Daftar isi tersedia di

Kimia Pangan
beranda jurnal:

Karakterisasi aktivitas polifenol oksidase pada mangga Ataulfo

⇑
Summervir Cheema, Monika Sommerhalter
Departemen Kimia dan Biokimia, Universitas Negeri California East Bay, 25800 Carlos Bee Blvd., Hayward, CA 94542, AS

articleinfo
abstrak
Sejarah artikel:
Diterima 9 April 2014 Ekstrak kasar Ataulfo menunjukkan aktivitas polifenol oksidase (PPO) dengan pyrogallol, 3-
Diterima dalam bentuk revisi 2 September methylcatechol, catechol, asam galat, dan asam protocatechuic. PH optima yang bergantung pada
2014 Diterima 4 September 2014 substrat berkisar dari pH 5,4 hingga
Tersedia online 16 September 2014 6.4 dengan konstanta Michaelis-Menten antara 0.84 ± 0.09 dan 4.6 ± 0.7 mM diukur dalam buffer MES
atau fosfat. Penggunaan buffer asetat menghasilkan konstanta Michaelis-Menten yang lebih besar,
Kata kunci: hingga
Aktivitas Enzim 14,62 ± 2,03 mM. Sodium askorbat, glutathione, dan asam kojic merupakan inhibitor yang menjanjikan
Enzim untuk mencegah pencoklatan enzimatik di Ataulfo. Aktivitas PPO meningkat seiring kematangan dan
Mangga polifenol selalu lebih tinggi di kulit dibandingkan dengan pulpa. Sodium dodecyl sulphate (SDS) meningkatkan
oksidase Ataulfo
aktivitas PPO, dengan pulpa menunjukkan peningkatan yang lebih kuat daripada kulit. Gel SDS-PAGE
yang diwarnai untuk aktivitas katekolase menunjukkan beberapa pita, dengan pita yang paling
menonjol pada berat molekul 53, 112, dan 144 kDa.
© 2014 Elsevier Ltd. Semua hak dilindungi
undang-undang.

1. pengantar diangkut. Memar menyebabkan kecoklatan dan membatasi daya tarik

visual dan palpabilitas buah. Pencoklatan dimulai
Mangga (Mangifera indica) semakin penting sebagai buah
komoditas di Belahan Barat. Konsumsi mangga di Amerika Serikat, ⇑ Penulis yang sesuai. Telp .: +1 510885 3427.
misalnya, terus meningkat dari 0,2 kg per orang pada tahun 1985 Alamat email: monika.sommerhalter@csueastbay.edu (M. Sommerhalter).
menjadi 1,0 kg per orang pada tahun 2010 (USDA, 2014). Mangga
dianggap sebagai sumber antioksidan yang sangat baik, termasuk
senyawa fenolik, karotenoid, dan vitamin C (Ribeiro Queiroz, de
Queiroz, Campos & Sant'Ana, 2007). Knight, Campbell, dan
Maguire (2009) menjelaskan lebih dari enam puluh kultivar
mangga penting secara ekonomi yang berbeda dalam bentuk,
warna, tekstur, dan rasa. Kultivar berikut ini populer di Belahan
Barat: Tommy Atkins, Haden, Kent, Keitt (keempatnya
dikembangkan di Florida), Francis dari Haiti, dan Ataulfo
ditemukan di Meksiko (Galán Saúco, 2010). Berdasarkan Manthey
dan Perkins-Veazie (2009), kultivar Ataulfo tidak biasa dalam hal
kapasitas antioksidannya yang tinggi. Varian mangga ini, dengan
warna kuning cerah, bentuk lonjong tipis, rasa manis, dan daging
tanpa tali, sudah sangat populer di Meksiko dan menarik minat
konsumen di negara lain (Galán Saúco, 2010). Khususnya, Meksiko
adalah negara pengekspor mangga utama, dengan 0,28 juta ton
dilaporkan untuk ekspor mangga pada tahun 2011. Data ini
termasuk kontribusi kecil dari manggis dan jambu biji (FOASTAT,
2014). Budidaya Ataulfo sangat penting secara ekonomi untuk
wilayah Chiapas di Meksiko (Hanemann, Bourns, & Fertziger,
2008).
Ataulfo dan mangga lainnya mudah memar saat dipanen dan
oleh polifenol oksidase (PPO). Enzim yang mengandung
tembaga ini mengkatalisis oksidasi senyawa fenolik menjadi
quin yang sangat reaktif yang berpolimerisasi menjadi melanin
berwarna gelap (Yoruk & Marshall, 2003; Mayer, 2006). Di
beberapa pabrik, PPO juga mengkatalisis hidroksilasi
monofenol menjadi orto-difenol (aktivitas monofolase atau
kresolase; EC 1.14.18.1) diikuti dengan oksidasi yang lebih
umum dari orto-difenol menjadi orto-kuinon (aktivitas
difenolase atau katekolase, EC 1.10.3.1). PPO terlibat dalam
penyembuhan luka, pertahanan patogen, dan beberapa proses
seluler lainnya, seperti kontrol kadar oksigen dalam kloroplas
(Constabel, Bergey, & Ryan, 1995; Mayer, 2006).
Karakterisasi aktivitas PPO pada mangga dan buah-buahan
lainnya sangat menarik bagi industri pangan dan pertanian.
Studi tentang enzim PPO yang diekstrak dari ampas mangga
varietas Tainong (Wang et al., 2007), getah mangga dan kulit
varietas Kensington Australia (Robinson, Loveys, & Chacko,
http://dx.doi.org/10.1016/j.foodchem.2014.09.011
0308-8146 / © 2014 Elsevier Ltd. Semua hak
dilindungi undang-undang.
1993), dan inti dari varietas mangga Afrika (Arogba, Ajiboye,
Ugboko, Essienette, & Afolabi, 1998) telah dilakukan. Tujuan dari
penelitian kami adalah untuk mengkarakterisasi aktivitas PPO
pada kulit dan daging buah mangga varietas Ataulfo. Dengan
memilih buah dalam berbagai tahap kematangan, kami mengikuti
perubahan aktivitas PPO dengan pematangan buah. Kami juga
menyelidiki spesifikasi substrat, ketergantungan pH, dan
efektivitas inhibitor untuk lebih memahami bagaimana
pencoklatan enzimatis dapat dicegah pada mangga Ataulfo.
2. material dan metode
2.1. Bahan kimia
Katekol, asam etilenadiaminetetraasetat (EDTA), asam galat
monohidrat, asam kojat, polivinilpirolidon, protocatechuic
asam, pirogallol, natrium asetat, natrium azida, natrium dodesil
sulfat, dan basa TRIS diperoleh dari Sigma-Aldrich (St. Louis, MO,
USA). Semua reagen lainnya, termasuk 2-mercaptoethanol, 2- (N-
morpholino) ethanesulphonic acid, 3-methylcatechol, asam sitrat,
glutathione tereduksi, glisin, asam klorida, natrium askorbat,
natrium benzoat, natrium klorida, natrium metab-isulfit, natrium
monobasa fosfat, dibasa natrium fosfat heptahidrat, asam asetat
glasial, dan N, N-dietil-p-fenilenidimina sulfat, diperoleh dari
Fisher ScientiFc (Pittsburgh, PA, USA).
2.2. Persiapan ekstrak kasar
Mangga Ataulfo berlabel PLU kode # 4312 dari '' Mar- athon -
Produce of Mexico '' diperoleh dari supermarket setempat.ket di
California. Buah disimpan pada suhu kamar di tempat yang
kering. Ekstrak kasar disiapkan pada berbagai tahap kematangan
yang ditentukan dengan inspeksi visual dan sensorik. Berdasarkan
deskripsi warna dan kekokohan, tahapan kematangan kita R1
sampai R4 sangat mirip dengan tahapan RS1 sampai RS4 yang
ditetapkan olehPalafox- Carlos, Yahia, Islas-Osuna, dkk. (2012).
Panggung R1 sangat hijau, belum matang, dan sulit disentuh. Stage
R2 berwarna hijau dengan bercak kuning, tetapi masih keras dan
belum matang, sedangkan stage R3 dan R4 sudah matang dan
agak empuk jika disentuh dengan bertambahnya warna kuning.
pewarnaan. Dua tahap yang terlalu matang, R5 dan R6, dengan
peningkatan pewarnaan coklat juga disertakan. Stage R6 sangat
lembut saat disentuh. Kulit dan daging buah masing-masing
dipisahkan satu sama lain dengan silet dan selanjutnya dipotong
kecil-kecil sebelum dicampur tiga kali dalam interval 30 detik
dengan buffer ekstraksi yang terdiri dari buffer natrium fosfat 0,1
M, pH 6,8 dengan 1% w / v polivinilpirolidon. Perbandingan berat
kulit atau pulp dalam gram terhadap volume buffer ekstraksi
dalam mililiter adalah 1: 5 dengan pengecualian sampel R6-skin
yang menggunakan rasio 1:10, karena batch ini menghasilkan
bahan yang sangat padat dan tebal. ekstrak. Untuk menyaring
kondisi pengujian terbaik, ekstrak kasar lainnya telah dikupas
dengan tambahan kuning, mangga Ataulfo matang (tahap R3)
termasuk kulit dan pulpa. Semua ekstrak diklarifikasi oleh pusat
trifugasi selama 30 menit pada 37.750 g dan 4 ° C. Semua sampel
disimpan di atas es atau disimpan dalam alikuot kecil pada suhu -
80 ° C sampai digunakan lebih lanjut.
2.3. Penentuan kandungan protein
Kandungan protein total ditentukan dengan menggunakan
metode Bradford (Bradford, 1976). Reagen pengujian protein
Coomassie dan standar gamma globulin sapi pra-dilusi dari
Pierce Bio-technology diperoleh dari Thermo Scientifc.
Pengukuran absorpsi pada 595 nm dilakukan dengan pembaca
plat Synergy H1 dari Biotek. Untuk memvalidasi metode
ekstrak kasar dari pengenceran serial Ataulfo disiapkan dengan
sampel R3-pulp,
Tabel 1
Aktivitas PPO untuk substrat difenol dan tripenol dengan informasi absorptivitas molar produk kuinon dan panjang gelombang yang dipantau.
Substituen R dan R0Panjang gelombang (nm)Geraham absorptivitas (M — 1 cm — 1)pH-optimum
Katekol R @ R0 @H 420
3-Metil-katekol R @ H , R0 @ CH3 400
Pyrogallol R @ H , R0 @OH 320
Asam protocatechuic R @ COOH , R0 @H. 420
Asam galat R @ COOH , R0 @OH 380
Sebuah
Ekstrak mangga memiliki kadar protein total 2,42 ± 0,30 mg / mL dan rasio ekstraksi 0,2 g mangga per satu mL buffer ekstraksi. Aktivitas PPO ditentukan dengan
konsentrasi substrat 30 mM. Nilai pada pH optimum dilaporkan.
b, c
Nilai absorptivitas molar ditentukan masing-masing dalam buffer fosfat (b) atau asetat (c).
R4-pulp, R3-skin, dan R4-skin. Uji Bradford menghasilkan
respons linier dalam kisaran konsentrasi 0,1–1,0 mg / mL
protein total dengan koefisien korelasi 0,95 atau lebih tinggi.
Semua sampel diencerkan dengan air deionisasi sehingga
kandungan proteinnya berada dalam kisaran linier ini.
2.4. Pengukuran aktivitas PPO
Aktivitas fenol oksidase ditentukan dengan memantau
pembentukan produk kuinon berwarna dari berbagai substrat di-
dan trifenol melalui pengukuran absorbansi bergantung waktu
menggunakan pembaca pelat Synergy H1 dari Biotek. Suhu
dulusetel ke 25 ° C. Campuran uji tipikal mengandung 20 lL ekstrak
mangga dengan volume reaksi total 300 lL. PH dikontrol
dengan menggunakan berbagai buffer dengan kekuatan 60 mM.
Natrium asetat digunakan untuk menutupi kisaran pH 3,8-5,6.
Natrium fosfat dan asam etanasulfonat (MES) 2- (N-morpholino)
digunakan untuk rentang pH masing-masing 5,6–7,8 dan 5,2–6,6.
Tris-HCl digunakan untuk menutupi kisaran pH 7,2-9,0.
Konsentrasi substrat divariasikan antara 0,2 dan 30 mM untuk
menentukan parameter kinetik enzim, KM. Kurva aktivitas PPO
yang bergantung pada substrat cocok dengan persamaan
Michaelis-Menten menggunakan program Enzfilter dari Biosoft.
Dalam percobaan untuk menentukan pH optima dan spesifikasi
substrat atau efektivitas inhibitor konsentrasi substrat akhir dalam
campuran assay adalah 30 mM. Untuk menentukan keefektifan
berbagai inhibitor, dilakukan uji aktivitas PPO dalam buffer
natrium fosfat 60 mM, pH 5. 8 dengan katekol 30 mM dan
konsentrasi inhibitor berbeda pada kisaran 20-0,02 mM. Dua
kontrol, tanpa ekstrak mangga atau tanpa substrat, dikurangkan
dari semua uji utama. Di seluruh teks, nilai aktivitas PPO diberikan
dalam Unit Internasional (disingkat IU). Satu IU sesuai dengan
pembentukan satu IU
ltahi lalat quinone per menit. Untuk mengekspresikan PPO
aktivitas di IU, LambertHukum Beer digunakan dengan nilai
absorptivitas molar (e) ditentukan secara individual untuk setiap
produk kuinon. Kemiringan yang diukur (absorbansi / menit)
dibagi dengan nilai absorptivitas molar, e, dan faktor koreksi
panjang jalur, l, dari pembaca pelat diikuti dengan banyak
tiplikasi dengan volume assay, V.Nilai absorptivitas molar untuk
setiap produk kuinon ditentukan dengan mengoksidasi substrat
difenol dengan 20 kali lipat kelebihan natrium periodat seperti
yang dijelaskan oleh Munoz dkk. (2006). Kemiringan kalibrasi ini
kurva menghasilkan nilai absorptivitas molar, e (lihat Tabel 1).
2.5. Elektroforesis protein
Sampel Ataulfo kulit dan pulp disiapkan dalam kondisi
denaturasi sebagian dengan mencampurnya dengan buffer
pemuatan dengan volume yang sama terdiri dari 1% w / v SDS,
20% v / v gliserol, dan 100 mM TRIS, pH 6,8. Sampel tidak
dipanaskan atau dikurangi.
Aktivitas PPO (IU / mL)
1110b atau 1225c 5.4–5.6 0,21 ± 0,02
1160b atau 1420c 5.4–5.6 0,22 ± 0,01
3060b, c 5.8 0,50 ± 0,05
1100b 6.2–6.4 0,059 ± 0,001
1610b 6.2–6.4 0,16 ± 0,01
Gel tris-glisin dengan gradien akrilamida 4-20% dan standar
protein pra-pewarnaan See-Blue diperoleh dari Lifescience
Technology. Gel dijalankan di ruang dingin pada 4 ° C dan
tegangan konstan 125 mV selama sekitar 1,5 jam dalam buffer
berjalan yang terdiri dari 3,02 g basis TRIS, 18,8 g glisin, dan 1 g
SDS per liter air yang disaring. Gel diwarnai untuk aktivitas PPO
sesuai prosedurRescigno, Sollai, Rinaldi, Soddu, dan Sanjust (1997)
dengan pengecualian mengganti reagen butil-katekol tersier untuk
katekol. Gambar gel direkam dengan ChemiDoc MP Imaging
System dari BioRad. Penentuan bobot molekul semu dilakukan
dengan perangkat lunak Image Lab dari BioRad.
3. hasil dan Diskusi
3.1. Parameter yang memiliki pengaruh terhadap aktivitas PPO pada
ekstrak mangga mentah Ataulfo
Substrat yang paling umum digunakan untuk menilai
aktivitas PPO pada buah atau sayuran adalah senyawa fenolik
yang berasal dari katekol. Seperti yang dirangkum dalamTabel
1, katekol, 3-metilkatekol, piroalol, asam protocatechuic, dan
asam galat digunakan dalam penelitian ini. Asam galat adalah
salah satu senyawa fenolik paling melimpah yang terdeteksi
pada buah mangga (Kim, Brecht, & Talcott, 2007; Palafox-
Carlos, Yahia, González-Aguilar, 2012). Aktivitas PPO tertinggi
ditemukan pada senyawa tri-fenolik pyrogallol. Katekol dan 3-
metilkatekol menunjukkan reaktivitas yang serupa. Kehadiran
gugus hidroksil tambahan, seperti yang ditemukan dalam
pirogallol, oleh karena itu meningkatkan aktivitas PPO berbeda
dengan gugus metil atau atom hidrogen pada posisi yang sama.
Substrat yang membawa gugus asam karboksilat menunjukkan
aktivitas PPO terendah. Asam galat, senyawa tri-fenolik,
merupakan substrat yang lebih unggul dibandingkan dengan
asam protocatechuic, senyawa di-fenolik.
Profil pH untuk oksidasi katekol yang dikatalisis PPO, 3-
methylcatechol, pyrogallol, protocatechuic acid, dan gallic acid
ditunjukkan pada Gambar 1. Katekol dan 3-metilkatekol
menunjukkan pH optimum yang sama pada 5,4-5,6. Kehadiran
gugus hidroksil tambahan dan / atau gugus asam karboksilat
meningkatkan pH optimum
120,0%
100,0%
80,0%
relative Kegiatan
60,0%
40,0%
20,0%
0,0%
3.544.555.566.5
7
Gambar. 1. Ketergantungan aktivitas PPO pada nilai pH untuk substrat katekol (kotak putih), 3-metilkatekol (segitiga abu-abu), pirogallol (lingkaran hitam), asam protokatekuat (berlian
abu-abu), dan asam galat (lingkaran putih). Untuk setiap substrat, nilai aktivitas relatif dinormalisasi dengan nilai aktivitas PPO yang diberikan Tabel 1. Pengukuran dilakukan dalam
reaksi yang dikatalisis PPO. Pada nilai pH di atas 7,0, uji kontrol
dengan senyawa tripenol, pirogallol dan asam galat, menunjukkan
laju oksidasi otomatis yang tinggi dengan tidak adanya ekstrak
mangga, mendekati dan hampir melebihi laju reaksi katalis enzim.
Untuk semua kondisi lain, uji kontrol menunjukkan kecepatan
yang dua lipat lebih kecil dari reaksi terkategori utama. Daging
buah mangga diketahui bersifat asam dengan nilai pH pada atau di
bawah pH 4 (Mannan, Khan, Islam, Islam, & Siddiqa, 2003;
Tovar, Garc´sayaSebuah, & Mata, 2001). Asam organik utama hadir di
daging buah mangga adalah asam sitrat dan asam malat (Medlicott
& Thompson, 1985). Pada nilai pH rendah seperti itu, tidak ada
substrat yang diuji yang menunjukkan aktivitas PPO yang
signifikan. Selain itu, selama organel sel masih utuh, sebagian
besar senyawa fenolik akan tertutup dalam vakuola yang terpisah
dari lokasi sub-seluler PPO (Toivonen & Brummell, 2008).
Pencoklatan yang dimulai oleh PPO dengan substrat internal,
seperti asam galat, hanya menjadi penting jika integritas
kompartemen seluler rusak, oksigen tersedia, dan pH lokal tidak
terlalu asam.
Tes aktivitas PPO dengan konsentrasi substrat yang bervariasi
menunjukkan profil Michaelis-Menten yang khas dalam kisaran
konsentrasi 0,2-30 mM. Konsentrasi substrat yang lebih tinggi
sering kali mengakibatkan pembentukan larutan buram atau
presipitasi. Hal ini mungkin disebabkan oleh reaksi selanjutnya
yang melibatkan produk kuinon yang sangat reaktif yang dibentuk
dalam uji aktivitas. Parameter Michaelis-Menten adalah 1,25 ± 0,14
mM, 1,31 ± 0,18 mM, 0,84 ± 0,09 mM,
4,6 ± 0,7 mM, untuk substrat katekol, 3-metilkatekol, piroalol,
dan asam galat, ditentukan pada nilai pH optimum masing-
masing dengan menggunakan buffer MES atau natrium fosfat.
Profil Michaelis-Menten dicatat untuk substrat katekol, 3-
metilkatekol, dan pirogallol pada nilai pH yang berbeda dalam
buffer asetat, MES, dan natrium fosfat. Parameter kinetik enzim
dirangkum dalamMeja 2. Semua data yang direkam dengan ace-
tate buffer menunjukkan pergeseran ke nilai KM yang lebih besar.
Senyawa dengan gugus asam karboksilat, seperti asam sitrat dan
asam malat, telah terbukti menghambat PPO pada buah lain
(Yoruk & Marshall, 2003). Layar kami untuk penghambat PPO
(lihatTabel 3) juga menunjukkan bahwa asam sitrat dan, pada
tingkat yang lebih rendah, asam benzoat adalah agen potensial
untuk mencegah pencoklatan enzimatik dari Ataulfo. Efek
penghambatan ini mungkin hanya karena penurunan
7.588.59
pH
rangkap tiga. Grafik menggambarkan nilai rata-rata dengan bilah kesalahan dari satu standar deviasi di kedua arah.
Meja 2
Parameter kinetik enzim (KM dan vmax) diperoleh dengan menyesuaikan kurva ke suhu kamar sebelum melanjutkan dengan pengukuran
variasi substrat. aktivitas PPO. Lebih dari 30 menit pada 70 ° C diperlukan untuk
mengurangi aktivitas PPO hingga 50%. Aktivitas polifenol
Substrat Penyangga KM (mM) vmaks (IU /
mL) oksidase dalam ekstrak kasar yang dibuat dari kulit mangga
varietas Kensington juga menunjukkan kemampuan
Katekol Natrium asetat, pH 5,4 14.62 ± 0,28 ± 0,02b
Natrium asetat, pH 5,6 2.03Sebuah 0,29 ± 0,01
termostabilitas yang tinggi (Robinson et al., 1993). Oleh karena
MES, pH 5,6 10.59 ± 0.78 0,24 ± 0,01 itu, pemanasan bukanlah perawatan yang valid untuk
MES, pH 5,8 1,25 ± 0,14 0,22 ± 0,01 mencegah kecoklatan pada kultivar mangga Ataulfo dan
MES, pH 6.0 1,07 ± 0,11 0,19 ± 0,01 Kensington.
Natrium fosfat, pH 5,8 0,68 ± 0,16 0,20 ± 0,01
0,87 ± 0,15
Natrium fosfat, pH 6,0 0,63 ± 0,20 0,19 ± 0,01 3.2. Penghambatan aktivitas PPO pada ekstrak kasar buah mangga
Natrium fosfat, pH 6,2 0,41 ± 0,09 0,17 ± 0,01 Ataulfo
3-Methylcatechol Natrium asetat, pH 5,4 3,69 ± 0,51 0,24 ± 0,02
MES, pH 5,6 1,31 ± 0,18 0,26 ± 0,02
Pyrogallol Natrium asetat, pH 5,6 7,31 ± 0,77 0,53 ± 0,02
Beberapa senyawa yang terbukti menghambat PPO pada
MES, pH 5,4 1,26 ± 0,32 0,48 ± 0,03 buah lain (Yoruk & Marshall, 2003) diuji keefektifannya untuk
MES, pH 5,8 0,84 ± 0,09 0,46 ± 0,01 mencegah pencoklatan enzimatis pada ekstrak kasar mangga
MES, pH 6.0 0,79 ± 0,09 0,43 ± 0,01 Ataulfo. Menurut data yang ditampilkan diTabel 3, senyawa
Natrium fosfat, pH 5,8 0,83 ± 0,09 0,49 ± 0,01 beta-merkaptoethanol yang mengandung tiol dan ligan azida
Sebuah
Data disajikan sebagai nilai dari fit ± error of the fit.
pengikat tembaga sangat efektif, tetapi juga sangat toksik.
b
Konversi satuan untuk vmax menjadi IU / mL dilakukan seperti yang Sodium metabisulphite juga sangat efektif, tetapi senyawa ini
dijelaskan di bagian eksperimen. dilarang sebagai bahan tambahan makanan oleh FDA pada
tahun 1995 (Martinez & Whitaker, 1995). Campuran anti-
pencoklatan yang tersedia secara komersial sering mengandung
Tabel 3 asam askorbat dan sitrat (Loizzo, Tundis, & Menichini, 2012).
Pengaruh berbagai inhibitor pada aktivitas PPO dalam ekstrak kasar Ataulfo. Sodium askorbat merupakan inhibitor yang lebih efektif
dibandingkan dengan asam sitrat. Efek sinergis tidak diteliti
Penghambat 20 mM 2 mM 0,2 mM 0,02 mM
dalam penelitian ini. Glutathione (senyawa lain yang
b-Mercaptoethanol 0%Sebuah 0% 0% 0%
Natrium metabisulfit 0% 0% 0% 24%
mengandung tiol) dan asam kojic menunjukkan potensi sebagai
Natrium azida 0% 0% 1% 47% inhibitor yang berguna. Penghambatan aktivitas PPO juga
Natrium askorbat 0% 0% 6% 93% diamati untuk EDTA, natrium klorida, dan asam benzoat
Glutathione 0% 0% 6% 102% meskipun pada konsentrasi yang lebih tinggi dibandingkan
Asam kojic 0% 4% 40% 96% dengan senyawa lainnya.
Asam sitrat 0% 53% 88% 101%
EDTA 23% 27% 69% 100%
Natrium klorida 21% 46% 81% 102% 3.3. Ketergantungan aktivitas PPO pada kematangan di kulit versus
Asam benzoat 44% 101% 103% 97% pulpa Ataulfo
Sebuah
Aktivitas PPO relatif 100% sesuai dengan laju reaksi yang identik dengan
kondisi referensi tanpa inhibitor. Pengukuran dilakukan dalam rangkap dua atau Mangga dalam tahap kematangan R1-R6 dipisahkan menjadi
rangkap tiga dengan deviasi standar mulai dari 2% hingga 16%. sampel kulit dan daging buah. Semua sampel (lihatTabel 4)
menunjukkan aktivitas PPO yang lebih tinggi per gram kulit
daripada per gram pulp. Perbedaan ini berkisar dari 5 kali lipat
nilai pH (zat pengasam) atau efek pengkelat logam untuk hingga 25 kali lipat. Sampel R1 merupakan pengecualian dengan
inhibitor dengan beberapa gugus asam karboksilat. Masih hanya perbedaan 2 kali lipat antara aktivitas PPO pulpa dan kulit.
membingungkan, bagaimanapun, bahwa keberadaan buffer Sampel dari Ataulfo yang paling hijau dan mentah juga
asetat dengan hanya satu gugus karboksilat meningkatkan nilai menunjukkan kandungan protein terendah untuk pulp dan kulit,
KM yang tampak dibandingkan dengan buffer lain yang dan sampel R1-pulp menunjukkan aktivitas yang sangat tinggi
digunakan untuk menstabilkan nilai pH yang sama. yaitu 0,60 ± 0,05 IU / g. Semua sampel lainnya cenderung
Untuk menyelidiki stabilitas suhu PPO, ekstrak mentah menunjukkan peningkatan aktivitas dengan pematangan. Ataulfo
Ataulfo ditempatkan selama 10, 20, 30, 40, 50 dan 60 menit ke (R6) yang paling matang dengan jelas menunjukkan aktivitas PPO
dalam penangas air yang diatur pada suhu 30, 50, atau 70 ° C. tertinggi pada pulp dan kulit.
Ekstrak kasar didinginkan dalam penangas air es dan biarkan Sesuai dengan pengamatan kami, Robinson dkk. (1993)juga
pulih mengamati perbedaan yang signifikan dalam aktivitas PPO untuk
sampel kulit dan pulpa mangga matang dari varietas Kensington
dengan aktivitas kulit 25 kali lipat lebih tinggi dibandingkan
dengan sampel pulp. Tidak ada aktivitas PPO yang terdeteksi di
pulp Kensington mentah. Kulit Kensington yang masih mentah
menunjukkan aktivitas berkurang 2,5 kali lipat dibandingkan
dengan sampel kulit Kensington yang matang (Robinson et al.,
1993).

Tabel 4
Aktivitas PPO dan kandungan protein bergantung pada tahap kematangan sampel daging dan kulit Ataulfo.

Sampel Tahap kematangan Kandungan protein (mg / Aktivitas PPO (IU / Aktivitas PPO dengan 1% SDS (IU / Peningkatan SDS
g)Sebuah g)Sebuah g)Sebuah
Bubur R1 2.8 ± 0.7 0,60 ± 0,05 8,99 ± 0,82 15
R2 10,6 ± 0,4 0,22 ± 0,06 8,00 ± 2,34 36
R3 20,6 ± 4,5 0,19 ± 0,05 11.06 ± 1.03 58
R4 21,4 ± 1,8 0,56 ± 0,13 13.01 ± 2.66 23
R5 10.7 ± 1.3 0.85 ± 0.20 20.74 ± 5.98 24
R6 16,7 ± 2,6 2.70 ± 1.71 20,65 ± 4,27 8
 Kulit R1 3.1 ± 0.3 1,12 ± 0,16 5.25 ± 0.49 5
R2 9.2 ± 0.9 3,49 ± 0,96 12.62 ± 3.64 4
R3 9,4 ± 0,7 4,71 ± 0,53 10.69 ± 0.70 2
R4 13,2 ± 0,3 8,26 ± 1,91 12,63 ± 1,76 2
R5 11,5 ± 0,6 7,23 ± 0,97 20.45 ± 2.05 3
R6 7,7 ± 0,9 14.78 ± 1.24 67,90 ± 14,77 5
Sebuah
Kandungan protein dan aktivitas PPO dilaporkan per gram mangga (kulit atau daging buah). Semua pengukuran dilakukan dalam rangkap tiga. Data disajikan
sebagai mean ± standar deviasi.
Saat buah matang dan lunak, beberapa proses biokimia berubah
(Giovannoni, 2001). Tidak jarang buah menunjukkan aktivitas yang
lebih tinggi untuk enzim tertentu pada tahap yang lebih matang.
Misalnya, aktivitas enzim b-galaktosidase meningkat selama
pematangan mangga (Ali, Armugam, & Lazan, 1995). Kapasitas
antioksidan, kuantitas senyawa fenolik, dan respirasi juga terbukti
meningkat selama tiga tahap pertama pematangan Ataulfo diikuti
dengan sedikit penurunan pada tahap kematangan selanjutnya
(Palafox-Carlos, Yahia, Islas-Osuna, dkk., 2012).
Banyak peneliti mengamati bahwa aktivitas PPO dapat
ditingkatkan dengan menambahkan deterjen anionik SDS. Tingkat
aktivasi SDS sangat bervariasi dengan bahan tanaman dan kondisi
eksperimental. Dalam ulasan mereka,Yoruk dan Marshall (2003)
menyajikan berbagai peningkatan aktivitas PPO 4 kali lipat hingga
119 kali lipat setelah penambahan SDS. Dapat dibayangkan bahwa
PPO hadir dalam bentuk laten dengan domain regulasi yang
memblokir situs katalitik PPO yang menjadi lebih mudah diakses
setelah penambahan SDS, asidikasi, atau pengobatan proteolitik
(Yoruk & Marshall, 2003). Khususnya, data kami diTabel 4
menunjukkan aktivasi SDS yang jauh lebih tinggi untuk pulpa
dibandingkan dengan sampel kulit. Faktanya, dengan
penambahan 1% w / v SDS, sebagian besar sampel pulp
mendekati atau melebihi nilai aktivitas sampel kulit pada tahap
kematangan yang sama. Kami untuk sementara menyarankan
perbedaan latensi untuk PPO di pulpa versus kulit Ataulfo.
3.4. Berat molekul nyata dari pita dengan aktivitas PPO dalam
sebagian denaturasi SDS-PAGE
Gel SDS-PAGE diwarnai untuk aktivitas PPO dengan kategori
substrat disajikan di Gambar 2. Dengan pengecualian R1, semua
sampel pulp dan kulit menunjukkan pita dengan berat molekul
kira-kira 53 kDa. Sampel R1-pulp yang menunjukkan nilai aktivitas
PPO yang sangat tinggi untuk sampel pulp mangga hijau mentah,
menampilkan pita sekitar 144 kDa yang juga ditemukan di semua
sampel kulit. Kedua sampel pulp coklat (R5 dan R6) juga
menunjukkan pita yang terletak pada 112 kDa. Pita yang kurang
bernoda terletak pada 23 kDa (R2-pulp) dan 72 kDa (R5-pulp).
Berbagai bentuk PPO yang berbeda dalam mobilitas
elektroforetiknya telah diamati pada berbagai macam tanaman
dengan berat molekul mulai dari 32 kDa hingga lebih dari 200
kDa, dengan sebagian besar berat molekul antara 35 dan 70 kDa
(Yoruk & Marshall, 2003). Bisa jadi
Gambar. 2. Sebagian denaturasi gel Tris-glisin SDS-PAGE 4-20% yang diwarnai untuk aktivitas PPO. Sampel pulp Ataulfo (A) dan kulit (B) dengan kematangan yang meningkat (tahap R1-R6)
dimuat ke dalam jalur 2-7. Jalur 1 dan 8 mengandung standar protein yang diwarnai sebelumnya SeeBlue dari Life Technologies.
alasan multiplisitas ini adalah perlekatan produk oksidasi fenolik
atau karbohidrat, proteolisis, perubahan konformasi, oligomerisasi,
dan akhirnya adanya gen yang sangat berbeda. Informasi tentang
gen PPO dari mangga terbatas pada pengendapan satu urutan
pengkodean mRNA parsial dari Mang ifera indica, Linn (GenBank:
GU266283.1). Mangga termasuk dalam subclass Rosidae (Malvids).
Dalam subclass ini, tersedia empat urutan pengkodean mRNA
panjang penuh yang menghasilkan bobot molekul yang dihitung
sebesar 68,5 kDa untuk kultivar album Canarium Huiyuan
(GenBank: JQ319005.1), 67,2 kDa untuk Gossypium hirsutum (Gen-
Bank: JQ345705.1) , 69.5 kDa untuk G. hirsutum clone ZS1
(GenBank: JX966316.1), dan 66.2 kDa untuk Citrus clementina
(NCBI Reference Sequence: XM_006449228.1). Karena sampel
diterapkan pada gel SDS – PAGEGambar 2 hanya didenaturasi
sebagian, posisi pita hanya menunjukkan bobot molekul yang
tampak. Bisa dibayangkan bahwa pita yang terletak pada 53 atau
72 kDa mewakili isoform PPO utama baik dengan atau tanpa
potongan proteolitik. Robinson dan rekan kerja (Mazzafera &
Robinson, 2000; Robinson & Dry, 1992) menunjukkan bahwa PPO
dari kopi dan daun buncis dapat menjalani proteolisis tanpa
kehilangan kapasitas katalitik karena berat molekul yang terlihat
berkurang dari 67 menjadi 45 kDa atau 60-42 kDa, masing-masing.
Pita yang terletak pada berat molekul yang lebih tinggi dari 112
dan 144 kDa mungkin mewakili bentuk dimer, tetapi keberadaan
artefak karena perlekatan produk oksidasi polifenol tidak dapat
dikesampingkan. Pita dengan berat molekul yang lebih tinggi
hanya terlihat pada sampel dengan nilai aktivitas PPO di atas 0,60
± 0,05 IU per gram mangga. Semakin tinggi aktivitas intrinsiknya,
semakin besar kemungkinan melekatnya produk oksidasi
polifenol. Pekerjaan lebih lanjut pada PPO yang dimurnikan dari
Ataulfo dan penentuan urutan nukleotida lengkap akan
diperlukan untuk mengklarifikasi asal dari berbagai bentuk PPO.
4. Kesimpulan
Aktivitas PPO pada ekstrak kasar mangga Ataulfo diamati pada
substrat di- dan tri-fenolik dengan pH optima antara pH.
5,4 dan pH 6,4. Enzim itu cukup stabil terhadap suhu, tetapi dapat
dihambat secara efektif dengan natrium askorbat dalam
konsentrasi milimolar. Asam L-askorbat terdaftar sebagai senyawa
GRAS oleh FDA (FDA, 2014). GRAS adalah singkatan dari ''
Umumnya Diakui Sebagai Aman ''.
Aktivitas PPO dan distribusi isoform PPO tergantung pada tahap
kematangan dan bagian buah. Aktivitas PPO tertinggi ditemukan
dalam sampel kulit Ataulfo yang sangat matang. Sampel dengan
aktivitas PPO tinggi menampilkan setidaknya dua isoform PPO (53
dan 112 atau 144 kDa), sedangkan sampel dengan aktivitas PPO
rendah hanya menunjukkan satu pita utama pada 53 kDa di
sebagian gel SDS-PAGE yang diwarnai untuk aktivitas katekolase.
Deterjen anionik SDS merupakan penggerak PPO. Peningkatan
SDS terutama lebih kuat untuk pulp dibandingkan dengan sampel
kulit. Tahap kematangan dan bagiannya dari tanaman yang
digunakan untuk persiapan ekstrak karena itu harus selalu
dipertimbangkan dalam evaluasi atau perbandingan enzimatis
reaksi kecokelatan.
Ucapan Terima Kasih
Proyek penelitian ini didanai oleh Hibah Dukungan Fakultas
dari California State University, East Bay. Kami berterima kasih
kepada Dr. Danika LeDuc karena telah membaca naskah kami
dengan cermat.
Referensi
Ali, ZM, Armugam, S., & Lazan, H. (1995). b-Galactosidase dan signifikansinya buah
mangga yang matang. Fitokimia, 38, 1109–1114.
Arogba, SS, Ajiboye, OL, Ugboko, LA, Essienette, SY, & Afolabi, PO (1998). Sifat
polifenol oksidase pada biji mangga (Mangifera indica). Jurnal dari Ilmu Pangan
dan Pertanian, 77, 459–462.
Bradford, MM (1976). Metode yang cepat dan sensitif untuk menghitung jumlah
mikrogram protein menggunakan prinsip pengikatan protein-pewarna.
Biokimia Analitik, 72, 248–254.
Constabel, CP, Bergey, DR, & Ryan, CA (1995). Systemin mengaktifkan sintesis
polifenol oksidase daun tomat yang diinduksi luka melalui pertahanan oktadekanoid
jalur pensinyalan. Prosiding National Academy of Sciences, 92, 407–411. FDA (Badan
Pengawas Obat dan Makanan AS). (2014). Daftar menurut abjad SCOGSzat.URL
http://www.fda.gov/Food/IngredientsPackagingLabeling/
GRAS / SCOGS / ucm084104.htm. Diakses 03.04.14.
FOASTAT. (2014). Organisasi Pangan dan Pertanian Perserikatan Bangsa-Bangsa.
URLhttp://faostat.fao.org. Diakses 16.03.14.
Galán Saúco, V. (2010, April). Produksi dan pasar mangga di seluruh dunia: Situasi
saat ini dan prospek masa depan. Dalam IX Simposium Mangga Internasional
992 (hlm. 37-48).
Giovannoni, J. (2001). Biologi molekuler pematangan dan pematangan buah.
Tahunan Review of Plant Biology, 52, 725–749.
Hanemann, P., Bourns, N., & Fertziger, I. (2008). Mangga Ataulfo di Chiapas: Analisis
rantai nilai. Laporan mikro # 109. Badan Pembangunan Internasional Amerika
Serikat (USAID). URLhttp://pdf.usaid.gov/pdf_docs/PNADN332.pdf. Diakses
16.03.14.
Kim, Y., Brecht, JK, & Talcott, ST (2007). Fitokimia antioksidan dan buah
Perubahan kualitas pada mangga (Mangifera indica L.) setelah perendaman
air panas dan penyimpanan atmosfer terkontrol. Kimia Pangan, 105, 1327–
1334.
Ksatria, RJ, Jr, Campbell, RJ, & Maguire, I. (2009). Kultivar mangga penting dan
deskriptor mereka. Dalam RE Litz (Ed.), The mangga, botani, produksi dan
penggunaan (2nd ed., hlm. 42–66). Bodmin: CABI.
Loizzo, MR, Tundis, R., & Menichini, F. (2012). Tirosinase alami dan sintetis
inhibitor sebagai agen antibrowning: Pembaruan. Ulasan Komprehensif
dalam Makanan Ilmu Pengetahuan dan Keamanan Pangan, 11, 378–398.
Mannan, MA, Khan, SAKU, Islam, MR, Islam, MS, & Siddiqa, A. (2003). SEBUAH
mempelajari sifat fisika-kimia beberapa varietas mangga di Wilayah Khuhia.
Pakistan Journal of Biological Sciences, 6, 2034-2039.
Manthey, JA, & Perkins-Veazie, P. (2009). Pengaruh tanggal dan lokasi panen pada
kadar b-karoten, asam askorbat, total fenol, antioksidan in vitro kapasitas, dan
profil fenolik dari lima varietas mangga komersial (Mangifera indica L.). Jurnal
Kimia Pertanian dan Pangan, 57, 10825-10830.
Martinez, MV, & Whitaker, JR (1995). Biokimia dan pengendalian enzimatik
kecoklatan. Trends in Food Science & Technology, 6, 195–200.
Mayer, AM (2006). Oksidase polifenol pada tumbuhan dan jamur: Pergi kemana-
mana? SEBUAH ulasan. Fitokimia, 67, 2318–2331.
Mazzafera, P., & Robinson, SP (2000). Karakterisasi polifenol oksidase dalam kopi.
Fitokimia, 55, 285–296.
Medlicott, AP, & Thompson, AK (1985). Analisis gula dan asam organik dalam
pematangan buah mangga (Mangifera indica L. var Keitt) dengan cairan kinerja
tinggi kromatografi. Jurnal Ilmu Pangan dan Pertanian, 36, 561–566.
Munoz, JL, Garcia-Molina, F., Varon, R., Rodriguez-Lopez, JN, Garcia-Canovas, F., &
Tudela, J. (2006). Menghitung absorptivitas molar untuk kuinon: Aplikasi untuk
pengukuran aktivitas tirosinase. Biokimia Analitik, 351, 128–138.
Palafox-Carlos, H., Yahia, E., Islas-Osuna, MA, Gutierrez-Martinez, P., Robles-
Sánchez, M., & González-Aguilar, GA (2012a). Pengaruh tingkat kematangan
buah mangga buah (Mangifera indica L., cv. Ataulfo) pada parameter fisiologis
dan aktivitas antioksidan. Scientia Horticulturae, 135, 7–13.
Palafox-Carlos, H., Yahia, EM, & González-Aguilar, GA (2012b). Identifikasi dan
kuantifikasi senyawa fenolik utama dari mangga (Mangifera indica, cv. Ataulfo)
buah oleh HPLC – DAD – MS / MS-ESI dan kontribusi individu mereka untuk
aktivitas antioksidan selama pematangan. Kimia Pangan, 135, 105–111.
Rescigno, A., Sollai, F., Rinaldi, AC, Soddu, G., & Sanjust, E. (1997). Polifenol
pewarnaan aktivitas oksidase dalam gel elektroforesis poliakrilamida. Jurnal dari
Metode Biokimia dan Biofisik, 34, 155–159.
Ribeiro, SMR, Queiroz, JH, de Queiroz, MELR, Campos, FM, & Sant'Ana, H.
MP (2007). Antioksidan dalam daging buah mangga (Mangifera indica L.).
Tanaman Makanan untuk Nutrisi Manusia, 62, 13–17.
Robinson, SP, & Dry, IB (1992). Polifenol oksidase daun kacang lebar adalah 60-
protein kilodalton rentan terhadap pembelahan proteolitik. Fisiologi Tumbuhan,
99, 317–323.
Robinson, SP, Loveys, BR, & Chacko, EK (1993). Enzim oksidase polifenol dalam
getah dan kulit buah mangga. Biologi Tumbuhan Fungsional, 20, 99–107.
Toivonen, P., & Brummell, DA (2008). Basis biokimia dari penampilan dan tekstur
perubahan pada buah dan sayuran segar. Biologi dan Teknologi Pascapanen,
48, 1–14.
Tovar, B., Garc´sayaa, HS, & Mata, M. (2001). Fisiologi buah mangga yang sudah
dipotong. I. ACC dan
Aktivitas oksidase ACC dari irisan yang mengalami dehidrasi osmotik. Riset
Pangan Internasional, 34, 207–215.
USDA (Departemen Pertanian Amerika Serikat). (2014). Arsip data buku tahunan
buah dan kacang pohon Sistem Informasi Pasar dan Ekonomi (ESMIS).
URLhttp://usda01.library.cornell.edu/usda/ers/89022/Table-G8.xlsx. Diakses
16.03.14.
Wang, J., Jiang, W., Wang, B., Liu, S., Gong, Z., & Luo, Y. (2007). Properti parsial
polifenol oksidase pada daging buah mangga (Mangifera indica L. CV. '' Tainong
''). Jurnal dari Biokimia Pangan, 31, 45–55.
Yoruk, R., & Marshall, MR (2003). Sifat fisikokimia dan fungsi tumbuhan
polifenol oksidase: tinjauan. Jurnal Biokimia Pangan, 27, 361–422.