II.

DASAR TEORI
Kromatografi Lapis Tipis (KLT) merupakan bentuk kromatografi planar. KLT
merupakan metode pemisahan campuran analit dengan mengelusi analit melalui suatu
lempeng kromatografi lalu melihat komponen/analit yang terpisah dengan
penyemprotan atau pengecatan. Dalam bentuknya yang paling sederhana, lempeng-
lempeng KLT dapat disiapkan di laboratorium, lalu lempeng diletakkan dalam wadah
dengan ukuran yang sesuai, lalu kromatogram hasil dapat discanning secara visual.
Dalam bentuk yang lebih canggih, terdapat berbagai jenis lempeng KLT, teknik
penotolan sampel, termasuk alat penotol sampel yang telah diotomatisasi, tempat
pengembangan, alat pendeteksi, serta penjerap (fase diam) yang banyak tersedia di
pasaran dengan berbagai jenis.
Fase gerak yang lebih dikenal sebagai pelarut pengembang akan bergerak
sepanjang fase diam karena pengaruh kapiler pada pengembangan secara menaik
(ascending), atau karena pengaruh gravitasi pada pengembangan secara menurun
(descending). Beberapa keuntungan KLT adalah:
1. KLT banyak digunakan untuk tujuan analisis
2. Identifikasi pemisahan komponen dapat dilakukan dengan pereaksi warna ,
fluoresensi, atau dengan menggunakan radiasi menggunakan sinar ultraviolet
3. Dapat dilakukan elusi secara menaik (ascending), menurun (descending), atau
dengan cara elusi 2 dimensi, dan
4. Ketepatan penentuan kadar akan lebih baik karena komponen yang akan
ditentukan merupakan bercak yang tidak bergerak.
Gambaran utama yang mengatur kemampuan daya pisah lempeng KLT adalah
ukuran bercak (spot) dan dimensi fisik lempeng, dengan diameter sebesar 0,5 cm dan
panjang lempeng pada umumnya 10 cm. dengan ukuran seperti ini, lempeng hanya
mampu memisahkan 20 analit secara optimal supaya terpisah secara sempurna.
Kecepatan fase gerak bervariasi disepanjang lempeng KLT. Semakin jauh fase gerak
melewati lempeng maka kecepatannya akan semakin menurun. Penentuan nilai Rf
dalam suatu system KLT yang berbeda merupakan cara yang harus dilakukan ketika
melakukan identifikasi untuk membuktikan adanya suatu komponen /analit yang
dituju dalam sampel.
PENJERAP/FASE DIAM KLT
Dua sifat penjerap yang penting adalah ukuran partikel dan fase diam yang
digunakan dalam KLT merupakan penjerap berukuran kecil dengan diameter partikel
antara 10-30 μm. Semakin kecil ukuran rata-rata partikel fase diam dan semakin
sempit kisaran ukuran fase diam, maka semakin baik kinerja KLT dalam hal
efisiensinya dan resolusinya. Beberapa fase diam yang banyak dijual dipasaran:
1. Silika Gel
Silica gel merupakan penjerap yang paling sering digunakan dalam studi
KLT. Silica gel disiapkan dengan hidrolisis natrium silikat menjadi asam
polisilikat yang mengalami kondensasi dan polimerisasi lebih lanjut menghasilkan
bahan silica gel. Daya pisah akan meningkat seiring dengan semakin seragam dan
kecilnya ukuran partikel. Lempeng KLT silica gel yang beredar dipasaran
mempunyai rata-rata ukuran partikel 10 μm dengan kisaran ukuran partikel yang
lebih sempit.
Lempeng-lempeng KLT tersedia dengan indicator fluoresen (bahan yang
berfluoresensi atau berpendar), yang biasanya berupa seng silikat atau fosfor yang
diaktivasi oleh mangan (Mn), yang akan mengemisikan suatu fluoresensi hijau
ketika diradiasi / disinari dengan lampu UV pada panjang gelombang 254 nm.
Senyawa-senyawa yang mampu menyerap sinar UV akan muncul sebagai bercak-
bercak hitam terhadap dasar yang berfluoresensi hijau disebabkan oleh adanya
peredaman fluoresensi.
2. Alumina
Alumina dapat digunakan dengan atau tanpa pengikat dan penggunaannya
tanpa pengikat lebih umum dibandingkan silica gel. Alumina merupakan penjerap
yang kuat dan dapat berfungsi sebagai penukar ion amfoterik, tergantung pada
sifat permukaan dan pelarut yang digunakan. Alumina yang digunakan TLC
bersifat sedikit basa (pH 9), ada juga yang bersifat netral (pH 7) dan alumina yang
bersifat asam (pH 4).
3. Selulosa
 Selulosa mengandung air yang teradsorbsi yang tertahan pada struktur
glukopiranosa dengan ikatan hydrogen dengan demikian, pemisahan terjadi
melalui mekanisme partisi. Bahan-bahan selulosa hampir digunakan secara
eklusif untuk pemisahan senyawa-senyawa hidrofilik seperti asam amino dan
gula, berlawanan dengan silica gel dan alumina yang digunakan utnuk pemisahan
senyawa-senyawa lipofilik.

FASE GERAK
Pelarut/fase gerak yang digunakan harus cukup murah, karena biasanya sejumlah
besar fase gerak digunakan untuk elusi. Pelarut yang digunakan pada fase gerak KLT
harus berupa pelarut dengan kemurnian yang tinggi. Fase gerak yang biasa digunakan
adalah pelarut organic. Dapat digunakan satu macam pelarut organic saja ataupun
campuran. Bilaman fase gerak merupakan campuran pelarut organic dengan air maka
mekanisme pemisahan adalah partisi. Pemilihan pelarut ini sangat penting karena akan
menentukan keberhasilan pemisahan. Senyawa polar akan lebih cepat terelusi oleh fase
gerak yang bersifat polar daripada fase gerak non polar. Sebaliknya, senyawa non polar
lebih mudah terelusi oleh fase gerak non polar daripada fase gerak yang polar.

APLIKASI (PENOTOLAN) SAMPEL

Sampel harus diaplikasikan/ ditotolkan pada lempeng KLT dengna sangat hati-
hati.pada umunya, sampel secara manual ditotolkan melalui pipa kapiler, mikropipet atau
melalui penyuntik mikro kaca yang telah terkalibrasi sedemikian rupa sehingga tetesan
yang dating tepat menyentuh permukaan lempeng. Pemisahan pada KLT yang optimal
akan diperoleh hanya jika menotolkan sampel dengan ukuran bercak sekecil dan sesempit
mungkin. Sebagaimana dalam prosedur kromatografi yang lain, jika sampel yang
digunakan terlalu banyak maka akan menurunkan resolusi. Penotolan sampel yang tidak
tepat akan menyebabkan bercak menyebar dan puncak ganda. Jarak antar pusat penotolan
bercak sebaiknya lebih dari 1 cm, bercak sebaiknya berdiameter antara 2-5 mm dan tidak
terlalu dekat dengan ujung lempeng (sebaiknya jaraknya 1,5 cm dari ujung pada lempeng
20 X 20 cm).
III. ALAT DAN BAHAN
BAHAN
Methanol, HCl 2N, Ekstrak Binahong, Kloroform, Etil Asetat, N-Heksan, Larutan KOH 10%
dalam methanol, pereaksi FeCl3, pereaksi Lieberman Burchard, Larutan H2SO4 10%.
ALAT
Plat KLT, Pipa Kapiler 2 μm, Lampu UV, Batang Pengaduk, Erlenmeyer, timbangan digital,
aluminium foil, cawan porselin, kaca arloji, pipet tetes, gelas ukur, waterbatch

Prosedur
1. Identifikasi golongan senyawa alkaloid secara KLT
Ditimbang ekstrak sebanyak 100 mg ditambahkan HCl 2N sebanyak 5 ml kemudian
dipanaskan diatas penangas air, diaduk selama kurang lebih 5 menit. Setelah itu
didinginkan, disaring, filtartnya ditambahkan tetes demi tetes NH 4OH sampai menjadi
basa (pH 9-10). Kemudian larutan diekstraksi 3 kali menggunakan kloroform dengan
volume yang sama. Kemudian dikocok terbentuk 2 lapisan. Lapisan bawah kloroform
lapisan atas air. Kloroform diambil menggunakan pipet tetes dipindahkan kecawan
porselin, fraksi kloroform diuapkann di waterbatch.setelah kering kemudian ditotolkan
pada plat KLT. Uji kromatografi lapis tipis ini menggunakan :
Fase diam : silica gel 60F254
Fase gerak : kloroform-metanol (9 :1)
Penampakan noda : pereaksi dragendorff
Adanya senyawa golongan alkaloid ditunjukan dengan timbulnya noda berwarna jingga.
Ditentukan nilai Rf.

2. Identifikasi senyawa golongan flavonoid

Ditimbang ekstrak sebanyak 10 mg dilarutkan dalam 1 ml methanol kemudian ditotolkan
pada plat KLT. Uji KLT ini mengunakan :
Fase diam : Silika gel 60F254
Fase gerak : etil asetat- methanol (8 :2)
Penampakan noda : larutan H2SO4 10%
Adanya senyawa golongan flavonoid ditunjukkan dengan timbulnya noda berwarna
kuning. dientukan nilai Rf.

3. Identifikasi senyawa golongan Triterpenoid/Steroid secara KLT

Ditimbang ekstrak sebanyak 10 mg dilarutkan dalam 1 ml methanol kemudian ditotolkan
pada plat KLT. Uji KLT ini mengunakan :
 Fase diam : silica gel 60F254
Fase gerak : klorofrm – methanol (9-1)
Penampak noda : Pereaksi Lieberman Burchard
Adanya senyawa golongan triterpenoid/steroid ditunjukkan dengan timbulnya noda
berwarna ungu atau merah ungu (triterpenoid) dan hijau biru (steroid). Ditentukan nilai
Rf.
4. Identifikasi senyawa golongan tannin secara KLT
Ditimbang ekstrak sebanyak 10 mg dilarutkan dalam 1 ml methanol kemudian ditotolkan
pada plat KLT. Uji KLT ini mengunakan :
Fase diam : silica gel 60F254
Fase gerak : kloroform-metanol (7:3)
Penampak noda : pereaksi FeCl3
Adanya senyawa golongan tanin ditunjukkan dengan timbulnya noda berwarna hitam.
Ditentukan nilai Rf.

5. Identifikasi senyawa golongan antrakuinon secara KLT

Ditimbang ekstrak sebanyak 10 mg dilarutkan dalam 1 ml methanol kemudian ditotolkan
pada plat KLT. Uji KLT ini mengunakan :
Fase diam : silica gel
Fase gerak : N-Heksan-etil asetat (3 : 7)
Penampakan noda : larutan KOH 10% dalam methanol
Adanya senyawa golongan antrakuinon ditunjukkan dengan timbulnya noda berwarna
kuning, kuning coklat, merah unggu, atau hijau unggu. Ditentukan nilai Rf.