh DNA polymerase yang berasal dari
Thermus aquaticus. Proses amplifikasi dilakukan dalam 3 tahap, yaitu denaturasi (pemisahan
untai ganda DNA), anneling (penempelan primer), dan elongasi (perpanjangan untai DNA).
Masing-masing tahapan dilakukan pada suhu yang berbeda-beda.
Aplikasi metode polimerase chain reaction di bidang kesehatan sangat luas, misalnya sebagai
metode pendeteksi patogen atau cemaran dalam produk kesehatan, untuk identifikasi hubungan
kekerabatan, dan untuk deteksi forensik dan deteksi penyakit genetik. Salah satu penggunaan
PCR yang telah lama dikenal adalah identifikasi variable number of tandem repeats (VNTR),
yaitu suatu region pada genome manusia yang sangat bervariasi antar individu. VNTR pada
segmen pYNZ22 (HGM locus Dl 7S30) adalah salah satu segmen dengan tingkat polimorfisme
yang tinggi dan telah banyak digunakan dalam deteksi hubungan kekerabatan dan penyakit
genetik.
13
Gambar 4.1. Proses amplifikasi DNA dengan metode PCR (Sumber:VNTR Human DNA
typing Using PCR (Edvotek))
Bahan:
Alat:
Sentrifuga mikro
Microtube 200 µL steril
Thermal cycler
14
Prosedur:
Prosedur kerja :
1. Selalu gunakan wadah es saat bekerja.
2. Masing-masing komponen PCR dimasukkan ke dalam tabung, gunakan tip yang berbeda
untuk setiap komponen
3. Sampel DNA di kocok/vortex dan kemudian di-spin sebelum digunakan.
4. Tabung dispin sebentar agar semua larutan turun dan bercampur.
5. Tabung dimasukkan ke dalam mesin PCR.
Kondisi reaksi PCR :
Pre-denaturasi : 94 oC selama 5 menit
Denaturasi : 94 oC selama 1 menit
28 siklus
Annealing : 55 oC selama 1 menit
Elongasi : 72 oC selama 1 menit
Post-elongasi : 72 oC selama 10 menit
Penyimpanan : 4 oC
15
BAB V
Tujuan khusus:
Prinsip:
Bahan:
Agarosa
DNA yang akan dikarakterisasi
DNA marker/ DNA ladder
Etibium bromida (EtBr)
Buffer elektroforesis (Tris Acetate EDTA/ TAE buffer)
Loading dye
Alat:
16
Prosedur:
Gambar 5.1. Proses persiapan gel agarosa (Sumber: VNTR Human DNA typing Using
PCR (Edvotek)
17
BAB IV
ISOLASI PROTEIN
Tujuan khusus:
Prinsip:
Isolasi protein merupakan suatu proses untuk memisahkan protein target dari komponen
penggangu lainnya, baik berupa protein lain atau komponen non-protein, sehingga protein target
dapat digunakan lebih lanjut, misalnya untuk dipelajari strukturnya, aktivitasnya, dsb. Materi
yang biasa digunakan dapat berupa jaringan atau kultur bakteri. Isolasi protein diawali dengan
pemecahan sel atau jaringan di mana terdapat protein target, dapat dilakukan dengan metode
fisik, misalnya freeze-thawing atau sonikasi, dan metode kimia dengan menggunakan pelarut
organik. Setelah protein terlarut dilakukan sentrifugasi untuk memisahkan protein target dari
membran sel, DNA, dsb. Selanjutnya dapat dilakukan metode purifikasi lebih lanjut, misalnya
dengan kromatografi.
Bahan:
Alat:
Sentrifuga
Mikropipet
Vortex
Prosedur:
18
BAB VII
Tujuan khusus:
Memahami dan mampu melakukan kuantifikasi protein dengan menggunakan metode Bradford
Prinsip:
Metode Bradford merupakan metode analisis protein berbasis kolorimetri yang menggunakan
spektrofotometri UV-vis (595nm). Metode ini menggunakan Commasie Briliant Blue G-250
yang mengalami perubahan warna setelah berikatan dengan protein dalam suasana asam. Secara
umum, metode Bradford dapat digunakan untuk mendeteksi protein dengan rentang
konsentrasi 0 µg/ml to 2000 µg/ml. Keunggulan dari metode ini, diantaranya adalah cepat, tidak
perlu pemanasan sampel, dan memberikan reaksi kolorimetri yang relatif stabil dibandingkan
metode kolroimetri lainnya.
Bahan:
Reagen Bradford: 100 mg Coomassie Blue G-250 dalam 50 ml 95% ethanol, tambahkan
100 ml 85% (w/v) phosphoric acid, add aquadest 1 Liter
Protein yang akan dihitung kadarnya
Bovine Serum Albumin (BSA) sebagai standard
Alat:
Alat gelas
Spektrofotometer
Prosedur:
1. Siapkan larutan standard BSA dengan konsentrasi 100µg/ml sebagai larutan baku induk.
2. Siapkan larutan baku kerja BSA, blanko, dan protein sampel sesuai dengan Tabel 1.
(Pengenceran protein perlu dilakukan agar terdeteksi dalam rentang absorbansi linier).
3. Inkubasi larutan selama 5 menit
4. Ukur absorbansinya pada 595nm menggunakan UV-vis spektrofotometer.
5. Tentukan konsentrasi protein sampel
19
Table 1: Jumlah Sampel dan Reagen Bradford
20
BAB VIII
Tujuan:
Prinsip:
Bahan:
Akrilamid 30%
Separating buffer (Tris Cl 1,5 M pH 8,8)
Stacking buffer (Tris Cl 0,5 M pH 6,8)
APS (ammonium persulphate)10%
TEMED ((N, N, N', N'- Tetramethylethylenediamine)
Buffer elektroforesis
Alat:
Prosedur:
21
5. APS 10% dan TEMED dimasukkan paling akhir. Campuran dihomogenkan dengan
mem-pipet naik-turun secara perlahan. Polimerisasi mulai terjadi pada tahap ini, larutan
harus segera dituang ke gel sandwich.
6. Secara perlahan larutan separating gel dimasukkan ke dalam gel sandwich hingga
mecapai garis batas dengan stacking gel (sekitar 0,5 mm dari ujung sisir pencetak sumur
gel pada stacking gel)
7. Segera dimasukkan aquadest dibagian atas separating gel untuk mendapatkan permukaan
gel yang rata.
8. Separating gel didiamkan hingga menjadi padat (sekitar 30 menit).
9. Setelah separating gel padat, aquadest pada bagian atas dibuang
10. Pada stacking gel yang telah disiapkan, ditambahkan APS 10% dan TEMED untuk
memulai proses polimerisasi.
11. Secara perlahan stacking gel dimasukkan ke gel sandwich hingga penuh.
12. Sisir pencetak sumur diselipkan pada stacking gel secara berhati-hati sampai menyentuh
bagian atas dari separating gel.
13. Stacking gel didiamkan hingga menjadi padat (sekitar 15 menit).
14. Sambil menunggu gel memadat, sampel protein disiapkan. Ekstrak protein total induksi,
non-induksi dan protein murni diambil dalam jumlah yang setara dan ditambahkan bufer
sampel 5x (20 µL sampel protein, 5 µL bufer sampel).
15. Campuran sampel protein dididihkan selama 5-10 menit. Sampel protein di-spin sebentar
dan siap untuk dimasukkan ke sumur gel.
16. Pada stacking gel yang sudah memadat, sisir pencetak sumur ditarik dan gelembung
udara pada sumur dikeluarkan dengan menambahkan aquadest. Gel dikosongkan
kembali.
17. Gel sandwich yang berisi gel siap pakai dimasukkan ke dalam chamber elektroforesis dan
chamber diisi dengan bufer elektroforesis hingga sumur penuh.
18. Sampel protein dimasukkan pada sumur sebanyak 20 µL dan juga marka protein.
19. SDS-PAGE dilakukan menggunakan pada tegangan 125 V selama 60 menit. Gel hasil
elektroforesis selanjutnya diwarnai dengan merendam gel dalam staining solution
Coomasie blue selama 15 menit
20. Selanjutnya gel di-destaining untuk menghilangkan sisa staining.
22