Gene Therapy for Parkinson’s Disease

1. Perkenalan

Penyakit Parkinson (PD) adalah penyakit neurodegeneratif yang umum, dengan prevalensi
sekitar 250 per 100.000 populasi dan menjadi semakin penting dalam populasi yang
menua. Pasien menjadi simtomatik ketika sekitar 75% dopamin striatal hilang, dengan
penurunan tahunan terus-menerus sebesar 5-10% ( Brooks 1998 , Fearnley
1991 ). Penggunaan levodopa (L-3,4-dihyroxyphenylalanine) sebagai terapi simtomatik
didirikan hampir 50 tahun yang lalu dan terus menjadi pendekatan penting pada penyakit
awal dan akhir ( Fahn 2006 ). Meskipun sebagian besar pasien pada awalnya merespon
dengan baik terhadap terapi dopaminergik, banyak akhirnya mengembangkan fluktuasi
dalam respon terapeutik mereka, seringkali dengan diskinesia terkait ( Jenner 2000). Agen
tambahan, termasuk inhibitor katekol O- metiltransferase dan / atau inhibitor monoamine
oksidase sering ditambahkan ke dalam obat yang ada, dengan proporsi pasien bergantung
pada infus apomorphine. Terapi-terapi ini bersifat simtomatik, tanpa efek pada proses
patogenik yang mendasarinya, khususnya hilangnya progresif neuron dopaminergik. Terapi
baru untuk memuji pendekatan yang ada, atau berpotensi mengubah perjalanan penyakit,
jelas diinginkan.

Hilangnya neuron pada penyakit Parkinson ini dikaitkan dengan beberapa kelainan
fungsional, termasuk perubahan glutamatergik rangsang dan GABAergic pathway yang
mengendalikan gerakan ( Wichmann 2003 ). Aktivitas tanpa hambatan dalam nukleus
subthalamic (STN) berkorelasi dengan peningkatan aktivitas dalam proyeksi rangsang ke inti
utama ganglia basal - internal globus pallidus (GPi) dan substantia nigra pars reticularis
(SNr). Hasilnya adalah peningkatan aliran penghambatan ke daerah penerima pallidal atau
thalamus dan akibatnya aktivitas kortikal yang berkurang dianggap bertanggung jawab atas
banyak fitur motorik penyakit Parkinson ( Brown 2001).). Pentingnya patofisiologis dari
aktivitas nukleus subthalamic yang terlalu aktif ini dapat ditargetkan dengan menggunakan
beberapa pendekatan, termasuk lesi stereotactic ( Alvarez 2001 , Su 2003 ), stimulasi otak
dalam frekuensi tinggi ( Benabid 1996 , Stimulasi Otak-Dalam untuk Parkinson's Disease
Study Group 2001) dan farmakologis membungkam ( Levy 2001 ), yang mengarah ke
perbaikan fungsi motorik. Baru-baru ini, pendekatan dan pengamatan ini telah mendorong
uji coba terapi gen untuk memberikan vektor terapeutik ke dalam striatum itu sendiri dan
ini akan dibahas nanti. Biasanya, pendekatan terapi gen telah difokuskan pada pemulihan
atau pelestarian fungsi sel dopaminergik dalam striatum baik dengan faktor neurotropik
(Kordower 2000 , Marks 2010 ) atau pengiriman enzim yang diperlukan untuk sintesis
dopamin ( Eberling 2008 , Azzouz 2002 ).

2. Pengiriman gen ke otak

Terapi gen sebagai pendekatan terapeutik untuk gangguan sistem saraf pusat (SSP) telah
dimungkinkan secara teoritis selama lebih dari satu dekade sekarang, dan beberapa
kemajuan teknis baru-baru ini telah membuat jalan ini semakin menarik. Metode
pengiriman asam nukleat sintetis akan jatuh ke dalam salah satu dari dua kelompok - vektor
nonviral dan virus. Vektor nonviral biasanya berupa partikel yang disintesis secara kimia,
seperti lipid kationik, dicampur dengan DNA rekombinan, biasanya diberikan melalui injeksi
langsung. Metode ini secara teknis relatif mudah, tetapi biasanya hanya menghasilkan
ekspresi gen sementara. Vektor virus, sebaliknya, berasal dari virus DNA atau RNA dan
berpotensi menyebabkan ekspresi gen berkelanjutan melalui integrasi genom atau
pembentukan episom. Lima tahun terakhir telah melihat kemajuan besar dalam kisaran
vektor virus yang tersedia, dengan sistem vektor individual memiliki kelebihan dan
kekurangan spesifik untuk pengiriman gen terapeutik ke SSP. Sifat-sifat masing-masing kelas
vektor disajikan di sini, dengan fokus khusus pada virus terkait-adeno (AAV), meskipun
adenovirus, herpes simpleks dan sistem lentivirus dibahas. Dengan pengecualian lentivirus,
vektor retroviral (biasanya berdasarkan virus leukemia murine) tidak dapat menginfeksi sel
pasca-mitosis SSP, dan tidak dipertimbangkan dalam ulasan ini. Pertimbangan tambahan
berkaitan dengan metode pengiriman vektor - injeksi sistemik perifer jelas tidak tepat
kecuali vektor dapat melintasi sawar darah otak dengan beberapa derajat kekhususan
jaringan. Untung,

2.1. Virus terkait adeno

AAV sederhana, 4,7 kb virus DNA untai tunggal ( Srivastava 1983 )

dari keluarga Parvoviridae dan gen Dependovirus . Dua gen ( cap dan rep ) yang mengkode
protein capsid dan replikasi virus masing-masing, diapit oleh pengulangan terminal terbalik
(ITRs). Gen tambahan diperlukan untuk replikasi, berpotensi berasal dari virus adenovirus
atau herpes simplex ( Atchison 1965 , Hoggan 1966 , Buller 1981). Serotipe 2 AAV (AAV2)
adalah yang pertama diurutkan, dan merupakan vektor terapi gen berbasis AAV yang paling
banyak digunakan. Penelitian selanjutnya telah mengisolasi setidaknya 100 varian AAV,
dengan banyak memiliki tropisme jaringan yang berbeda dan efisiensi transduksi yang jelas
( Gao 2004 ). AAV biasanya tetap sebagai episom monomerik atau concatameric ( Schnepp
2003 ), meskipun integrasi virus dapat terjadi, pada situs yang ditentukan pada kromosom
manusia 19 ( Muzyczka 1992 ), AAV sangat menarik sebagai kandidat vektor untuk terapi
gen karena mereka memiliki tingkat teori yang tinggi untuk terapi gen. keamanan
( Monahan 2002 , Tenenbaum 2003), karena AAV tipe liar sudah rusak replikasi dan virus
belum dikaitkan dengan penyakit manusia yang diketahui. Aktivitas promotor yang lemah
dari urutan pengulangan terminal mengurangi risiko keseluruhan mutagenesis insersi dan
aktivasi onkogenik, sehingga integrasi genom tidak cenderung menimbulkan risiko utama
(McCarty 2004).
Pendekatan awal untuk produksi AAV rekombinan melibatkan pengemasan DNA asing ke
dalam mantel virus dengan menginfeksi sel dengan AAV tipe liar dan adenovirus
penolong. Proses ini meninggalkan sisa virus tipe liar yang mengkontaminasi persiapan AAV
rekombinan, dengan masalah yang jelas untuk aplikasi in vivo ( Hermonat 1984 ). Sistem
yang lebih baru menggunakan sistem plasmid dua atau tiga ( Samulski 1989 ), di mana sel-
sel diko-transfikasi dengan pengkodean konstruk plasmid untuk gen sintetis yang diapit oleh
125 pasangan virus base terminal repeat terminal (ITRs) terbalik, dalam kombinasi dengan
pengkodean plasmid lebih lanjut untuk topi , perwakilandan gen pembantu adenoviral yang
tepat. Ini mengarah pada produksi virus rekombinan tanpa kehadiran kontaminan, yang
semakin meningkatkan keamanan. Keuntungan ini berarti bahwa AAV telah menjadi vektor
dominan yang digunakan dalam uji klinis.

Beberapa kelemahan dengan menggunakan AAV termasuk ukuran virus yang relatif kecil
yang membatasi ukuran insert hingga maksimum sekitar 4 kilobase DNA asing. Imunitas
humoral yang sudah ada sebelumnya untuk AAV ditemukan pada 80% populasi manusia,
yang dapat ditingkatkan setelah pemberian vektor, berpotensi membatasi ekspresi transgen
( Peden 2004 , Sanftner 2004 ). Signifikansi dari fenomena ini tidak jelas untuk terapi
berbasis SSP, sebuah situs hak istimewa relatif, tetapi harus mendorong penelitian lebih
lanjut tentang signifikansi dan standarisasi titer antibodi penetral selama uji klinis.

2.2. Adenovirus

Generasi awal konstruksi adenoviral umumnya berbasis di sekitar serotipe 5 dan

mengandung penghapusan wilayah gen E1 dan / atau E3. Ini ditemukan kegunaan awal
untuk pekerjaan in vitro , tetapi dikaitkan dengan respons imun inang in vivo
yang signifikan dan toksisitas terkait, dengan kematian sel yang menyebabkan ekspresi
transgen sementara. Penghapusan gen virus lebih lanjut dalam vektor generasi ketiga yang
lebih baru ("gutless") telah mengurangi masalah ini secara signifikan ( Schiedner 1998 ),
menghasilkan ekspresi gen jangka panjang. Kelas virus ini memiliki beberapa keunggulan
teknis, termasuk kemudahan relatif dalam produksi stok tinggi dan ekspresi gen yang
umumnya kuat ( Verma 2005). Penggunaan yang lebih luas dari kelas vektor ini masih
terhambat oleh reaksi kekebalan yang disebabkan oleh protein kapsid virus, yang
kemungkinan akan tetap menjadi masalah yang persisten ( Kafri 1998 ).

2.3. Virus herpes simpleks

Virus herpes simplex memiliki beberapa keuntungan nyata untuk pengiriman SSP, termasuk
ukuran genom yang besar, dengan kapasitas pengemasan yang tinggi, neurotropisme dan
latensi episom yang berumur panjang. Genom virus terdiri dari 150 kb DNA untai ganda,
menyandikan lebih dari 80 gen. Dua kelas besar sistem vektor telah diturunkan - amplikon
dan vektor rekombinan. Amplikon vektor hanya berisi CIS urutan -acting ( ori dan pac ) dan
memerlukan sistem kemasan, biasanya disertakan di trans , dari pac kekurangan kosmid
encoded HSV-1 genom ( Cunningham 1993) .Vektor dengan penghapusan spesifik pada
polipeptida sel yang terinfeksi (ICP) -0 (ICP0), ICP4, ICP22 dan ICP47 intermediate gen awal
mempertahankan ketekunan yang berumur panjang, tampaknya tanpa toksisitas seluler
yang signifikan ( Samaniego 1998 ). Namun, beberapa masalah keamanan tetap ada, tetapi
kelas vektor ini tampak sangat menjanjikan ketika pengiriman konstruksi DNA besar
diperlukan ( Lachmann 1999 ). Penggunaan promotor spesifik, seperti promotor tirosin
hidroksilase, meningkatkan spesifisitas transduksi ( Cao 2008 ).

2.4. Lentivirus

Vektor lentiviral biasanya dipertimbangkan secara terpisah dari retrovirus lainnya, karena
mereka dapat secara efisien menginfeksi sel-sel yang membelah dan yang tidak membelah,
yang berpotensi mengarah pada ekspresi gen jangka panjang setelah integrasi
kromosom. Kebanyakan lentivirus didasarkan pada human immunodeficiency virus (HIV)
( Vigna 2000 ), dengan transgen dimasukkan di antara elemen yang dikenal sebagai
pengulangan terminal panjang (LTR), urutan yang diperlukan untuk integrasi genom
inang. Produk gen env biasanya disubstitusikan untuk sekuens dari virus RNA lain (seringkali
virus stomatitis glikoprotein vesikular VSV-G) untuk memberikan tropisme seluler yang luas,
termasuk neuron ( Naldini 1996). Spesifisitas lebih lanjut dapat diberikan melalui
penggunaan promotor asam fibrillary glial manusia (hGFAP) atau promotor enolase spesifik
neuron (rNSE), masing-masing memberikan kekhususan glial atau neuronal ( Jakobsson
2006 ). Kelas vektor ini memiliki beberapa keunggulan, termasuk kapasitas yang relatif besar
untuk gen yang dikloning (sekitar sembilan kilobase) ( Zhao 2007 ), tetapi kekhawatiran
terkait dengan kemungkinan peristiwa rekombinasi, yang menghasilkan virus kompeten
replikasi. Penggunaan dua atau tiga sistem transfeksi berbasis plasmid, di mana gen rakitan
kapsid diisolasi secara genetik telah meningkatkan profil keselamatan kelas vektor ini
( Zufferey 1997 ) dan kelas ini terlihat sangat menjanjikan untuk studi di masa depan.

3. Uji klinis dengan vektor terapi gen

Vektor terapi gen telah digunakan dalam uji klinis untuk pasien sejak 1990, dengan sebagian
besar pengalaman menggunakan vektor retroviral ( Verma 1997 ). Namun, antusiasme awal
muncul setelah kematian seorang pasien yang menerima vektor adenoviral sebagai
pengganti defek enzim atau defisiensi transcarbamylase ornithine ( Somia 2000). Kematian
pasien - dari peradangan sistemik dan kegagalan multiorgan - menyebabkan penangguhan
sementara percobaan pada tahun 1999. Sejak itu, kemajuan teknis dan kerangka kerja
peraturan yang lebih ketat telah menyebabkan peningkatan dalam uji klinis terdaftar
menggunakan terapi gen dan khususnya menggunakan AAV. Didorong oleh hasil yang
menguntungkan dalam studi praklinis menggunakan hewan mulai dari tikus hingga primata
bukan manusia, lebih dari 40 uji klinis menggunakan AAV sebagai vektor terapeutik saat ini
terdaftar di Badan Pengawasan Obat dan Makanan AS ( Mueller 2008 ).

Uji coba awal, seperti uji coba fase I AAV yang dikodekan faktor manusia IX pada pasien
dengan hemofilia B memberikan informasi keselamatan yang berguna ( Kay 2000 ). Setelah
injeksi vektor intramuskular, tingkat faktor IX yang disekresikan yang kecil namun terdeteksi
dapat diproduksi. Tidak ada toksisitas atau integrasi kromosom yang terlihat selama
penelitian. Sayangnya, kekebalan yang diperantarai sel terhadap AAV diamati, yang
menyebabkan kerusakan hepatosit dan akhirnya hilangnya ekspresi gen terapeutik ( Manno
2006). Studi Fase I dan II memeriksa hasil setelah pemberian intranasal atau endobronkial
dari AAV yang dikodekan pengatur konduktansi transmembran cystic fibrosis. Respon
antibodi terhadap AAV diamati, dengan efek biologis terbatas. Profil keamanan tampak baik,
tanpa ada efek samping yang terlihat pada 120 pasien yang diobati ( Mueller 2008 ).

Selain uji coba untuk PD ada beberapa uji klinis lain yang sedang berlangsung memeriksa
terapi gen yang dimediasi AAV ke SSP. Ini termasuk pengiriman okular gen RPE65 di Leber's
congenital amaurosis, tanpa dilaporkan toksisitas pada sejumlah kecil pasien yang dirawat
meskipun terjadi peningkatan sementara dalam antibodi penetralisir ( Simonelli 2009 ). Juga
sedang berlangsung adalah uji coba fase II menggunakan AAV untuk memberikan faktor
pertumbuhan saraf pada pasien dengan Penyakit Alzheimer ( Mandel 2010)). Sebuah uji
coba fase I baru-baru ini terhadap pengiriman AAV yang dimediasi oleh aspartoacylase
untuk penyakit Canavan melaporkan keamanan yang baik, dengan antibodi yang terdeteksi
pada AAV2 yang diamati dalam serum sebagian kecil pasien. Dalam kasus ini, vektor diinfus
secara intrakranial melalui lubang duri, yang dapat menjelaskan tidak adanya antibodi
penawar dalam cairan serebrospinal pasien dan kurangnya peradangan SSP (McPhee 2006).

4. Terapi gen untuk penyakit Parkinson

Clearly, several important issues need to be addressed when attempting therapeutic cellular
transduction (gene delivery and expression) for Parkinson’s disease. Most obvious is
deciding on the therapeutic target – the pathological process underlying PD is widespread
and involves multiple brain structures and their relevant cell signaling pathways. Great care
needs to be taken with the specific design of the therapeutic gene, including relevant
promoters, particularly if the construct is to be constitutively active.

Pendekatan paling sederhana adalah mengembalikan tingkat dopaminergik di ganglia basal,

biasanya melalui pengenalan gen yang mengkode enzim-enzim penting dalam produksi
dopamin ( Azzouz 2002 , Hadaczek 2010 ) atau protein pensinyalan sel yang relevan ( Kaplitt
1994 ). Satu seri awal percobaan meneliti transfer gen yang dimediasi AAV ke dalam CNS,
dengan injeksi kode virus untuk tirosin hidroksilase menjadi tikus 6-hydroxydopamine-lesi,
menemukan ekspresi transgen yang berkelanjutan, tanpa efek sitopatik dan tanpa gliosis
reaktif ( Kaplitt 1994 ). Strategi lain bertujuan untuk memperlambat kematian sel
dopaminergik, biasanya melalui produksi lokal dari faktor trofik seperti faktor neurotropik
yang diturunkan dari otak (BDNF) ( Hyman 1991 ,Klein 1999 ), faktor neurotropik turunan
garis sel glial (GDNF) ( Kordower 2000 , Bjorklund 2000 ) atau neurturin ( Marks 2008 ) untuk
meningkatkan kelangsungan hidup dan fungsi sel. Akhirnya, strategi alternatif ditargetkan
pada aktivitas abnormal ganglia basal, terutama nukleus subthalamic dan segmen internal
dan eksternal dari globus pallidus.

4.1. Glutamat decarboxylase

Telah diamati secara konsisten bahwa PD dikaitkan dengan penurunan aktivitas

penghambatan proyeksi nigrostriatal, menghasilkan aktivitas berlebih dari nukleus
subthalamic dan penghambatan thalamus yang berlebihan. Oleh karena itu dihipotesiskan
bahwa, dengan meningkatkan kadar asam γ-aminobutyric (GABA) yang diproduksi secara
lokal di inti subthalamic, jalur ini dapat dikembalikan ke keseimbangan dan meningkatkan
fungsi pasien. Jalur sintetis untuk GABA melibatkan aksi katalitik glutamat dekarboksilase
(GAD) pada glutamat, enzim yang ditemukan sebagai dua isoform yang berbeda secara
genetik - GAD65 dan GAD67 ( Erlander 1991 , Bu 1992). Ini memiliki sifat enzimatik yang
berbeda, persyaratan fungsional dan distribusi intraseluler. Studi eksperimental pertama
menggunakan AAV rekombinan (rAAV) yang mengkodekan isoform GAD65 dan GAD67 dari
asam glutamat dekarboksilase, dengan fungsi awalnya ditandai secara in vitro . Dua
konstruksi berbasis AAV2, AAV / rGAD65 dan AAV / rGAD67 mampu menginfeksi garis sel
secara produktif, dengan kedua gen ditranskripsi, yang mengarah ke produksi GAD65 dan
GAD67 yang aktif secara enzimatik ( Mi 1999 ).

CDNA kemudian digunakan dalam serangkaian percobaan in vivo , di mana GAD65 atau

GAD67 diproduksi oleh rAAV dengan bi cis yang dikodekan secara tronically green
fluorescent protein (GFP). Injeksi stereotactic berikutnya dari salah satu vektor ke dalam
STN menghasilkan ekspresi transgen yang lama (dipantau hingga lima bulan), tanpa terlihat
respon inflamasi. Distribusi seluler GAD seperti yang diharapkan untuk masing-masing
isoform - dengan GAD65 membran terbatas dan GAD67 sitosolik. Merangsang elektroda
dimasukkan ke dalam STN, dengan probe mikrodialisis dimasukkan ke dalam temuan SNr
secara signifikan meningkatkan pelepasan GABA setelah stimulasi STN pada tikus yang
diperlakukan dengan gen GAD65 ( Luo 2002). Tikus berkaki enam Parkinsonian 6-
hydroxydopamine (6-OHDA) kemudian disuntikkan dengan vektor virus, yang menyebabkan
peningkatan pelepasan GABA empat kali lipat setelah stimulasi STN. Ini dikaitkan dengan
peningkatan yang nyata dalam rasio penghambatan terhadap respons SNr rangsang. Yang
penting, kontrol (disuntik dengan GFP atau saline) memiliki respons yang tidak berubah,
yang menunjukkan bahwa hasil ini bukan terutama karena efek lesi lokal. Sebaliknya, tikus
yang diberi perlakuan GAD67 memiliki respons yang paling menggairahkan. Efek dan hasil
tambahan diperiksa, khususnya efek neuroprotektif potensial dari pemberian gen
GAD. Dengan pra-perawatan dengan GAD65 yang mengandung konstruk sebelum lesi 6-
OHDA, beberapa hasil fungsional (penggunaan ekstremitas dan rotasi yang diinduksi
apomorphine) meningkat secara signifikan dibandingkan dengan infus kontrol.

Studi selanjutnya meneliti sifat-sifat vektor ketika disuntikkan pada kera hemiparkinson
( Emborg 2007 ). Dalam model ini, MPTP diinjeksikan ke dalam arteri karotis, dengan injeksi
AAV-GAD atau kontrol GFP selanjutnya ke dalam STN ipsilateral. Selama periode 56 minggu,
13 kera (tujuh pada pengobatan aktif, enam kontrol) dipantau, menemukan ekspresi
transgen yang berkelanjutan, peningkatan parameter klinis (bradikinesia, tremor,
keterampilan motorik) pada hewan yang diobati dengan GAD dan peningkatan
ipsilateral 18 F -fluorodeoxyglucose (FDG) aktivitas motorik kortikal motorik PET. Semua
hewan bertahan hidup sampai titik akhir 1 tahun tanpa efek samping yang signifikan.

Didorong oleh hasil yang menjanjikan ini, percobaan label terbuka fase I dari injeksi vektor
virus subthalamic unilateral, menggunakan serotipe AAV2 yang mengkode GAD65 atau
GAD67 manusia di bawah kendali promotor CMV telah dilakukan ( Kaplitt 2007 ). Pasien
yang direkrut untuk percobaan - penggunaan pertama terapi gen untuk gangguan
neurodegeneratif dewasa - cukup khas untuk penyakit Parkinson idiopatik, dengan durasi
penyakit berkisar antara 6 hingga 13 tahun. Kriteria eksklusi termasuk penyakit kognitif atau
kejiwaan yang signifikan.

Protokol tersebut melibatkan kerangka stereotactic dan injeksi STN yang dipandu MRI dari
larutan 50 μl dari 1 (dosis rendah) hingga 10 (dosis tinggi) x 10 11 larutan genom /
ml. Suntikan unilateral dilakukan ke belahan otak yang paling simtomatik, meninggalkan sisi
kontralateral yang tidak diobati. Beberapa hasil diperiksa, termasuk keamanan, tolerabilitas,
gejala penyakit Parkinson yang dinilai oleh Unified Parkinson's Disease Rating Scale (UPDRS),
dan 18Pencitraan F-fluorodeoxyglucose (FDG) PET dilakukan secara buta, pada awal dan 12
bulan pasca operasi. Prosedur ini ditoleransi dengan baik, tanpa kematian atau komplikasi
neurologis yang tidak terduga selama masa studi. Penilaian pasca prosedur menemukan
peningkatan skor motor UPDRS dari 3 bulan, bertahan hingga 12 bulan pasca
operasi. Perubahan itu terutama terletak pada sisi tubuh kontralateral untuk
prosedur. Pencitraan PET menemukan penurunan yang signifikan dalam metabolisme
thalamik, ipsilateral dengan injeksi. Tidak ada perubahan dalam antibodi anti-AAV dan
GAD65 / 67 yang terlihat setelah operasi ( Kaplitt 2007 ).

Meskipun penelitian ini kecil dan tidak buta, prosedur ini tampak aman dan hasil klinisnya
menggembirakan. Beberapa manfaat pasti dari prosedur stimulasi otak dalam tradisional
termasuk kurangnya perangkat keras yang ditanamkan dan manfaat teoretis dapat
mencakup pendekatan yang lebih fisiologis untuk memulihkan fungsi jaringan motorik
melalui pelepasan GABA yang bergantung pada aktivitas. Temuan menunjukkan bahwa rilis
GABA dapat dikenakan jalur autoregulasi yang melibatkan GABA Areseptor STN. Kesimpulan
penuh dari uji coba Fase II diterbitkan baru-baru ini (LeWitt 2011), mengkonfirmasikan
peningkatan signifikan dalam skor UPDRS enam bulan setelah prosedur untuk kelompok
yang diobati AAV-GAD (menurun 8,1 poin p <0,0001), meskipun pasien yang dirawat juga
harus ditingkatkan (menurun sebesar 4,7 poin, p <0,003). Peningkatan terlihat pada subyek
yang diobati AAV-GAD secara signifikan lebih besar daripada pada subyek bedah palsu (p =
0,04). Tidak ada masalah keamanan tambahan yang diamati. Percobaan penting ini
menyoroti tidak hanya pentingnya memasukkan jumlah pasien yang signifikan (22 dan 23
dalam kelompok perlakuan dan kontrol masing-masing) untuk memberikan perbedaan studi
yang signifikan, tetapi juga kebutuhan untuk desain penelitian yang cermat, paling tidak
pada kelompok plasebo (yang termasuk protokol operasi palsu yang terperinci). Beberapa
pertanyaan dan masalah penting masih harus dijawab, khususnya (i) apakah efek
menguntungkan akan dipertahankan dalam jangka menengah dan panjang; (ii) apakah akan
ada efek samping jangka panjang dari pendekatan terapeutik ini, terutama penting dalam
vektor terapi gen di mana agen tersebut aktif secara konstitutif dan; (iii) bagaimana
pendekatan ini dibandingkan dengan pilihan terapi 'lanjutan' yang lebih tradisional, seperti
operasi otak dalam (DBS).

4.2. Faktor neurotropik turunan sel glial

Faktor neurotropik turunan garis sel glial (GDNF) dicirikan sebagai faktor neurotropik selektif
untuk neuron dopaminergik dari kemampuannya untuk meningkatkan penyerapan dopamin
dalam kultur otak tengah tanpa efek pada serotonin atau serapan asam amino butirat
(GABA) serapanin ( Lin 1993 ). Selain itu, GDNF mempromosikan kelangsungan hidup neuron
dopaminergik, penyerapan dopamin, ukuran tubuh sel dan pertumbuhan neurit ( Lin 1993 ),
dan karena itu diidentifikasi agen terapi potensial di PD.

Eksperimen awal di mana GDNF disuntikkan secara stereotidak ke dalam tikus yang diobati
dengan MPTP (yaitu menghilangkan koma setelah tikus) menemukan bahwa injeksi GDNF ke
striatum sebelum pengobatan MPTP dikaitkan dengan pelestarian kadar dopamin dalam
substantia nigra dan striatum dan diawetkan sel imunoreaktif TH striatal TH . Pengobatan
dengan GDNF pada setiap titik waktu ditunjukkan untuk meningkatkan fungsi motorik yang
dinilai oleh pergerakan, motilitas dan pemeliharaan dibandingkan dengan kontrol ( Tomac
1995 ).

Pendekatan awal untuk memberikan berkelanjutan in vivo GDNF menggunakan replikasi

adenovirus yang mengandung GDNF manusia dalam model tikus 6-hydroxydopamine (6-
0HDA) ( Choi-Lundberg 1997 ). Adenovirus GDNF secara signifikan meningkatkan
kelangsungan hidup sel dopaminergik substantia nigra dibandingkan dengan kontrol,
meskipun kadar protein dan mRNA tidak berkelanjutan dan semua hewan memiliki reaksi
inang di sekitar lokasi jarum. Eksperimen selanjutnya menggunakan GDNF encoding
lentivirus yang disuntikkan secara stereotactically pada monyet rhesus yang diobati dengan
MPTP ( Kordower 2000). Sekali lagi, substantia nigra yang disuntikkan secara lentivir
menunjukkan peningkatan level neuron imunoreaktif TH. Dalam serangkaian percobaan
lanjutan, hewan menampilkan skor fungsional yang ditingkatkan, dengan peningkatan yang
sesuai pada pemindaian FDG PET. Yang penting, dan berbeda dengan pendekatan
adenoviral, ekspresi transgen GDNF yang dikodekan lentivir dipertahankan sampai delapan
bulan dan respons inflamasi minimal. Kemungkinan reaksi idiosinkratik ditunjukkan, tetapi
tidak dirinci, yang merupakan penghilangan penting karena, misalnya, toksisitas serebelar
telah disebutkan sebagai faktor pembatas dalam beberapa kasus ( Berry 2010 ). Namun,
pendekatan ini menunjukkan janji, mendorong Amsterdam Molecular Therapeutics untuk
mendapatkan lisensi untuk menggunakan gen GDNF yang dikirimkan melalui platform virus
yang terkait adeno.

Uji coba masa depan terapi gen GDNF perlu dilakukan dengan perhatian cermat pada
subyek kontrol. Untungnya, sudah ada pengalaman yang cukup banyak menggunakan infus
putaminal berkelanjutan dari GDNF rekombinan. Uji coba open-label awal sangat
menggembirakan ( Gill 2003 , Patel 2005 ), menemukan peningkatan signifikan dalam skor
OFF dan ON UPDRS III dan peningkatan penyerapan FDG secara statistik. Namun diamati
dalam sebuah studi terpisah bahwa manfaat awal yang terlihat pada satu tahun telah
kembali ke garis dasar setelah periode satu tahun penghentian pengobatan ( Slevin
2007 ). Sayangnya, uji coba acak tersamar ganda fase I / II ( Lang 2006)) tidak mendukung
temuan label terbuka, hanya menemukan peningkatan penampilan FDG PET pada 6 bulan
dibandingkan dengan baseline dan peningkatan kesehatan mental yang diukur dengan
sistem penilaian SF-36 (sering digunakan untuk menilai parameter kualitas hidup) pada
kelompok yang dirawat secara aktif. Alasan untuk perbedaan antara hasil tidak jelas, tetapi
menyoroti pentingnya desain penelitian dan penggunaan subjek plasebo buta ganda,
termasuk prosedur operasi palsu.

4.3. Neurturin

Neurturin (NTN) pertama kali diidentifikasi 15 tahun yang lalu ( Creedon 1997 ), menemukan
urutan homologi dengan GDNF, dengan sifat neuroprotektif in vitro yang serupa. Ini
dikonfirmasi oleh percobaan in vivo berikutnya, mempromosikan kelangsungan hidup
neuron positif TH ketika disuntikkan ke substantia nigra dari 6-0HDA hewan yang diobati
( Horger 1998 ), dengan perbaikan dalam parameter fungsional. Stereotactic injeksi NTN
encoding vektor AAV ke dalam caudate nucleus, putamen dan substantia nigra dari monyet
yang diobati MPTP menemukan manfaat yang sama ( Kordower 2006 ), tanpa efek samping
yang signifikan pada tiga bulan dan satu tahun ( Herzog 2008 , Herzog 2009 ).

Temuan-temuan yang menjanjikan ini mengarah ke uji coba label terbuka Fase I AAV2-NTN
pada tahun 2008 ( Marks 2008), melibatkan 12 pasien (usia 35 hingga 75) dengan PD
responsif levodopa sedang hingga berat. Dalam kohort ini diagnosis ditegakkan untuk
minimal 5 tahun, pasien menggunakan dosis obat antiparkinson yang stabil, tetapi tanpa
kontrol yang baik dengan setidaknya 3 jam waktu “tidak aktif” per hari. Para peserta dibagi
antara kelompok perlakuan rendah dan tinggi dan menerima suntikan terpandu stereotaktik
secara bilateral di seluruh putamen. Peserta mengalami peningkatan yang signifikan dalam
skor motorik UPDRS Bagian III dalam periode "off" yang secara praktis didefinisikan
dibandingkan dengan baseline, rata-rata peningkatan 36%. Selain embolus udara yang
diduga, yang tidak menyebabkan komplikasi, tidak ada efek samping operasi yang penting
secara klinis.

Ini ditindaklanjuti dengan uji coba fase 2 acak ganda buta pertama terapi gen untuk penyakit
Parkinson, yang diterbitkan pada akhir 2010 ( Marks 2010). 58 peserta memenuhi kriteria
kelayakan yang sama sebagai studi label terbuka, dengan kelompok dibagi 2: 1 untuk
menerima baik AAV-NTN atau operasi palsu masing-masing, dengan penilaian pada awal
dan 1, 3, 6, 9 dan 12 bulan dan setiap 3 bulan setelah itu sampai pasien akhir terlihat pada
12 bulan. Pada setiap kunjungan, pasien dinilai dengan UPDRS dalam keadaan “tidak aktif”
yang praktis dan “aktif” terbaik. Jurnal rumah tangga dan kuesioner kualitas hidup juga
digunakan. Hasil utama - skor UPDRS Bagian III dalam keadaan "tidak aktif" tidak meningkat
secara signifikan pada 12 bulan. Berbagai hasil sekunder, termasuk skor mental (Bagian I)
dalam keadaan "tidak aktif" dan aktivitas skor kehidupan sehari-hari (Bagian II) dalam
keadaan "aktif" meningkat secara signifikan.

Untuk sejumlah kecil pasien yang ditindaklanjuti hingga 18 bulan, skor "off" UPDRS Bagian III
meningkat secara signifikan. Analisis histologis otak dua pasien dalam kelompok perlakuan
hanya mengungkapkan ekspresi terbatas dari protein neurturin dalam putamen dan bahkan
ekspresi yang lebih sederhana di substantia nigra. Tiga pasien dalam kelompok pengobatan
aktif mengalami tumor: satu glioblastoma, satu adenokarsinoma prostat dan satu
adenokarsinoma esofagus. PCR kuantitatif dari jaringan yang dibiopsi adalah negatif untuk
AAV-NTN dan analisis retrospektif dari MRI pra-prosedur menunjukkan bahwa glioblastoma
mendahului intervensi. Ada dua kematian pada kelompok perlakuan satu dari infark
miokard dan satu dari embolus paru. Sakit kepala, mual, nyeri pasca-prosedural,
diskinesa, insomnia dan memburuknya PD adalah efek samping yang paling sering
dilaporkan dan terjadi lebih sering pada pengobatan aktif dibandingkan dengan kelompok
operasi palsu. Efek samping serius setelah operasi terjadi pada kedua kelompok tanpa
sekuele neurologis yang berlangsung lama. Protein dan antibodi neurturin tidak terdeteksi
pada serum pasien.

Meskipun percobaan gagal menunjukkan perbedaan yang signifikan dalam titik akhir primer,
data yang dikumpulkan dari penelitian ini umumnya informatif. Alasan yang mendasari
kegagalan terapi tidak jelas, berpotensi berhubungan dengan tingkat neurturin yang tidak
memadai di lokasi patologi. Pekerjaan masa depan yang direncanakan, saat ini sedang
merekrut, juga akan mencakup injeksi langsung ke substantia nigra serta peningkatan dosis
(Clinical percobaan. Pengidentifikasi klinis NCT00985517).

4.4. Aromatic-L-amino decarboxylase (AADC)

Produksi dopamin baik dari levodopa endogen atau eksogen tergantung pada
dekarboksilase aromatik-L-amino (AADC). Ketika PD berkembang, pasien biasanya
memerlukan dosis L-dopa yang meningkat dan karena itu berisiko tinggi mengalami efek
samping obat. Didalilkan bahwa aktivitas AADC terkuras dalam PD dan bahwa pemulihan
terapeutik dari aktivitas ini dapat mengarah pada perbaikan klinis dan memungkinkan
pengurangan dosis levodopa ( Bankiewicz 2000 ).

Dalam serangkaian percobaan in vivo menggunakan monyet rhesus hemiparkinsonian yang

diinduksi oleh MPTP, AAV-AADC diinjeksikan ke kaudat dan putamen ( Bankiewicz
2000 ). Hal ini menyebabkan peningkatan aktivitas pelacak AADC in vivo dan pewarnaan
imunohistokimia, dengan pemulihan parsial terhadap kemampuan untuk mengubah
levodopa menjadi dopamin dalam uji ex vivo. Peningkatan pada berbagai skor fungsional
terlihat pada 24 bulan dan percobaan pencitraan berikutnya menemukan peningkatan level
AADC hingga 72 bulan ( Bankiewicz 2006 ).

Pekerjaan mendorong uji klinis yang sedang berlangsung di mana lima pasien, dengan
penyakit Parkinson yang responsif levodopa dan fluktuasi motor yang tidak tertahankan
meskipun terapi medis dioptimalkan (Hoehn dan Yahr tahap III-IV), menerima infus
putaminal bilateral 9 x 10 10 genom vektor dengan infus stereotactic. Tidak ada efek
samping yang dilaporkan yang disebabkan oleh infus AAV-AADC. Penyerapan FDG PET
meningkat secara signifikan pada 6 bulan dibandingkan dengan baseline. Tidak adanya
kontrol dalam studi keselamatan ini membuat interpretasi hasil klinis sekunder sulit,
meskipun ada peningkatan yang signifikan dalam total 6 bulan skor UPDRS dan mematikan
obat dan 3 peserta mampu mengambil levodopa dosis rendah ( Eberling 2008 ).

Kohort ini kemudian dibandingkan dengan 5 pasien yang menerima dosis tinggi (3 x
10 11 genom vektor) AAV-AADC ( Christine 2009 ). Yang menjadi perhatian, tiga pasien
mengalami perdarahan intrakranial, dan empat pasien mengalami peningkatan sementara
pada diskinesia. Dalam kedua kohort total skor UPDRS dan UPDRS III meningkat pada 6
bulan ketika dinilai obat “off”, tetapi tidak ada perbaikan yang signifikan terlihat obat “on”
dalam skor UPDRS IIII. Ini aneh, karena efek AAV-AADC dianggap tergantung pada terapi
levodopa, meskipun semua pasien dalam kelompok dosis tinggi mampu mengelola levodopa
dosis rendah, mengisyaratkan kemanjuran. Studi ini sedang berlangsung dan diharapkan
akan selesai pada 2013 di mana 60 bulan kemanjuran dan keamanan data akan tersedia.

4.5. Prosavin

Penyakit Parkinson berpotensi hasil dari defisiensi dalam beberapa langkah jalur sintetis
dopaminergik di mana L-tirosin diubah menjadi levodopa oleh enzim tirosin hidroksilase
(TH). GTP cyclohydrolase 1 (CH1) adalah enzim pembatas laju untuk generasi
tetrahydrobiopterin yang merupakan co-factor untuk TH. Levodopa kemudian dikonversi
menjadi dopamin yang aktif secara biologis oleh AADC. Dalam upaya merekonstitusi
langkah-langkah ini, gen yang mengkode untuk TH, CH1 dan AADC digabungkan menjadi
satu vektor lentiviral untuk administrasi ke striatum ( Azzouz 2002 ).

Peningkatan fungsional terlihat pada tikus lesi 6-0HDA yang disuntikkan secara
stereotactically, meskipun tampaknya peningkatan dopamin yang relatif rendah ( Azzouz
2002 ). Pengukuran mikrodialisis in vivo berikutnya dalam model kera MPTP menunjukkan
peningkatan kadar ekstraseluler yang lebih besar, sehingga kemanjuran terapeutik mungkin
lebih besar daripada yang dipikirkan sebelumnya ( Jarraya 2009 ). Monyet yang dirawat
menunjukkan pemulihan laju penembakan dan pola neuron di dalam ganglia basal dan
mengurangi aktivitas metabolisme dalam inti subthalamic, ditambah dengan perbaikan
fungsional. Tidak ada masalah keamanan yang dicatat.

Meskipun data peer review belum dipublikasikan, hasil awal dari uji klinis berkelanjutan
Tahap I / II Prosavin telah diumumkan. Sembilan pasien sekarang telah menerima Prosavin
dalam tiga kohort dosis 1x, dosis 2x dan dosis 2x dengan metode pengiriman yang
ditingkatkan. Kelompok pertama memiliki peningkatan motorik fungsional 20% pada 24
bulan dan kelompok kedua peningkatan 29% pada 12 bulan. Kelompok ketiga mengalami
peningkatan 26% dalam 3 bulan. Semua kohort telah mengalami peningkatan “ON” waktu,
penilaian kualitas hidup yang stabil atau lebih baik dan dosis levodopa yang stabil atau
berkurang. Sementara ini adalah pengumuman awal, hasilnya menggembirakan dan telah
mendorong inisiasi kohort dosis 5x yang dimulai awal 2011.

5. Kesimpulan

Meskipun telah dilakukan penelitian selama beberapa dekade, penyakit Parkinson adalah
kondisi neurodegeneratif progresif kronis yang tidak diketahui etiologi dan patogenesis yang
mendasarinya masih belum jelas. Meskipun ada keraguan tentang penggunaan pendekatan
terapi gen untuk kondisi ini, beberapa uji klinis Fase I dan II kini telah melaporkan temuan
klinis mereka, memberikan banyak pengalaman dan data. Penggunaan vektor terkait adeno
untuk terapi gen, dengan uji coba termasuk beberapa ratus pasien, tampaknya umumnya
aman, dengan sedikit prosedur terkait morbiditas.

Meskipun ada kekhawatiran yang pasti terkait dengan pengembangan kekebalan terhadap
AAV yang diberikan secara sistemik, yang mengarah pada penghancuran jaringan yang
ditransduksi, fenomena ini belum diamati dengan administrasi CNS, menunjukkan derajat
privilege kekebalan yang dapat menyebabkan efek terapeutik yang lebih
berkelanjutan. Kekhawatiran yang sedang berlangsung terkait terutama dengan pilihan
spesifik agen terapeutik, tempat tindakan dan tingkat produksi. Penggunaan promotor
mamalia yang tidak selektif (terutama secara konstitutif) seperti CMV, tidak mengizinkan
penyesuaian efek terapeutik. Model saat ini menunjukkan bahwa autoregulasi dapat terjadi
melalui jalur umpan balik homeostatik, tetapi ini belum ditunjukkan secara formal dan efek
jangka panjang pada fenotip seluler tidak diketahui.

Pemantauan berkelanjutan terhadap pasien yang direkrut ke dalam penelitian Fase I dan II
akan sangat penting untuk menentukan apakah manfaat yang diamati pada awalnya
dipertahankan dan untuk mencari komplikasi jangka panjang. Penelitian acak ganda lebih
lanjut secara acak, dengan tindak lanjut longitudinal yang sesuai akan diperlukan untuk
mengevaluasi efektivitas terapeutik dari agen kelas novel ini.

Perkembangan teknologi lebih lanjut mungkin terjadi, khususnya yang melibatkan

penggunaan vektor virus berbasis AAV yang lebih canggih. Ini dapat menggunakan lebih
banyak promotor neuron-spesifik (misalnya neuron spesifik enolase atau promotor gen
synapsin 1) dan mengatur produksi protein melalui penggunaan sistem yang diinduksi
(misalnya berbasis ecdysone) untuk mengontrol aktivitas terapi dengan cara yang lebih
terarah. Meskipun masih dalam masa pertumbuhan, teknologi ini masih menunjukkan
harapan besar sebagai pendekatan terapi baru untuk penyakit yang menghancurkan ini.