Diterjemahkan dari bahasa Inggris ke bahasa Indonesia - www.onlinedoctranslator.

com

Kemajuan Bioteknologi xxx (xxxx) xxx

Daftar isi tersedia diSainsLangsung

Kemajuan Bioteknologi

beranda jurnal:www.elsevier.com/locate/biotechadv

makalah ulasan penelitian

WawasanClostridium tetani: Dari genom ke bioreaktor

Lucile Garrigues, Thuy Duong Do, Carine Bideaux, Stéphane E. Guillouet,
Isabelle Meynial-Salles*
TBI, Université de Toulouse, CNRS, INRAE, INSA, Toulouse, Prancis

INFO ARTIKEL ABSTRAK

Kata kunci: Vaksinasi tetanus sangat penting bagi kesehatan masyarakat di sebagian besar negara di dunia. Organisasi Kesehatan Dunia
Clostridium tetanikultur menunjukkan bahwa 15.000 kasus tetanus dilaporkan pada tahun 2018 (Organisasi, Kesehatan Dunia, 2019). Saat ini,
produksi toksin Tetanus produsen vaksin menggunakan toksin tetanus yang diproduksi olehClostridium tetanifermentasi dalam media yang kompleks.
Peta metabolisme pusat
Komponen kompleks, umumnya berasal dari sumber hewani, memperkenalkan variabilitas potensial dalam budaya. Untuk
Persyaratan nutrisi Medium yang
mencapai fermentasi yang dapat direplikasi dan untuk menghindari reaksi toksik atau alergi dari senyawa sumber hewani,
ditentukan secara kimiawi
beberapa penelitian telah mencoba untuk beralih dari media kompleks ke media yang ditentukan secara kimia tanpa
mempengaruhi titer toksin. Tinjauan ini memperkenalkan pengetahuan terkini tentang i)C. tetanikeragaman regangan,
sekuens seluruh genom dan jaringan metabolisme; ii) regulasi dan sintesis toksin; dan iii) media kultur, proses budidaya dan
persyaratan tumbuh. Kami secara kritis meninjau data yang dilaporkan tentang metabolisme diC. tetanidan menyelesaikan
analisis genomik dan proteomik komparatif dengan lainnyaKlostridiajenis. Kami mengintegrasikan data genom berdasarkan
anotasi sekuens genom utuh, dilengkapi dengan spesifisitas kofaktor yang ditentukan oleh identitas sekuens protein, dalam
peta baruC. tetanimetabolisme sentral. Ini adalah tinjauan data pertama yang mengintegrasikan wawasan dari eksperimen
omics diC. tetani. Ikhtisar dariC. tetanifisiologi yang dijelaskan di sini dapat memberikan dukungan untuk desain media baru
yang didefinisikan secara kimia tanpa sumber kompleks untuk produksi toksin.

1. Perkenalan
Clostridium tetaniadalah patogen yang bertanggung jawab untuk tetanus. Penyakit
ini disebabkan oleh racun yang dihasilkan oleh bakteri dan tidak menular. Orang yang
menderita tetanus tidak mengembangkan imunisasi apa pun, karena tingkat toksin yang
diperlukan untuk menginduksi reaksi kekebalan bersifat mematikan. Tetanus masih
menjadi masalah kesehatan masyarakat, terutama di negara berkembang. Vaksin yang
efektif melawan tetanus dihasilkan dari vaksin yang tidak aktifC. tetani toksin.
C. tetaniadalah basil yang sangat anaerobik. Sporanya secara alami
hadir di tanah, terutama dalam bahan hangat dan lembab (tanah,
dejections). Ketika spora ini menembus luka, perkecambahannya
dimungkinkan dalam kondisi yang menguntungkan (jaringan rusak
yang tidak diirigasi). Waktu inkubasi berlangsung antara tiga dan dua
puluh satu hari (Organisasi Kesehatan Dunia, 2017). Bakteri tinggal di
luka nekrotik dan melepaskan neurotoksin tetanus. Neurotoksin ini
memasuki jaringan, mencapai sistem limfatik dan kemudian diangkut
oleh saraf atau darah ke sistem saraf pusat. Toksin memblokir
neurotransmiter penghambat, menyebabkan kekakuan dan kejang
otot terkait tetanus yang terkenal (Evans dan Brachmann, 1998).
Tingkat kematian terkait tetanus mencapai 100% tanpa pengobatan. Sebagian
besar kasus terkait dengan tetanus neonatorum, yang terjadi pada bayi baru lahir
atau ibunya ketika kondisi higienis tidak dijaga; sekitar 34.000 bayi baru lahir
meninggal karena tetanus pada tahun 2015, terutama di negara-negara
berpenghasilan rendah (Organisasi Kesehatan Dunia, 2017). Tetanus yang
berhubungan dengan luka biasanya terjadi pada orang tua yang tidak up-to-date
pada vaksinasi mereka. Oleh karena itu, karena patogenisitas yang tinggi ini,
vaksinasi preventif yang masif harus dilaksanakan untuk melindungi populasi.
Vaksin tetanus diproduksi dariC. tetanibudaya. Toksin tetanus asli yang
dihasilkan kemudian diinaktivasi dengan formaldehida untuk menghasilkan
toksoid. Karena inaktivasi ini, penambahan adjuvant diperlukan untuk
menginduksi respon imun tanpa mematikan.Smith dkk., 2011).
Untuk produksi vaksin, C. tetanistrain ditanam secara industri di media
kompleks yang berasal dari media Mueller dan Miller (Organisasi Kesehatan
Dunia, 1994). Media ini terutama terdiri dari kasein hidrolisat, glukosa, infus
jantung sapi dan vitamin. Karena pencernaan pankreas dari kasein dan infus
jantung sapi adalah bahan kompleks yang tidak terdefinisi, mereka
menyebabkan variabilitas batch-ke-batch yang penting. Mueller melaporkan
titer toksin terbelah dua saat menggunakan batch baru dari pencernaan
kasein. Setelah analisis sampel dari berbagai tahap produksi kasein digest,

* Penulis yang sesuai.

Alamat email:meynial@insa-toulouse.fr (I. Meynial-Salles).

https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2021.107781
Diterima 12 November 2020; Diterima dalam bentuk revisi 17 Maret 2021; Diterima 19 Mei 2021
Tersedia online 23 Mei 2021
0734-9750/© 2021 Diterbitkan oleh Elsevier Inc.

Silakan kutip artikel ini sebagai: Lucile Garrigues,Kemajuan Bioteknologi, https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2021.107781

L. Garrigues dkk.
variabilitas batch-ke-batch tetap tidak dapat dijelaskan (Mueller dan Miller, 1954).
Karena variabilitas ini dan untuk menghindari reaksi toksik atau alergi dari
pencernaan protein mamalia yang tidak lengkap dalam media yang kompleks,
Organisasi Kesehatan Dunia mendorong semua produsen vaksin untuk
membudidayakanC. tetanidalam media yang didefinisikan secara kimia (
Organisasi Kesehatan Dunia, 1994).
Pemahaman yang lebih baik tentangC. tetanimetabolisme dan fisiologi
diperlukan untuk menyederhanakan komponen media atau untuk mencapai
fermentasi dengan titer tinggi dalam media yang ditentukan secara kimia.
Pengetahuan ini dapat digunakan untuk mengembangkan media yang
ditentukan secara kimia yang cocok untuk produksi toksin tetanus. Ulasan
ini memberikan analisis genomik fungsional yang berfokus pada jalur
metabolisme yang relevan untuk produksi toksin pada skala industri.
Pengaturan sintesis toksin tidak dibahas secara mendalam, karena telah
ditinjau oleh Institut Mikrobiologi dan Genetika (Bruggemann dan
Gottschalk, 2004) dan Institut Pasteur (Connan dkk., 2013).
2.Clostridium tetanigenom dan metabolisme pusat
2.1. Keragaman regangan Clostridium tetani dan sekuens genom
Sampai saat ini, 43C. tetanistrain telah diisolasi, terutama dari luka
manusia, di lokasi geografis yang berbeda di seluruh dunia (Amerika Utara,
Cina, Prancis) (Chapeton-Montes dkk., 2019;Cohen dkk., 2017; Perpustakaan
Kedokteran Nasional AS Medecine 2021. Strain diklasifikasikan menjadi dua
kelompok utama: strain Harvard yang berasal dari leluhur strain Harvard
(Clade 1A) dan strain tipe liar yang diisolasi dari kasus klinis (Clades 1B–H
dan 2). Strain leluhur Harvard dikumpulkan oleh Laboratorium Higienis
Layanan Kesehatan Masyarakat AS pada akhir Perang Dunia Pertama. Strain
itu kemudian didistribusikan ke laboratorium dan produsen vaksin dari
tahun 1920-an hingga 1950-an. Hal ini menyebabkan pengembangan galur
keluarga Harvard, yang dicirikan oleh sporulasi rendah dan produksi toksin
tinggi dan cocok untuk produksi vaksin. Strain E88 dan CN655, diisolasi dari
keluarga Harvard, biasanya digunakan di laboratorium Eropa.
Genom 2,8 Mb dariC. tetanistrain referensi diurutkan pada tahun 2003
oleh Brüggemann (Bruggemann et al., 2003). genom dariC. tetani strain
Harvard E88 mengkodekan 2372 ORF (konten 28,6% G + C) dan plasmid unik
74-kbp (konten 24,5% G + C) dengan 61 ORF. Plasmid itu termasuk gen yang
mengkode toksin tetanus (tenda), pengatur transkripsinyatetR, dan gen
yang mengkode faktor virulensi (lapisan permukaan dan protein adhesi,
kolagenase). Pada plasmid, gen pengkode transporter ABC (CTP24-25)
ditemukan langsung di hilir sistem dua komponen (TCS) yang terdiri dari
regulator respons (CTP21) dan histidin kinase (CTP22).Bruggemann dkk.
(2004)menyarankan bahwa sistem dua komponen ini, terletak 25 kb
sebelum gen toksin tetanus, mungkin mengatur transkripsi gen transporter
ABC ini. Faktor virulensi juga ditemukan pada kromosom, seperti tetanolysin
O (CTC1888), hemolisin (CTC586, CTC1574) dan protein pengikat fibronektin
(CTC164, CTC471, CTC1606). Protein ini membantuC. tetanimenginfeksi
jaringan yang rusak.
Di antara 20 gen yang dijelaskan sebagai protein lapisan permukaan dalam
genom E88, protein lapisan permukaan yang dikodekan oleh kromosomslpAgen
(CTC462) dicirikan olehQazi dkk. (2007). Hasil penelitian menunjukkan variabilitas
berat molekul tergantung pada strain (160 kDa dalam CN655, 180 kDa pada isolat
klinis NC06336–07, 160 hingga 180 kDa pada tiga isolat klinis CTHCM 19, 22 dan
25) dibandingkan dengan 118 kDa protein yang diprediksi. Tidak ada glikosilasi
yang ditemukan untuk menjelaskan variabilitas ini (Qazi dkk., 2007). Pengamatan
seperti itu sudah dijelaskan olehTakumi dkk. (1991)dengan karakterisasi protein
dari galur AO174 dengan berat molekul 140 kDa.Takumi dkk. (1991)menemukan
bahwa SlpA memiliki kandungan prolin yang sangat rendah dan menunjukkan
berbagai bentuk isoelektrik dari pH 4,0 hingga 4,5. Protein lapisan permukaan ini
menyajikan antigen, memungkinkan deteksi imunologis (Takumi dkk., 1991).
Bruggemann dkk. (2004)mengidentifikasi heme oksigenase (CTC2478) di
C. tetaniyang dapat memberikan toleransi oksigen pada bakteri selama
infeksi luka dengan menciptakan lingkungan anaerobik lokal. Enzim ini juga
2
Kemajuan Bioteknologi xxx (xxxx) xxx
ditemukan di tempat lainKlostridiumpenjajah luka (Clostridium perfringens) tetapi
tidak dalam patogen atau nonpatogenik lainnyaKlostridia. Dengan demikian,C.
tetaniadalah mikroorganisme anaerobik tetapi dilaporkan sebagai spesies
aerotoleran, mirip denganC. perfringens(Bruggemann et al., 2004).Dedic dan Koc.
(1956) berhasil berkembangC. tetanidalam kondisi aerobik dengan penambahan
kobalt (sebagai Co(NO3)2). Dalam kondisi anaerobik, suplementasi kobalt tidak
mempengaruhi pertumbuhan. Para penulis menyarankan bahwa penambahan
kobalt mengurangi tekanan parsial oksigen dari media budidaya (Dedic dan Koch,
1956); namun, pengamatan ini juga dapat dikaitkan dengan keberadaan heme
oksigenase.
Sejumlah besar gen yang bergantung pada ion natrium (35) ditemukan
diC. tetanikromosom, dan gen ini mungkin terkait dengan kapasitas
kolonisasi luka organisme ini. Sebuah cluster gen (CTC1337–1352) homolog
dengan sistem Mrp ditemukan pada kromosom. Gugus gen ini, tidak ada di
lainnyaClostridia,memberikan resistensi terhadap ion natrium dan kalium
tingkat tinggi dan mengatur pH intraseluler. Gaya gerak natrium juga dapat
didorong oleh kompleks mirip-Rnf (RnfC, RnfD, RnfG, RnfE, RnfA dan RnfB
yang dikodekan oleh CTC1019-1024) yang mengangkut ion natrium keluar
dan meregenerasi NADH dan ferredoxin teroksidasi. Aliran natrium ini
kemudian berpotensi digunakan untuk menghemat energi melalui natrium
ATP sintase tipe-V (CTC2326–2332), menghasilkan ATP (Bruggemann dan
Gottschalk, 2004). E88 juga menyimpan gen yang mengkode protein CodY
(CTC1260), yang merupakan regulator global. Protein ini diketahui secara
tidak langsung menurunkan produksi toksin dalamClostridium difficile (
Dineen et al., 2007) tetapi secara positif mengatur sintesis toksin dalam
C. perfringens(Li dkk., 2013) danClostridium botulinum(Zhang dkk.,
2014).
Ada 28 gen transposase dalam genom E88, tetapi kebanyakan dari mereka
tampaknya tidak berfungsi karena ORF yang rusak. Hanya beberapa daerah yang
memiliki kandungan G + C yang tinggi (sekitar 50%): enam kluster gen rRNA dan
gen penyandi protein ribosom (Bruggemann et al., 2003).
Sampai saat ini, sekuens seluruh genom dari 43 galur yang diisolasi telah
dilaporkan (Perpustakaan Kedokteran Nasional AS (Kedokteran, 2020). Semua
urutan genom dibandingkan dengan genom model strain E88. Analisis
menunjukkan bahwa identitas genetik antar varian tinggi. Gen penyandi toksin
memiliki urutan yang sama dengan 99,3-99,4% identitas di antara semua galur
Harvard yang menyimpan plasmid tetanus (dua galur kehilangan plasmidnya dan
dengan demikian patogenisitasnya). Strain Harvard dan tipe liar ini juga memiliki
urutan gen regulator transkripsi toksin yang identik dengan identitas 100% (
Cohen dkk., 2017). Protein spesifik strain dikodekan di daerah profagnya.
Perbedaan lain di antara strain ini ditemukan di lokus CRISPR/Cas dan daerah
spacer. Mereka terutama mengkodekan satu set fungsi kebugaran yang
melindungi strain ini dari stres lingkungan atau infeksi profag baru (Bruggemann
dkk., 2015). Di antara 43C. tetaniurutan genom dilaporkan,Chapeton-Montes dkk.
(2019)menganalisis 38 urutan genom dan menunjukkan bahwa genom inti
mewakili 77% dari genom E88. 38 strain berbagi 1266 urutan pengkodean (CDS;
32% dari total CDS). Strain Harvard hanya berbeda dengan 292 polimorfisme
nukleotida tunggal (SNP) di seluruh genom mereka dan berbagi toksin tetanus
identik 100% pada tingkat protein. Mereka mengandung gen-gen spesifik-
regangan, yang mengkodekan “elemen mirip plasmid yang membawa sistem
toksin-antitoksin, kluster gen yang mengkode protein lapisan permukaan, sistem
transpor besi dan sistem modifikasi dinding sel/spora/amplop/membran” (
Chapeton-Montes dkk., 2019). Analisis filogenetik menunjukkan bahwaC. tetani
plasmid berevolusi bersama dengan kromosom dan bukan merupakan elemen
genomik baru-baru ini. Ini mencerminkan stabilitas genomikC. tetani(Chapeton-
Montes dkk., 2019;Cohen dkk., 2017). ItuC. tetanigenom dianggap stabil
dibandingkan dengan genom spesies lain, sepertiC. botulinum(Chapeton-Montes
dkk., 2019). Strain yang digunakan untukC. tetanieksperimen di laboratorium
termasuk dalam subkelompok genom yang sama (keluarga Harvard, clade 1A) dan
memiliki gen penyandi regulator transkripsi toksin dan toksin yang identik.
L. Garrigues dkk. Kemajuan Bioteknologi xxx (xxxx) xxx

2.2. Metabolisme sentral Clostridium tetani Tabel 1B

Produk akhir dari jalur degradasi mayor dan minor.
Substrat yang paling umum digunakan olehC. tetaniadalah asam amino, Asam amino Jalur degradasi utama Degradasi kecil
karena banyak gen untuk transpor dan degradasinya diidentifikasi dalam jalan setapak

genomnya (Tabel 1A). Transpor asam amino tampaknya terutama Aspartat Glutamat + Oksaloasetat Asetat + Amonium + Fumarat
bergantung pada natrium, terjadi melalui sporter (Bruggemann dan glutamat Butirat + Piruvat + Amonium 2-oksoglutarat +
Gottschalk, 2004).C. tetanimengangkut dan mengkatabolisme banyak asam Amonium
amino. Regulasi ekspresi gen ini, sampai sekarang, kurang dipahami. Baru- n-Formimino-L-Glutamat
histidin glutamat Histamin
baru ini,Orellana dkk. (2020)menggunakan pendekatan transkriptomik
metionin 2-Oxobutanoate + Propionyl-CoA S-Adenosyl-L-Metionin
komparatif waktu-kursus untuk lebih memahami bagaimana jalur degradasi Propionate + ATP + Amonium
asam amino diekspresikan ketika galur E88 ditumbuhkan dalam media serin Piruvat + Amonium L-Sistein
kompleks dengan atau tanpa suplementasi dengan lima asam amino. Hasil treonin Glisin + Asetaldehida Propionil-KoA
Propionat + ATP +
penelitian menunjukkan bahwa histidin dan aspartat terutama terdegradasi
Amonium
menjadi glutamat, yang terdegradasi menjadi asetat, butirat, piruvat dan Tirosin Piruvat + Fenol + Amonia -
amonium.melaluijalur metilaspartat. Serin terdegradasi terutama menjadi
piruvatmelaluijalur serin amonia-liase (CTC1981–1982), treonin menjadi
glisin dan asetaldehida, dan tirosin menjadi piruvat dan fenolmelaluijalur CTC378–382, CTC507, CTC2404, CTC2489–2490, CTC2515, CTC2637),
tirosin fenol liase (CTC818). Metionin ditemukan terutama diubah menjadi 2- transport PTS glukosa (CTC278, CTC1771), atau aktivitas sodium symporter
oksobutanoat dan propionil-KoA. Namun, jalur degradasi lain dari asam (CTC1237) tetapi tidak ada untuk degradasi polisakarida. Tidak seperti yang
amino ini ditemukan diinduksi pada tingkat transkripsi tetapi pada tingkat lainKlostridiumgenom, ituC. tetanigenom juga mengandung gen dari jalur
yang lebih rendah, dan induksi ini tergantung pada fase kultivasi.Tabel 1B). pentosa fosfat (CTC228, CTC307, CTC1227, CTC1332, CTC1864-1865 dan
banyak gen yang diduga mengkode hidrolase). Degradasi glukosa dan
SebagaiC. tetanimengasimilasi banyak asam amino, genomnya tidak banyak asam amino terutama menghasilkan pembentukan piruvat. Tidak
memiliki jalur biosintetik untuk setidaknya fenilalanin, histidin, isoleusin, ada gen yang mengkode enzim siklus sitrat yang ditemukan di
lisin, leusin, metionin, triptofan dan valin, menyebabkan auksotrofi asam C. tetanigenom.
amino. Ini khas untuk bakteri patogen dengan genom kecil: mereka tidak Piruvat diubah menjadi asetil-KoA melalui piruvat feredoksin oksidoreduktase.
mengembangkan jalur untuk biosintesis asam amino karena mereka hidup Enzim ini mereduksi ferredoxin, yang kemudian dioksidasi ulang oleh
di inang (Yu dkk., 2009). Selain gen transpor dan degradasi asam amino,C. hidrogenase, melepaskan hidrogen. Asetil-KoA kemudian dapat diubah menjadi
tetanimengandung banyak gen penyandi peptidase dan (fosfo) lipase asetat atau butirat melalui jalur biosintesis asetat dan butirat lengkap. ItuC. tetani
ekstraseluler dan intraseluler. Kumpulan peptidase ini, yang merupakan genom memiliki satu 3-hydroxybutyryl-CoA dehydrogenase (Hbd), dua crotonases
karakteristik patogenKlostridia, menyediakan asam amino bebas untuk (Crt) dan lima homolog butyryl-CoA dehydrogenases (Bcd). Katabolisme asetil-KoA
bakteri. Data analisis urutan genom menunjukkan bahwaC. tetani, mirip juga dapat menghasilkan produksi etanol dan butanol.Bruggemann dan
dengan Clostridium butiricum,dapat memfermentasi gliserol untuk Gottschalk, 2004). Itu ditunjukkan secara eksperimental diClostridium
menghasilkan 1,3-propanediol (Gonzalez-Pajuelo dkk., 2006) (gliserol kinase acetobutylicum(Yoo dkk., 2015) danClostridium kluyveri(Li dkk., 2008) bahwa
CTC1758, CTC2462; gliserol-3-fosfat dehidrogenase CTC596, CTC1139, butyryl-CoA dehydrogenase (Bcd) adalah enzim yang bergantung pada NADH dan
CTC1808, CTC2436; gliserol dehidratases CTC936, CTC1449), ethanolamine ferredoxin. Enzim Bcd dalamC. tetani(CTC2426) menunjukkan 82,6% dan 74,9%
(cluster gen CTC2163–2181) dan inositol (cluster gen CTC508–514) identitas dengan enzim Bcd dariC. acetobutylicumdanC. kluyveri,masing-masing,
Bruggemann dan Gottschalk, 2004). sangat menyarankan ketergantungan NADH dan ferredoxin diC. tetani. Enzim Hbd
C. tetanihanya memfermentasi glukosa sebagai sumber gula. Strain Harvard melakukannya terbukti bergantung pada NADH dalamC. acetobutylicumdan tergantung NADPH
tidak mengambil galaktosa, fruktosa, manosa, maltosa, sukrosa dan laktosa dalam diC. kluyveri(Yoo dkk., 2020). Hbd CTC2423 dariC. tetanimemiliki identitas urutan
kompleks (kasein, ekstrak ragi) medium (Martinez dan Rittenberg, 1959). yang lebih tinggi denganC. acetobutylicum (80,5%) dibandingkan denganC.
C. tetanimenampung gen yang mengkode enzim untuk glikolisis (CTC341, kluyveri(68,9%), menunjukkan bahwa itu adalah enzim yang bergantung pada
NADH. Baik AdhE1 dan AdhE2 aldehida-alkohol dehidrogenase dariC.

Tabel 1A acetobutylicumdikarakterisasi secara biokimiain vitrodan terbukti sangat

Anotasi dari transporter asam amino dan gen degradasi. bergantung pada NADH (Yoo dkk., 2015). Kedua enzim memiliki fungsi ganda,
berpartisipasi dalam konversi i) butiril-KoA menjadi butiraldehida dan ii) asetil-KoA
Asam amino Pengangkut asam amino Anotasi gen degradasi asam
anotasi gen amino
menjadi asetaldehida. Enzim serupa, CTC1366, berbagi identitas asam amino
68,2% dengan AdhE1 dan identitas asam amino 67,2% dengan AdhE2,
Alanin CTC564, CTC1172, CTC695
diidentifikasi padaC. tetani.Ketiga enzim menunjukkan domain GCGXWG yang
CTC1975
arginin Tidak beranotasi CTC1763 dilestarikan, yang umumnya terlibat dalam pengikatan koenzim (Fontaine dkk.,
Asam aspartat Tidak beranotasi CTC561–562, CTC824–825, CTC1294, 2002).Jadi, berdasarkan identitas asam amino, aldehida-alkohol dehidrogenaseC.
CTC1309, CTC1876, CTC2383–2384 tetanikemungkinan bergantung pada NADH. Akhirnya, butanol dehydrogenase,
Sistin / CTC559 CTC1050
CTC408, mengkatalisis konversi butiraldehida menjadi butanol, juga diidentifikasi
Sistein
Asam glutamat CTC822, CTC2306, CTC1295, CTC2563, CTC2565,
dalam
CTC2324 CTC2567–2568
Glutamin CTC559 CTC171 C. tetani. Enzim ini berbagi identitas asam amino 66,8% dengan BdhA dan
glisin CTC564, CTC1172, Tidak beranotasi
Identitas asam amino 63,8% dengan BdhB dariC. acetobutylicum, yang
CTC1975
didemonstrasikan secara biokimiain vitromenjadi tergantung NADPH (Yoo dkk.,
histidin Tidak beranotasi CTC2318, CTC2321
Leusin CTC787, CTC1868, CTC1738 2015). Dengan demikian, butanol dehidrogenase dalamC. tetanidapat dianggap
CTC2088 bergantung pada NADPH. Ekstrapolasi keC. tetaniberdasarkan% identitas asam
Lisin Tidak beranotasi CTC890 amino di atas menunjukkan bahwa produksi butanol dapat bergantung pada
metionin CTC1355 CTC2530
NADH dan NADPH diC. tetanidemikian juga.
prolin CTC1190 Tidak beranotasi
serin CTC1514, CTC2307 CTC 1981-1982
Jaringan metabolisme umum diC. tetanidiuraikan dalamGambar 1. Enzim
treonin CTC1514, CTC2307 CTC2624 yang terlibat dalam metabolisme ini dirinci dengan nomor untuk gen
triptofan CTC1190 CTC1509 penyandi. Milik merekain vivofungsionalitas belum ditunjukkan. Peta
Tirosin CTC819 CTC818 metabolisme ini tidak lengkap. Namun, beberapa ketidakpastian tetap ada.

3
L. Garrigues dkk.
Beberapa pengangkut asam amino belum teridentifikasi (pengangkut
histidin, aspartat, arginin dan lisin). Jalur degradasi glutamat/glutamin yang
berfungsi melalui metilaspartat pertama kali terbukti berfungsi dalamC.
tetaniNCTC 5404 menggunakan glutamat berlabel C (Buckel dan Barker,
1974). Pada tahun 2016, Licona-Cassani et al., menggunakan analisis
transkripsi mendalam, mengamati ekspresi tinggi dari gen cluster mutase
metil aspartat selama fase eksponensial, menunjukkan bahwa glutamat
mungkin juga dimetabolismemelaluijalur mesaconate dalam strain E88.
2.3. Bioenergi Clostridium tetani
Dua puluh satu protein besi-sulfur dengan pola inti [4Fe4S] dan dua puluh
enam flavoprotein homolog ditemukan diC. tetani, menunjukkan peran penting
dari protein transpor elektron ini dalam metabolisme. Di antara protein besi-sulfur
ini, ferredoxins mengambil bagian dalam transfer elektron dalam
C. tetani. Ferredoksin direduksi selama konversi piruvat menjadi asetil-KoA.
Reoksidasi ferredoxin tereduksi menghasilkan H+aliran, yang dapat diubah
menjadi dihidrogen oleh hidrogenase atau digunakan oleh ferredoxin NAD+
oksidoreduktase seperti kompleks Rnf. Selain itu, kluster FeS ditemukan,
khususnya, dalam sistem terikat membran (CTC1019-1024) yang homolog
dengan kompleks Rnf (Rhodobakterfiksasi nitrogen spesifik), dijelaskan pada
bakteri asetogenik sebagai kompleks enzim pernapasan yang mengkatalisis
oksidasi ferredoxin tereduksi dan reduksi NAD+, menghasilkan gradien ion
transmembran. DiAcetobacterium woodii, kompleks Rnf diusulkan untuk
digabungkan dengan translokasi ion natrium melintasi membran sitoplasma
(Schuchmann dan Muller, 2014). Jadi, sistem mirip-Rnf diC. tetanididuga
mempertahankan gaya gerak natrium dalam sel, yang penting untuk
transpor asam amino dan untuk transpor aliran elektron dari aktivitas
ferredoxin untuk meregenerasi kumpulan NADH. ATPase tipe (V) adalah
ATPase utama dalamC. tetani(CTC993-1001, CTC2326-2332). ATPase
CTC993-1001 juga berpartisipasi dalam pengangkutan Na+ion keluar dari
sel, memperkuat gaya gerak natrium dari sistem mirip Rnf. Transpor
natrium ini kemudian digabungkan dengan disipasi energi. Tidak ada F0-F1
-jenis ATPase ditemukan diC. tetani, yang tidak biasa. Meskipun demikian,
berbeda dengan yang lain Klostridia,C. tetanimenampung kluster gen
(CTC2326–2332) yang mengkodekan natrium ATP sintase tipe V yang
homolog dengan ATP sintase tipe archaeal (Bruggemann dan Gottschalk,
2004). Kompleks ini dapat menggunakan natrium yang diekstraksi dari
sistem Rnf untuk menghemat energi dengan sintesis ATP. Licona-Cassani
dkk. (2016)menunjukkan, dengan menghasilkan peta molekuler transkripsi
dari kultur E88 pada media kompleks, aktivasi gen yang mengkode protein
kompleks Rnf, ATP sintase spesifik flagel, ATPase pengangkut kalsium dan
gen yang terkait dengan ATPase sintase tipe-V.
Sebuah H+pompa (V-Type pyrophosphatase CTC383), ditambah dengan
pembelahan pirofosfat anorganik, juga ditemukan diC. tetani, yang jarang
terjadi pada bakteri. Selain itu, transporter natrium ABC spesifik (CTC1485)
dan beberapa H+/Na+antiporter (CTC567, CTC901, CTC1183, CTC1423,
CTC1853, CTC2161, CTC2520, CTC2529) diidentifikasi dalam genom.
Bruggemann dkk. (2004)menyarankan bahwa profil bioenergi ion natrium
yang dominan ini dapat dikaitkan dengan jalur fermentasi utama diC. tetani:
jalur pemanfaatan asam amino.
3. Regulasi dan sintesis toksin tetanus
3.1. Regulasi toksin tetanus
3.1.1. Regulasi toksin oleh faktor sigma alternatif
Gen yang mengkode toksin tetanus dan pengaturnya terletak pada
mega-plasmid dariC. tetani(Raffestin et al., 2005): i) itutetXgen (juga
ditulistenda) mengkode racun, dan ii)tetRgen, yang terletak tepat di
hulutetX, mengkodekan pengatur toksin tetanus. TetR adalah faktor
sigma alternatif (dari grup 5 dari70
keluarga) yang secara positif mengatur ekspresitetX. Ini mengikat
enzim, enzim inti RNA polimerase, untuk memulai transkripsi
4
Kemajuan Bioteknologi xxx (xxxx) xxx
daritetXgen. Enzim inti dan faktor sigmanya, dikombinasikan dengan
tetXpromotor, diperlukan untuk produksi toksin tetanus. Lokus toksin
tetanus dijelaskan dalamGambar 2.(Raffestin et al., 2005).
Organisasi genetik operon toksin tetanus mirip dengan operon
toksin botulinum. Memang, faktor botulinum sigma BotR/A
menunjukkan 60% identitas asam amino dengan TetR. Lebih-lebih lagi,
in vivo ekspresi berlebih dari BotR/A eksogen dalamC. tetanisintesis
TetX yang diatur secara positif, menggambarkan kesamaan fungsional
antara TetR dan BotR/A (Marvaud dkk., 1998).
3.1.2. Regulasi toksin oleh sistem dua komponen
Sintesis toksin tetanus diatur oleh jaringan kompleks TCS. Untuk sintesis
toksin, setidaknya dua TCS regulator positif dan satu TCS regulator negatif
diidentifikasi oleh:Chapeton-Montes dkk. (2020). Regulator positif pertama
TCS terletak 25 kb di huludari tetXpada plasmid, dekat dengan gen penyandi
protein pengikat ATP, tetapi tidak menunjukkan homologi dengan bakteri
lain. Regulator positif lainnya TCS terletak di kromosom dan diduga terkait
dengan autolisis. Kedua TCS ini diduga secara tidak langsung mengatur
sintesis toksin karena proteinnya tidak berikatan dengan promotor TetR
atau TetX. Sebaliknya, regulator negatif TCS secara langsung menekan
sintesis toksin dengan mengikat promotor TetR dan TetX. Atas dasar
homologi, TCS ini, yang terletak di kromosom, terlibat dalam pembelahan
sel. Beberapa TCS lain diduga bertindak secara tidak langsung pada
konsentrasi toksin dengan mengubah membran sel atau mengendalikan
sekresi toksin (Chapeton-Montes dkk., 2020).
3.1.3. Regulasi toksin terkait dengan faktor virulensi dan pembelahan sel
Chapeton-Montes dkk. (2020)menunjukkan bahwa sintesis toksin juga diatur
oleh CodY. Protein ini, sering terlibat dalam regulasi toksin dan virulensi pada
bakteri patogen Gram-positif lainnya, menunjukkan pengikatan padatetX
promotor. Ini meningkattetXtranskripsi, yang secara positif mengatur sintesis
toksin. Karena CodY diketahui merespons kondisi kelaparan, penulis menyarankan
bahwa regulasi toksin ini dapat dikaitkan dengan stres nutrisi (Chapeton-Montes
dkk., 2020). Analisis transkripsi komparatif dari E88 yang ditumbuhkan dalam
medium kompleks yang dilengkapi atau tidak dengan campuran asam amino
menunjukkan juga bahwa produksi toksin dan faktor virulensi terkait (Orellana
dkk., 2020). Secara khusus, penurunan ekspresi gen adhesi permukaan/sel yang
berhubungan dengan virulensi (CTC769–770, CTC772, CTC776–777) dan gen
flagela yang dianggap sebagai gen terkait virulensi pada patogen lain (CTC1653–
1679) mempengaruhi produksi toksin. Namun, gen yang mengkode TCS homolog
dari gen virulensi VirS/VirR diC. perfringensmenunjukkan tidak ada perbedaan
dalam ekspresi, terlepas dari tingkat produksi toksin tetanus.
C. tetanifenotipe tampaknya bergantung pada sintesis toksin, dengan
filamen rantai panjang muncul dalam kultur dengan produksi toksin
tertinggi (Orellana dkk., 2020). Namun, ekspresi gen pembelahan sel dan
pemanjangan dinding sel tidak terkait dengan sintesis toksin ketika galur
E88 ditumbuhkan dalam medium kompleks yang dilengkapi atau tidak
dengan campuran lima asam amino. Namun, transkripsi gen (CTC280,
CTC316, CTC595, CTC2066) yang mengkode protein autolisin, yang terlibat
dalam pemisahan sel dan bentuk sel, dihambat di bawah produksi toksin
yang tinggi, menjelaskan morfologi sel yang berbeda ini.
3.2. Produksi dan pematangan toksin
Toksin tetanus disintesis dalam sitosol bakteri sebagai protein rantai
151-kDa (1315 asam amino). Proses pematangannya diilustrasikan dalam
Gambar 3.
Setelah translasi RNA menjadi protein, residu metionin pertama
dihilangkan, dan dua jembatan sistein disulfida terbentuk. Toksin tetanus
dilepaskan dalam media kultur. Rantai peptida toksin kemudian dihidrolisis
oleh protease 27-kDa dalam kaldu kultur, menghasilkan toksin yang terdiri
dari rantai ringan 52-kDa dan rantai berat 98-kDa (Helting dkk., 1979). Satu
ikatan disulfida menghubungkan rantai berat dengan rantai ringan, dan
ikatan lainnya membentuk lingkaran pada rantai berat. Toksin rantai
tunggal dibelah antara Glu449 dan Asn450. Namun, racun juga ditemukan di
L. Garrigues dkk. Kemajuan Bioteknologi xxx (xxxx) xxx

Gambar 1.Clostridium tetanimetabolisme sentral.

Senyawa kotak kuning adalah produk fermentasi yang dilepaskan dalam medium.

5
L. Garrigues dkk.
Gambar 2.Organisasi genetik lokus toksin tetanus diClostridium tetanidari
Raffestin et al. (Raffestin et al., 2005).
Promotor gen toksin tetanus (PtetX), ditranskripsi oleh TetR, diperluas dengan
urutan 35/− 10 (kotak abu-abu). Bilah padat mewakili promotor diduga yang tidak
ditranskripsi oleh TetR, terletak di hulu gen tetR (ptetR) (Raffestin et al., 2005).
kaldu kultur yang dibelah dari Glu449 menjadi Ser457, tidak memiliki residu
sambungan. Protein nicking ini sangat meningkatkan toksisitasnya (
Krieglestein et al., 1991).
Helting dkk. (1979)mengidentifikasi tiga protease aktif dalam kaldu
kultur. Yang membelah toksin rantai tunggal memiliki berat molekul 27
kDa (Helting dkk., 1979). Itu adalah komponen aktif utamain vitro: 3 ng
enzim ini dapat memecah 50 g toksin intraseluler. Aktivitas protease
kedua tidak teridentifikasi. Enzim terakhir adalah enzim yang
menghidrolisis glisil-histidin tanpa mengubah konformasi toksin.
Protease yang membelah toksin rantai tunggal telah optimal in vitro
aktivitas enzimatik pada kisaran pH 6-7. Kedua enzim lainnya bekerja
lebih baik dari pH 7 hingga pH 9.
Pada tahun 1977, Helting dan Zwisler mendefinisikan toksin tetanus sebagai
protein dua fragmen: fragmen B (95-kDa, baik pada rantai ringan maupun berat)
dan fragmen C (47-kDa, pada rantai berat). Fragmen C merupakan bagian toksin
yang memicu reaksi antigenik paling kuat, walaupun tidak toksik (Helting dan
Zwisler, 1977).
Gambar 3.Proses pematanganClostridium tetanitoksin.
6
Kemajuan Bioteknologi xxx (xxxx) xxx
Schiavo dkk. (1992)mengidentifikasi satu atom seng yang terkait dengan rantai
ringan yang memainkan peran katalitik. Atom ini terkait dengan motif dua histidin,
karakteristik metalloendopeptidases. Tanpa seng, toksin tetanus tidak dapat
menghambat neurotransmiter dan oleh karena itu tidak dapat menyebabkan penyakit.
Schiavo dkk., 1992).
Toksin tetanus sangat stabil di antara strain yang berbeda karena
urutan asam amino yang diawetkan. Hanya sedikit perubahan dalam
komposisi asam amino yang diidentifikasi pada strain isolat klinis. Pola
histidinnya (HExxH) dan residu pengikatannya selalu kekal (Chapeton-
Montes dkk., 2019).
3.3. Struktur tridimensi racun
Struktur kristal toksin tetanus panjang penuh diperoleh untuk pertama
kalinya denganMasuyer dkk. (2017)menggunakan kristalografi sinar-X
(struktur kristal subunit sebelumnya dijelaskan secara terpisah). Struktur
tridimensi toksin tetanus disajikan dalamGambar 4. Seperti yang dijelaskan
sebelumnya, rantai ringan (pada fragmen B) adalah domain katalitik.
Domain translokasi (yang juga merupakan bagian dari fragmen B) berperan
dalam mengangkut toksin menuju neurotransmiter. Domain pengikatan
(yang merupakan bagian dari fragmen C) berikatan dengan neuron. Oleh
karena itu, antibodi yang ditujukan terhadap fragmen C adalah yang paling
kuat: mereka memblokir pengikatan toksin ke neuron (Masuyer dkk., 2017).
Dengan analisis hamburan solusi,Masuyer dkk. (2017)menunjukkan bahwa
struktur toksin tetanus bergantung pada pH. Pada pH asam (di bawah 5,5), toksin
dalam bentuk kompak (Gambar 4). Strukturnya mengadopsi konformasi
diperpanjang pada nilai pH lebih besar dari 6,3. Di antara dua nilai ini, toksin
berada dalam konformasi semi terbuka (Masuyer dkk., 2017).
4. Metode analisis untuk deteksi toksin
4.1. Metode flokulasi
Secara historis, jumlah toksin tetanus telah dievaluasi secara visual
menggunakan metode flokulasi Ramon.Ramon, 1923). Metode ini pertama kali
dirancang untuk titrasi toksin difteri dan kemudian diadopsi untuk toksin tetanus.
Titrasi ini terdiri dari reaksi antigen-antibodi. Antigen terletak pada toksin, dan
antibodi adalah serum antitetanus. Metode ini membutuhkan berbagai tabung
reaksi standar yang disiapkan dengan serum yang konsentrasi antibodi
antitetanusnya sudah diketahui dengan baik. Kemudian, setelah penambahan
sampel, gumpalan putih muncul di tabung dengan keseimbangan terbaik antara
toksin dan serum. Ini adalah tabung reaksi pertama di mana flokulasi terjadi yang
menunjukkan titer toksin sampel. Untuk flokulasi yang lebih cepat, tabung harus
diinkubasi dalam penangas air hingga suhu 45◦C. Titer yang ditentukan dengan
metode Ramon dinyatakan dalam Lf/mL supernatan (di mana Lf adalah batas
flokulasi). Karena selama beberapa dekade ini adalah satu-satunya metode titrasi
untuk toksin tetanus, ini adalah satu-satunya metode yang saat ini disetujui oleh
otoritas kesehatan.
L. Garrigues dkk.
Gambar 4.Struktur keseluruhan toksin tetanus dari Masuyer et al. (Masuyer dkk., 2017). (Untuk interpretasi referensi warna dalam legenda gambar ini, pembaca merujuk
ke versi web artikel ini.)
Hijau: rantai ringan (LC). Biru: domain translokasi (Licona-Cassani et al.). Abu-abu: domain pengikat (HC). Merah muda: sabuk yang mengelilingi rantai ringan. Asterisk: jembatan
disulfida. Oranye: GD1a ganglioside (reseptor toksin tetanus di atas neuron).
4.2. Dosis mematikan minimal
Beberapa peneliti menggunakan nilai dosis mematikan minimal (MLD/mL
supernatan) untuk mengevaluasi kandungan dan aktivitas toksin. Tes ini, sering
dilakukan pada tikus, terdiri dari menyuntikkan supernatan encer ke hewan.
Kemudian, mengetahui pengenceran terbesar yang terkait dengan kematian
hewan, dimungkinkan untuk menghitung unit MLD yang terkandung dalam satu
sampel. Sebagai referensi, MLD untuk manusia adalah 2,5 ng/kg (Gil, 1982).
Metode MLD menghasilkan hasil yang lebih akurat. Namun, karena memerlukan
sumber daya hewani dan padat karya, metode ini jarang digunakan.
4.3. Enzyme-linked Immunosorbent Assay
Tes rutin untuk deteksi antibodi tetanus telah dijelaskan oleh
Organisasi Kesehatan Dunia (Organisasi Kesehatan Dunia, 2013). Tes
ini, berdasarkan capture enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA),
menentukan kandungan toksoid tetanus dalam vaksin. Prosedurnya
terdiri dari melapisi antibodi monoklonal pada lempeng mikro. Antibodi
ini menghubungkan rantai berat toksoid. Kemudian, sumur diisi
dengan standar dan sampel. Kemudian, antibodi poliklonal dijatuhkan
di sumur. Antibodi ini dikenali oleh antibodi sekunder berlabel, yang
divisualisasikan oleh substrat kolorimetri. Kepadatan optik sampel
berkorelasi dalam skala log dengan jumlah toksoid dalam sampel.
Batas deteksi metode ini adalah 0,002 Lf/mL.
Karena toksin dan toksoid memiliki situs pengenalan antibodi yang
sama, tes ini dapat dilakukan untuk kuantifikasi toksin. Antibodi monoklonal
dan poliklonal dapat diganti menggunakan antibodi sekunder yang sesuai.
Metode ini lebih akurat untuk penentuan toksin daripada uji flokulasi atau
pengukuran MLD. Namun, tidak rutin digunakan karena tidak disetujui oleh
Organisasi Kesehatan Dunia.
7
Kemajuan Bioteknologi xxx (xxxx) xxx
5.Clostridium tetaniproses fermentasi
5.1. Media kultur untuk Clostridium tetani
SEBUAHC. tetanimedia pertumbuhan pertama kali dirancang pada tahun
1942 di laboratorium Mueller dan Miller menggunakan strain Harvard.
Hingga tahun 1960-an, pekerjaan mereka berfokus pada peningkatan titer
toksin akhir dariC. tetanibudaya dalam media ini. Media Mueller dan Miller
akhir terutama terdiri dari kasein hidrolisat (biasanya NZ-Case), glukosa dan
vitamin.Meja 2 merinci perbedaan komposisi antara media Mueller dan
Miller akhir dan media modifikasi yang dibuat oleh Latham et al. pada tahun
1962 (Latham dkk., 1962). Media Latham juga disebut media Massachusetts.
Lebih dari tiga puluh tahun kemudian, Demain et al. mengembangkan media
tanaman yang bebas dari senyawa sumber hewani tanpa hidrolisat susu. Bahan
bakunya digantikan oleh Quest Hy-Soy®pepton (Meja 2) (Demain dkk., 2005).
Namun, karena kinerja produksi toksinnya yang tinggi (70 hingga 120 Lf/mL) dan
karena tidak mengandung infus jantung sapi, media Massachusetts tetap menjadi
media yang paling umum digunakan untuk
C. tetanikultur di laboratorium dan untuk produksi toksin industri (
Tabel 3).
5.2. Fase pertumbuhan Clostridium tetani dalam mode batch
C. tetaniterutama dibudidayakan di bawah mode batch dalam tabung tertutup atau
botol. Hanya biomassa akhir dan titer toksin akhir yang dilaporkan, tanpa
informasi tentang pertumbuhan atau kinetika toksin. Beberapa kultur
bioreaktor juga dijelaskan (Tabel 3).Jagicza dkk. (1981)melaporkan budaya
industri galur Harvard dalam media Mueller dan Miller. Biomassa tumbuh
selama tiga hari dari 105ke 108sel/mL, dengan penurunan pH dari 7,3
menjadi 6,6. Toksin diproduksi secara intraseluler setelah satu hari kultur
sampai akhir pertumbuhan. Toksin kemudian dilepaskan dalam medium
pada titer toksin akhir 55 Lf/mL. Profil pertumbuhan serupa juga diamati
dalam labu tertutup denganFratelli dkk. (2005)dengan konsentrasi biomassa
maksimal 4,4 g/L dan titer toksin akhir 40 Lf/mL menggunakan
L. Garrigues dkk. Kemajuan Bioteknologi xxx (xxxx) xxx

Meja 2
Perbandingan komposisi media Mueller dan Miller, Massachusetts, kedelai dan TGY.

Konstituen per liter Media Mueller dan Miller akhir (Mueller Media Massachussets (Latham media kedelai (Demain media TGY (Chapeton-Montes
dan Miller, 1954) dkk., 1962) dkk., 2005) dkk., 2020)

Intisari kasein 22,5 g 25 gram - 30 gram

Infus hati sapi 50 mL - - -

Ekstrak ragi - - - 20 gram

Pepton kedelai - - 34 g -
Glukosa 11 g 8,0 g 7,5 g 5 gram

NaCl 2,5 g 2,5 g 5.0 g -

tidak2HPO4 2g - 0,5 g -
KH2PO4 0,15 g - 0,175 g -
MgSO4 0,15 g 0,1 g 0,024 g -
Sistin 0,25 g 0,125 g - -
Sistein - - 0,125 g -
Sistein HCl 0,5
Tirosin 0,5 g - 0,125 g -
Kalsium pantotenat 1,0 mg 1,0 mg - -
Urasil 2,5 mg 1,25 mg - -
Asam nikotinat - 0,25 mg - -
Tiamin 0,25 mg 0,25 mg - -
Riboflavin 0,25 mg 0,25 mg - -
Piridoksin 0,25 mg 0,25 mg - -
Biotin 2,5 g 2,5 g - -
Vitamin B12 - 0,05 g - -
Mengurangi zat besi (bubuk) 0,5 g - 0,5 g -
FeCl3. 6 H2HAI - 32 mg - -
Penyesuaian pH (sebelum 7.0–7.2 7.0±0.2 6.8 7.5
autoklaf)

Tabel 3
Perbandingan kinerja dalam mode budaya yang berbeda.

Sumber Regangan Modus kultivasi Media budidaya pengupasan gas Pertumbuhan Toksin
dan volume

Zakaria dan Saring 107 Bioreaktor 1 L Massachusetts yang dimodifikasi N2penyerangan dgn gas beracun 0,125 jam− 1tingkat 120 Lf/mL±
Bjorklund (1968) (turunan regangan Harvard) Modus terus menerus sedang pengenceran 10 Lf/mL
Jagicza dkk. regangan Harvard Bioreaktor 400 L Mueller dan Miller N2pembilasan permukaan selama 16 jam, Xmaksimal= 108sel/mL 55 Lf/mL
(1981) Modus batch sedang lalu aliran udara

Gutierrez dkk. Strain Massachusetts Bioreaktor 5 L Massachusetts yang dimodifikasi N2menggelegak selama pameran. Tumbuh, =0,46 jam− 1 73 Lf/mL
(2005) (Turunan regangan Harvard) Modus batch sedang lalu muncul ke permukaan Xmaksimal= 0,78 g/L
aerasi
Demain dkk. Vaksin Wyeth-Lederle dan Bioreaktor 0,8 L Media kedelai yang dimodifikasi N2bual Tidak dilaporkan 48 Lf/ml
(2007) strain Pediatri Modus batch
Fratelli dkk. Harvard-Caracas Botol 4 L Massachusetts yang dimodifikasi Tidak ada Xmaksimal= 4,34 g/L 70 Lf/mL
(2010) (Turunan regangan Harvard) Mode Fed-batch sedang
Muniandi dkk. Turunan regangan Harvard Bioreaktor 400 L Media Mueller yang dimodifikasi Aliran permukaan udara ODmaksimal= 2.3 70 Lf/mL
(2013) Modus batch
Licona-Cassani E88 Bioreaktor 1 L dan Massachusetts yang dimodifikasi N2pembilasan permukaan selama 4 jam, Ekspo: = 0,24 jam− 1 30,2 Lf/mL
dkk. (2016) 5L sedang lalu aliran udara Lambat: = 0,08 jam− 1 ±2,9 Lf/mL
Modus batch
Chung dkk. (2016) turunan regangan Harvard Bioreaktor 50 L Massachusetts yang dimodifikasi tepat waktu2aliran permukaan, Xmaksimal= 3 g/L 80 Lf/ml
Modus batch sedang lalu aliran udara
Chawal dkk. turunan regangan Harvard Bioreaktor 1 L Massachusetts yang dimodifikasi Tidak dilaporkan Tidak dilaporkan 97,9±3.3
(2016) Modus batch sedang dengan kedelai Lf/mL

Singkatan: Lf/mL, batas flokulasi per mililiter (unit toksin tetanus); , laju pertumbuhan spesifik; Xmaksimal, konsentrasi biomassa maksimum; ODmaksimal, kepadatan optik maksimum.

strain Harvard-Caracas yang ditanam di media Massachusetts (Fratelli et al., 2005). 8.0). Autolisis ini tampaknya terkait dengan keadaan sel fisiologis. Lima
Pada tahun 2016, Licona-Cassani dkk. melaporkan budidaya batch galur E88 pada budidaya ini menghasilkan produksi 30,2±2.86 Lf/mL toksin (Licona-
media Massachusetts yang dilengkapi dengan sistin, urasil, vitamin, dan sejumlah Cassani dkk., 2016), yang lebih rendah dari nilai untuk semua kultur
kecil FeCl3(Tabel 3). Selama budidaya (dalam lima percobaan independen), batch lain yang dilaporkan dalam literatur (Tabel 3).
pengambilan sampel reguler diterapkan untuk secara ketat mengikuti
pertumbuhanC. tetanidalam bioreaktor. Dua fase pertumbuhan yang berbeda
diamati: i) pertumbuhan eksponensial (μ = 0,24 jam− 1) fase yang menyebabkan
5.3. Kultur berkelanjutan Clostridium tetani
penurunan pH (dari 6,8 menjadi 6,6), berlangsung 10 jam dan menunjukkan
konsumsi asam amino bebas yang istimewa dan ii) pertumbuhan yang lebih
Budaya berkelanjutan dari aC. tetaniStrain turunan Harvard (regangan
107) dilaporkan dalam literatur. Pada tahun 1968, Zacharias dan Björklund
lambat (μ = 0,083 jam− 1) fase dengan peningkatan pH (dari 6,6 menjadi 7,0),
mempelajari efek dari i) tingkat pengenceran yang berbeda (0,030 jam− 1hingga
berlangsung selama 30 jam, dan terkait dengan konsumsi peptida dan glukosa.
0,169 jam− 1), ii) suhu (32◦C sampai 39◦C), iii) nilai pH (5,9 hingga 9,5) dan iv) garam
Gen faktor virulensi utama diaktifkan, termasuktetX. Pertumbuhan kemudian
(0,1 g/L KCl, 0,15 g/L CaCl2) dalam media Massachusetts yang dimodifikasi (semua
diikuti oleh fase autolisis sel, yang berlangsung selama 30 jam, dengan penurunan
konsentrasi dikurangi setengahnya). Untuk setiap budaya, salah satu parameter
densitas optik dan peningkatan pH (dari 7,0 menjadi
ini bervariasi. Titer toksin terbaik (120 Lf/mL toksin) dicapai pada a

8
L. Garrigues dkk.
tingkat pengenceran 0,125 jam− 1, suhu 34◦C dan pH 7,4 dalam media
Massachusetts yang dimodifikasi ditambah dengan 0,1 g/L kalium klorida.
Tingkat pertumbuhan dari 0,03 jam− 1hingga 0,125 jam− 1menghasilkan
biomassa dan produksi toksin yang serupa, dengan konsentrasi biomassa
0,7 g/L dan titer toksin 70–75 Lf/mL. Kalium digunakan untuk meningkatkan
permeabilitas membran dan dengan demikian pelepasan toksin dalam
media budidaya ekstraseluler. Elemen yang mengendalikan pertumbuhan
pada kondisi tunak tidak dijelaskan (Zacharias dan Bjorklund, 1968).
5.4. Kultur Fed-batch Clostridium tetani
Pada tahun 2010, Fratelli dkk. berbudayaC. tetaniStrain Harvard-Caracas
dalam kondisi fed-batch. Para penulis mengevaluasi dampak dari
konsentrasi awal kasein dan glukosa yang berbeda dalam botol statis
dengan penambahan glukosa berdenyut. Kondisi kultur terbaik diperoleh
dengan konsentrasi pepton kasein awal antara 50 dan 62,5 g/L dan
konsentrasi glukosa awal dari 0,75 hingga 1,25 g/L. Konsentrasi glukosa
kemudian disesuaikan menjadi 3 g/L dengan penambahan glukosa
berdenyut pada 16, 56 dan 88 jam kultur. Kultur fed-batch ini menghasilkan
60 Lf/mL toksin tetanus (dibandingkan dengan 15 Lf/mL dalam kultur batch
referensi) (Fratelli dkk., 2010).
Berdasarkan budaya yang dilakukan sebelumnya (Tabel 3), proses yang
menghasilkan konsentrasi toksin tertinggi tampaknya merupakan mode
budidaya terus menerus, dengan konsentrasi mencapai 120 Lf/mL dalam
media Massachusetts yang dimodifikasi. Keuntungan dari proses kultur
berkelanjutan adalah bahwa sel-sel dipertahankan dalam fase pertumbuhan
eksponensial.
5.5. pH optimal untuk budidaya Clostridium tetani
Dalam kultur berkelanjutan, pH optimal untuk produksi toksin adalah 7,8,
dengan kemampuan menghasilkan toksin dari nilai pH 6,2 hingga 8,8 (Zacharias
dan Bjorklund, 1968). Namun, direkomendasikan bahwa budidaya dilakukan pada
pH 7,4 karena pH yang lebih tinggi menyebabkan pengendapan besi,
menghasilkan warna hitam yang mengganggu penentuan biomassa. Untuk lebih
memahami pengaruh pH, stabilitas toksin dievaluasi pada nilai pH yang lebih
rendah dan lebih tinggi, tetapi tidak ada degradasi toksin yang ditemukan pada
nilai pH ekstrem ini. Oleh karena itu, penulis menyarankan bahwa nilai pH
mempengaruhi beberapa enzim yang terlibat dalam produksi toksin atau
kapasitas pelepasan membran.
Dalam kultur batch, pH biasanya tidak diatur. PH awal umumnya
dalam kisaran 6,8-7,2.Demain dan Fang (2003)menunjukkan bahwa pH
awal memiliki pengaruh pada fase autolisis. Persentase lisis sel
menurun dengan meningkatnya nilai pH awal. Penulis memperoleh
titer toksin terbaik (67,5 Lf/mL) pada pH awal 6,1, sesuai dengan pH
akhir 7,75 (Demain dan Fang, 2003).
6. Kebutuhan nutrisiClostridium tetaniuntuk pertumbuhan bakteri
dan produksi toksin
6.1. Konsumsi peptida histidin dari sumber asam amino kompleks
Untuk menentukan peran konsumsi asam amino yang dilepaskan pada
hidrolisis peptida,Mueller dan Miller (1953)mempelajari efek pencernaan pankreas
dari kasein yang digunakan untukC. tetanibudaya regangan Harvard. Pencernaan
kasein pankreas difraksinasi menjadi tiga bagian (asam, netral dan basa). Mereka
menemukan bahwa penghilangan salah satu bagian ini menghilangkan produksi
toksin. Produksi toksin juga terhambat ketika salah satu fraksi dihidrolisis oleh
asam. Mereka juga mengetahui bahwa histidin bebas tidak memenuhi
persyaratan histidin. Histidin harus ada dalam bentuk peptida, seperti glisil-
histidin atau asetil-histidin, untuk memulai produksi toksin. Dengan demikian, tim
Mueller menyarankan bahwa persyaratan untuk bentuk terikat peptida ini juga
dapat ada untuk serin, asam glutamat, dan asam aspartat (Mueller dan Miller,
1953).
Mueller dan Miller (1956)menjalankan eksperimen lebih lanjut untuk
mempelajari efek peptida histidin pada produksi toksin dengan mengganti
9
Kemajuan Bioteknologi xxx (xxxx) xxx
histidin bagian dari fraksi dasar pencernaan kasein pankreas dengan
peptida sintetis. Delapan peptida histidin yang berbeda dievaluasi: i)
glisil-histidin ditemukan sebagai peptida histidin yang paling efektif,
karena penggunaannya menghasilkan toksin sebanyak penggunaan
kasein di pankreas (130 Lf/mL dan 135-140 Lf/ mL, masing-masing),
diikuti oleh L-α-amino-n-butiril-L-histidin; ii) -Laspartyl-L-histidine,
acetyl-histidine dan L-carnosine hanya efisien pada konsentrasi yang
sangat tinggi; dan iii) anserin, 1-metil-histidin, dan 3-metil-histidin tidak
menghasilkan produksi toksin. Mereka menyimpulkan bahwa
spesifisitas struktural dari hubungan histidin adalah elemen stimulasi.
Selain itu, histidin bebas masih harus menjadi bagian dari media, tetapi
hanya berkontribusi pada pertumbuhan bakteri (Mueller dan Miller,
1956).
Aktivitas histidin peptidase yang tinggi diukur dari awal pertumbuhan,
sedangkan produksi toksin intraseluler baru dimulai setelah 10 jam
budidaya.Miller et al., 1960). Enzim hanya disintesis dalam media yang
mengandung peptida histidin, yang mengarah pada peningkatan produksi
toksin. Selain itu, Fe2+merangsang aktivitas peptidase. Histidin peptidase
mampu menghidrolisis glisil-L-histidin dan L-α-amino-nbutiril-L-histidin.
Hidrolisis asetil-histidin lebih lemah dan membutuhkan konsentrasi peptida
yang tinggi, sesuai dengan pengamatan yang telah dilakukan oleh Mueller
dan Miller (Mueller dan Miller, 1956). Aktivitas peptidase sama pada uji
bebas sel. Oleh karena itu, keunggulan glisil-histidin sebagai substrat
peptidase atau efektor sintesis toksin tidak tergantung pada transpor
membrannya. Para penulis menunjukkan bahwa produksi toksin berbanding
lurus dengan hidrolisis peptida histidin. Mereka juga memeriksa bahwa
toksin dan histidin peptidase bukanlah protein yang sama (Miller et al., 1960
). Kemudian, Helting dkk. menemukan enzim ini dalam supernatan dan
menegaskan bahwa itu aktif terhadap glisil-histidin dan tidak bertanggung
jawab untuk proteolisis menjadi toksin matang (Helting dkk., 1979).
6.2. Konsumsi peptida kasein dari sumber asam amino kompleks
Untuk mengevaluasi lebih lanjut dampak dari pencernaan kasein pankreas
(NZ-Case) dan mengidentifikasi peptida kasein dengan efek pada sintesis toksin,
budidaya dilakukan untuk fraksi NZ-Case dengan strain Harvard dalam media
Massachusetts yang dimodifikasi (ditambah dengan 1,01 g/L KH2PO4, 0,72 g/L
CaCl2dan 0,36 g/L arang aktif).Porfirio dkk. (1997)menemukan bahwa hanya
penghilangan fraksi netral dari pencernaan kasein yang menurunkan produksi
toksin, sekitar 30%, menunjukkan bahwa fraksi ini mengandung satu atau
beberapa elemen yang mendorong sintesis toksin. Penghilangan fraksi asam atau
basa kasein digest tidak mempengaruhi titer toksin. Oleh karena itu, mereka
memurnikan peptida dari bagian netral dan secara individual menambahkannya
ke media Massachusetts. Mereka menunjukkan bahwa peptida berikut adalah
yang paling aktif dalam produksi toksin, dengan titer toksin akhir mencapai 200%
hingga 265% dari produksi toksin di media Massachusetts:
- Ile – Pro – Ile – Gln – Tyr – Val
- Val – Leu – Gly – Pro – Val
- Ala – Val – Pro – Tyr – Pro – Gln
- Asp – Bertemu – Pro – Ile
- Val – Ala – Pro – Phe – Pro – Glu – Val – Phe
- Glu – Met – Pro – Phe – Pro – Lys
Mereka juga menunjukkan bahwa peptida glisil-L-histidin dari
bagian dasar kasein mencerna sintesis toksin.
Protease seng ditemukan dalam kasein dalam pencernaan triptik, yang
merupakan komponen media Massachusetts (Meja 2). Pola Pro-hidrofobik-Pro
adalah karakteristik dari beberapa inhibitor peptidase seng, dan toksin tetanus
adalah protein seng. Dengan demikian, penulis menyarankan bahwa keberadaan
peptida Prohydrophobic-Pro ini dapat meningkatkan produksi toksin dengan
melindungi toksin dari degradasi proteolitik. Mereka juga mengusulkan bahwa
pola peptida ini dapat bertindak sebagai sinyal hormon peptida pada bakteri
untuk sintesis toksin.Porfirio et al., 1997).
L. Garrigues dkk. Kemajuan Bioteknologi xxx (xxxx) xxx

Licona-Cassani dkk. (2016)mengidentifikasi peptida spesifik dari pencernaan Tabel 4A

kasein (NZ-Case) yang secara khusus dikonsumsi olehC tetaniE88. Para penulis Komposisi glukosa dan asam amino awal dari media yang ditentukan secara kimia.

menunjukkan bahwa peptida dikonsumsi setelah kehabisan asam amino bebas. Komponen glukosa dan Feeney dkk. Licona-Cassani dkk.
Mereka menyarankan bahwa konsumsi peptida ini dapat menjelaskan penurunan asam amino (1943b) (2016)
laju pertumbuhan spesifik, karena transpor peptida membutuhkan lebih banyak Jumlah (g) untuk 1 L
energi daripada transpor asam amino bebas. Peptida yang dikonsumsi Glukosa 10 10
menyajikan pola bersama spesifik berikut: Alanin - 0,1 (L-)
arginin 0,5 (L-) 0,1 (L-)
Asam aspartat 0,2 (DL-) 0,1 (L-)
- Val – Pro – Gln – Leu – Glu – Ile – Val
Sistein - 0,5 (L-)
- Val – Tyr – Pro – Phe – Pro – Gly – Pro – Ile Sistin 0,4 (L-) 0,05 (L-)
Asam glutamat 2.5 (D-) 0,1 (L-)
Peptida terakhir menyimpan pola Pro-Phe-Pro, yang dijelaskan oleh Glutamin - 0,2 (L-)
glisin - 0,1 (L-)
Porfirio dkk. (1997)sebagai inhibitor protease seng.
histidin 0,5 (L-) 0,1 (L-)
Licona-Cassani dkk. (2016)juga memperhatikan bahwa konsumsi isoleusin 0,3 (DL-) 0,1 (L-)
peptida terkait dengantetXekspresi dalam analisis transkripsi, Leusin 0,3 (DL-) 0,1 (L-)
menyimpulkan bahwa peptida spesifik ini penting untuk aktivasi Lisin 0,2 (DL-) 0,1 (L-)
produksi toksin tetanus (Licona-Cassani dkk., 2016). metionin 0,2 (DL-) 0,1 (L-)
Fenilalanin 0,2 (DL-) 0,1 (L-)
Selanjutnya, sintesis toksin telah terbukti bergantung pada kandungan
prolin - 0,1 (L-)
produk reaksi Maillard. Ketika media disterilkan dengan penyaringan atau Hidroksi-Prolin - 0,1 (L-)
diautoklaf terlalu lama, tidak ada toksin yang terdeteksi. Produksi toksin serin 0,2 (DL-) 0,1 (L-)
membutuhkan produk reaksi Maillard dalam jumlah yang cukup, yang treonin 0,2 (DL-) 0,2 (L-)
triptofan 0,05 (L-) 0,1 (L-)
dihasilkan dari reaksi peptida-gula di bawah panas (Chung dkk., 2016).
Tirosin 0,3 (L-) 0,1 (L-)
Mengingat studi tentang peran peptida dalam produksi toksin, tampaknya Valin 0,3 (DL-) 0,1 (L-)
glycyl-histidine dan pola peptida Pro-Phe-Pro memiliki pengaruh yang signifikan
(L-): L enansiomer; (D-): D enansiomer; (DL-): campuran rasemat.
terhadap produksi toksin. Mereka dapat digunakan untuk merancang media yang
ditentukan secara kimia yang mempromosikan sintesis toksin.
Di antara asam amino yang berpotensi diidentifikasi sebagai auxotrophic oleh

6.3. Konsumsi asam amino gratis untuk pertumbuhan C. tetani dan produksi Yu dkk. (2009), hanya histidin dan leusin yang dikonsumsi secara signifikan dalam

toksin kultur yang ditanam di media yang didefinisikan secara kimia Licona-Cassani (
Tabel 4B). Arginin, isoleusin, triptofan dan valin (diidentifikasi sebagai esensial

Terlepas dari pengaruh peptida dalam produksi toksin, penelitian dilakukan oleh Feeney et al.) sedikit atau tidak dikonsumsi dalam percobaan Licona-Cassani

untuk merancang media yang didefinisikan secara kimia yang dapat mendukung baik dalam media yang kompleks maupun yang ditentukan secara kimia. Oleh

C. tetanipertumbuhan dan produksi toksin. Dua media yang berbeda dievaluasi ( karena itu, orang dapat bertanya-tanya apakah asam amino ini diperlukan untukC.

Tabel 4A) (Feeney dkk., 1943b;Licona-Cassani dkk., 2016)). Glukosa hadir pada tetani pertumbuhan. Pertumbuhan berhenti setelah penipisan lima asam amino
konsentrasi yang sama di kedua media, tetapi komposisi awal dan konsentrasi (Glu, Ser, Gln, His, Thr), menunjukkan kemungkinan auksotrofi baru untuk

asam amino tidak identik: i) Licona-Cassani et al. menambahkan L enansiomer dari glutamat, serin, glutamin, dan treonin. Pada akhir fase diam, tiga asam amino

alanin, glutamin, glisin dan (hidroksi)prolin, yang tidak digunakan oleh Feeney et lainnya dikonsumsi sepenuhnya (Asp, Asn, Met). Keseluruhan,C. tetani

al.; ii) Feeney dkk. menggunakan enansiomer L dan D atau campuran rasemat, mengasimilasi tiga belas asam amino untuk melakukan pertumbuhan hingga

dan iii) asam amino lebih terkonsentrasi di Feeney et al. budaya. Garam dan kepadatan optik maksimal (530 nm) 1,3 pada laju pertumbuhan spesifik = 0,69 jam
− 1(Gambar 5). Dari pengamatan dalam dua percobaan ini dalam media yang
vitamin juga ada tetapi tidak ditampilkan dalam tabel. Media yang digunakan oleh
Licona-Cassani et al. didasarkan pada media yang ditentukan secara kimia yang ditentukan secara kimia dan dalam kombinasi dengan studi kasein peptida,

digunakan untuk kultur streptokokus patogen. Hasil dari kedua penelitian tentang histidin tampaknya menjadi sangat penting untukC. tetanipertumbuhan.

konsumsi asam amino bebas ini dirangkum dalamTabel 4B. Licona-Cassani dkk. (2016)diamati dalam media Massachusetts yang
dimodifikasi bahwa penipisan asam amino bebas berkorelasi dengan awal fase

Feeney dkk. (1943) menganalisis efek asam amino dalam media yang pertumbuhan yang lebih lambat ketika peptida mulai dikonsumsi. Pada media

ditentukan secara kimia pada pertumbuhan dengan penghilangan satu per satu ( yang ditentukan secara kimia, tidak ada produksi toksin yang diamati. SebagaitetX

Feeney dkk., 1943b).Yu dkk. (2009)mengidentifikasi kemungkinan auksotrofi yang Ekspresi dipicu ketika metabolisme berubah dari asam amino menjadi konsumsi

dihasilkan dari kurangnya jalur biosintesis asam amino diC. tetanidengan analisis peptida, produksi toksin tetanus mungkin disebabkan oleh transisi metabolisme

bioinformatika genomnya (Yu dkk., 2009).Licona-Cassani dkk. (2016)mengikuti ini. Dalam kultur yang dilakukan dalam media Massachusetts yang dimodifikasi,

kinetika konsumsi asam amino dalam media yang kompleks dan terdefinisi secara gen yang mengkode degradasi glutamat, histidin, serin, treonin dan aspartat

kimia (Licona-Cassani dkk., 2016). Tidak ada produksi toksin yang diamati pada ditemukan sangat diekspresikan selama fase pertumbuhan eksponensial dan

kedua media yang ditentukan secara kimia, tetapi analisis asam amino yang lebih lambat, menunjukkan konsumsi kuat asam amino ini (Licona-Cassani dkk.,

menopang pertumbuhan mudah dilakukan, karena media tidak mengandung 2016). Dalam percobaan lebih lanjut, kelima asam amino ini ditambahkan dalam

bahan kompleks. media Massachusetts yang dimodifikasi (+ 0,8 g/L masing-masing asam amino) (

Di antara delapan asam amino auksotrofik diduga (Yu dkk., 2009), hanya Orellana dkk., 2020). Hal ini menghasilkan peningkatan kepadatan sel 2,5 kali lipat,

lima (His, Ile, Leu, Trp, Val) yang dianggap penting oleh Feeney et al. (Tabel dengan fase pertumbuhan eksponensial yang lebih lama (8,5 jam, bukan 5 jam,

4B). Para penulis juga mengidentifikasi arginin, isoleusin, triptofan dan valin dengan tingkat pertumbuhan yang sama (0,46 jam).− 1) seperti pada percobaan

sebagai esensial untukC. tetanipertumbuhan. kontrol). Fase pertumbuhan yang lebih lambat menunjukkan peningkatan laju

Mueller dan Miller (1949)menunjukkan bahwa penambahan glutamin sebagian dapat pertumbuhan dua kali lipat dengan penambahan asam amino (0,145 h− 1

menggantikan pencernaan kasein. Menggunakan strain Harvard dalam tabung reaksi, bukannya 0,06 jam− 1untuk budaya kontrol); namun, titer toksin akhir dua kali lipat

kandungan kasein yang lebih rendah dalam media menghasilkan produksi toksin 3 kali lebih rendah. Selain itu, gen yang terlibat dalam jalur degradasi aspartat untuk

lipat lebih rendah. Penambahan 0,25 g/L glutamin memulihkan setengah dari titer toksin metabolisme pirimidin (CTC2383-2384) diekspresikan selama fase pertumbuhan

biasa (50 Lf/mL dengan glutamin menjadi 90 Lf/mL untuk tabung kontrol) (Mueller dan eksponensial, daripada selama fase pertumbuhan yang lebih lambat, seperti yang

Miller, 1949). Asam amino ini benar-benar dikonsumsi dalam media yang ditentukan diamati dalam kultur kontrol. Oleh karena itu, pemanfaatan aspartat dalam jalur

secara kimia yang dijelaskan oleh Licona-Cassani (Licona-Cassani dkk., 2016). pirimidin dapat dikaitkan dengan regulasi toksin. Secara lebih umum, tingkat
ekspresi dari

10
L. Garrigues dkk. Kemajuan Bioteknologi xxx (xxxx) xxx

Tabel 4B
Asam amino bebas yang terlibat dalamClostridium tetanipertumbuhan.

Asam amino (Feeney dkk. Yu dkk. Licona-Cassani dkk. (2016)

Digunakan untuk (1943b) (2009) regangan E88
bakteri Harvard regangan E88sebuah Perkiraan konsumsi
pertumbuhan regangan kekurangan dalam
Di modifikasi Pada
Pada Asam amino
Massachusetts secara kimiawi
secara kimiawi biosintetik
sedangb ditentukan
ditentukan jalan setapak
sedang (
sedang (
Tabel 4A)
Tabel 4A)

arginin penting - 0% 20%

asparagin bukan - 90% 100%
bereksperimen
Aspartat kurang efektif - 100% 100%
Sistein bukan - 90% bukan

bereksperimen dianalisis
glutamat dirangsang - > 95% 100%
Glutamin bukan - 90% 100%
bereksperimen
histidin penting auksotrofik > 95% 100%
isoleusin penting auksotrofik 0% 15%
Leusin penting auksotrofik 0% 60%
Lisin kurang efektif auksotrofik 0% 25%
metionin kurang efektif auksotrofik 75% 100%
Fenilalanin kurang efektif auksotrofik 0% 20% Gambar 5.Konsumsi asam amino dalam medium yang ditentukan secara kimia,diadaptasi dari
serin dirangsang - > 95% 100%
Licona-Cassani dkk. (2016).
treonin dirangsang - > 95% 100%
triptofan pentingc auksotrofik 0% 0%
Tirosin penting - 100% 60% 6.4. Konsumsi glukosa selama budidaya C. tetani
Valin penting auksotrofik 0% 0%
Pada tahun 1943, Mueller dkk. melaporkan bahwa pertumbuhan dan produksi
Pertumbuhan Xmaksimal= - =0.24 jam− 1 =0,69
80–85% dari selama
h− 1 toksin terjadi pada medium kompleks dengan penghilangan glukosa atau sistin,
Xmaksimal eksponensial tetapi pertumbuhan gagal jika keduanya dihilangkan. Kemudian, mereka
diperoleh di pertumbuhan, maka menyarankan bahwa kedua komponen mungkin terlibat dalam pemeliharaan
Mueller dan =0,083 jam− 1 kondisi anaerobik (Mueller dkk., 1943).
Tukang giling selama lebih lambat
Pada medium semisintetik asam casamino,Kaufman dan Humphries (1958)
sedang pertumbuhan

Esensial: tidak ada pertumbuhan ketika asam amino dihilangkan. Terstimulasi: sedikit
pertumbuhan setelah 48 jam kultur ketika asam amino dihilangkan. Kurang efektif: Pertumbuhan
yang baik setelah 48 jam kultur ketika asam amino dihilangkan.
Xmaksimal: konsentrasi biomassa maksimum; : laju pertumbuhan spesifik.
sebuahRegangan tidak ditentukan; mungkin E88, karena itu adalah satu-satunya yang diurutkan pada
waktu itu.
bMedia Massachusetts dilengkapi dengan sistin, urasil dan vitamin dan dengan
jumlah jejak FeCl3.
cTriptofan tidak diuji dalam media yang ditentukan secara kimia ini tetapi
diidentifikasi sebagai penting dalam percobaan sebelumnya dalam media
kompleks (Mueller & Miller, 1942).
gen yang mengkode degradasi glutamat, histidin, treonin, metionin dan
aspartat berbeda dalam dua kultur, dengan ekspresi gen yang lebih kuat
diamati pada jam-jam pertama pertumbuhan dalam kultur yang ditambah
asam amino. Ekspresi gen yang terkait dengan metabolisme serin dan
tirosin serupa pada kedua kondisi tersebut. Para penulis menyarankan
bahwa suplementasi asam amino dapat mengakibatkan kelebihan asam
amino, yang mengarah pada akumulasi zat antara atau produk sampingan
metabolik, yang dapat menghambattetRtranskripsi (Orellana dkk., 2020).
menunjukkan pada empat galur dari laboratorium Universitas Kentucky bahwa glukosa
tidak esensial dan tidak merangsang untukC. tetani pertumbuhan. Namun, pada media
yang ditentukan secara kimia, glukosa tidak penting untuk setengah dari strain tetapi
stimulasi untuk strain lainnya: dengan penghilangan glukosa, dua strain menunjukkan
pertumbuhan normal (transmisi cahaya 51%), sedangkan dua lainnya menunjukkan
pertumbuhan yang lebih buruk (87% cahaya). penularan). Para penulis menyarankan
bahwa senyawa degradasi glukosa mungkin terlibat dalam beberapa proses
pemanfaatan asam amino. Tidak ada produksi toksin yang diamati dalam penelitian ini (
Kaufman dan Humphries, 1958).
Martinez dan Rittenberg (1959)menunjukkan bahwa glukosa dikonsumsi
hanya setelah 24 sampai 30 jam pertumbuhan pada media kompleks yang
mengandung kasein, ekstrak ragi dan glukosa. Dari titik waktu ini, pertumbuhan
meningkat secara proporsional dengan penambahan glukosa dalam medium.
Dengan mengamati fosforilasi glukosa dalam ekstrak bebas sel, penulis kemudian
mengkonfirmasi keberadaan glukokinase di .C. tetanigalur Harvard dan 45e.
Fenomena ini khusus untuk glukosa, karena heksosa lainnya tidak terpengaruh.
Mereka menyarankan bahwa enzim ini dapat diinduksi karena tidak menunjukkan
aktivitas dalam sel yang ditumbuhkan dalam media tanpa glukosa.Martinez dan
Rittenberg, 1959).
Dalam kultur berkelanjutan pada medium kompleks (regangan turunan
Harvard), terlepas dari apakah laju pengenceran atau konsentrasi glukosa awal
diubah, tidak ada toksin yang ditemukan dalam supernatan sampai glukosa habis
dikonsumsi. Pelepasan toksin kemudian dikaitkan dengan pembatasan glukosa (
Zacharias dan Bjorklund, 1968).
Fratelli dkk. (2005)mempelajari kebutuhan glukosa ketika strain varian Harvard

Studi yang disajikan dalamTabel 4Btidak memberikan informasi tentang
efek sistein padaC. tetanipersyaratan pertumbuhan. Dalam medium
kompleks, penambahan sistin (Cys-Cys peptide) setelah autoklaf dan bukan
sebelum autoklaf menurunkan produksi toksin, mungkin karena efek panas
pada sistin. Selain itu, sistin menghambat sintesis toksin bila ditambahkan
pada konsentrasi lebih dari 125 mg/L (Latham dkk., 1962).
dikultur dengan sumber nitrogen NZ-Case TT. Mereka menunjukkan bahwa
konsentrasi glukosa optimal adalah 9,7 g/L untuk 43,5 g/L NZ. Dengan konsentrasi
glukosa yang rendah (2,3 g/L), terjadi pertumbuhan tetapi tidak menyebabkan
produksi toksin di supernatan. Selain mengoptimalkan konsentrasi glukosa,
mereka mengungkapkan bahwa rasio antara sumber karbon dan nitrogen
merupakan faktor kunci. Mereka membangun hubungan antara glukosa dan
sumber nitrogen yang dijelaskan dengan rumus berikut, di mana G0(g/L) adalah
konsentrasi glukosa awal, dan NZ0(g/L) adalah konsentrasi cerna kasein awal (
Fratelli et al., 2005):

11
L. Garrigues dkk.
( ) ( )
G0 NZ0−
Toksin (Lf/mL) = 46.29 + 5.55 − 2 + 26.82 2
4 12.5
( ) ( )
G0− NZ0−
– 6.39 2 2 9.04 22
4 12.5
(p <0,0001; R2= 0,76)
Pada media yang ditentukan secara kimia yang mengandung konsentrasi
glukosa awal 10 g / L, tidak ada glukosa yang dikonsumsi selama pertumbuhan (
Licona-Cassani dkk., 2016).
6.5. Pengaruh senyawa anorganik pada pertumbuhan C. tetani dan
produksi toksin
6.5.1. Besi
Peran beberapa faktor pertumbuhan dapat bergantung pada komponen media
lainnya.Lerner dan Mueller (1949)konsentrasi zat besi terkait dengan konsumsi glukosa
dalam media Mueller dan Miller. Sel dalam medium yang kekurangan zat besi tidak dapat
memfermentasi glukosa. Konsumsi glukosa secara semilogaritmik sebanding dengan
kandungan besi dan diperkirakan melalui produksi karbon dioksida. Mereka
menyarankan bahwa enzim atau koenzim dari jalur glukosa bergantung pada zat besi.
Kemudian, enzim ini diidentifikasi sebagai piruvat:feredoksin oksidoreduktase, yang
mengandung gugus Fe–S, yang mengkatalisis degradasi piruvat menjadi asetil-KoA (
Bruggemann dan Gottschalk, 2004). Enzim ini membutuhkan ferredoxin teroksidasi
sebagai substrat dan melepaskannya dalam bentuk tereduksi.Lerner dan Mueller (1949)
juga bereksperimen dengan penambahan glutamin dalam medium kompleks yang
kekurangan zat besi. Hal ini mengakibatkan produksi karbon dioksida terstimulasi,
mendekati tingkat produksi yang diamati dalam medium besi tinggi. Dengan demikian,
penambahan glutamin dapat mengatasi kekurangan zat besi (Lerner dan Mueller, 1949).
BerdasarkanFeeney dkk. (1943a), pada media kasein hidrolisat,
konsentrasi besi optimum adalah 50 mg/L besi tereduksi (bubuk)
(Feeney dkk., 1943a) atau 0,3 mg/L FeSO− 4.7H2O (Muller dan Miller,
1954). Dalam kedua studi, pada konsentrasi di atas nilai-nilai ini, pertumbuhan
lebih baik, tetapi produksi toksin menurun. Oleh karena itu, pertumbuhan dan
produksi toksin bergantung pada kandungan besi.
Dalam studi awal, Demain et al. (2003) mengamati bahwa penurunan
kandungan besi bubuk mempengaruhi titer toksin hanya jika besi diautoklaf
dengan senyawa lain dalam media Mueller dan Miller. Ketika besi diautoklaf
secara terpisah, konsentrasinya tidak berpengaruh pada produksi toksin (
Demain dan Fang, 2003).
Pada tahun 2006, ketika strain turunan Harvard (dari Wyeth-Lederle Vaccine
and Pediatrics) dikultur dalam media berbasis kedelai,Demain dkk. (2006)
menunjukkan bahwa zat besi sangat penting untuk produksi toksin. Namun,
hanya serbuk besi tereduksi yang menghasilkan titer toksin yang memuaskan
(56-73 Lf/mL) pada konsentrasi optimal 0,5 g/L. Ketika besi yang tidak larut
digantikan oleh sumber besi yang larut seperti besi sitrat, besi glukonat atau besi
amonium sulfat, produksi toksin moderat (36-43 Lf/mL) diamati. Ferrous sulfate,
ferric chloride dan ferric nitrate gagal mendukung produksi toksin. Namun,
suplementasi arang aktif dengan sumber besi terlarut (ferrous sulfate, ferric
citrate, ferrous glukonat) meningkatkan produksi toksin (53-68 Lf/mL), yang
konsisten dengan hasil yang diperoleh dengan serbuk besi. Arang menyediakan
permukaan pertumbuhan yang tidak larut bagi bakteri. Ketika bagian media yang
tidak larut dihilangkan dengan penyaringan, produksi toksin hampir setengahnya.
Tampaknya besi padat dapat menyediakan permukaan untuk pertumbuhan atau
dapat menyerap beberapa senyawa penghambat. Besi dalam bentuk padatnya
juga dikenal dapat menyerap oksigen, yang menguntungkan bagi bakteri anaerob
(Demain dkk., 2006).
Licona-Cassani dkk. (2016)mengamati tidak ada perubahan total kandungan
besi terlarut (Fe2+dan Fe3+) dalam media Massachusetts yang dimodifikasi selama
fermentasi, tetapi kesimpulan ini dapat menjadi bias karena zat besi tampaknya
hadir secara berlebihan dalam media (0,03 mg/L FeCl3), meskipun diencerkan
1000×dibandingkan dengan tingkat di media Massachusetts awal (32 mg/L FeCl3.6
H2HAI). Mereka menentukan bahwa total besi intraseluler (Fe2+
dan Fe3+) kandungan sedikit menurun selama metabolisme glukosa, yang
sesuai dengan pengamatan Lerner et al. (1949) yang berhubungan dengan
konsentrasi zat besi dan konsumsi glukosa. Selain itu, transkriptomik
12
Kemajuan Bioteknologi xxx (xxxx) xxx
analisis kultur E88 menunjukkan bahwa Fe2+gen transpor (CTC451–452,
CTC534) diekspresikan dalam kedua fase pertumbuhan, sedangkan Fe3+gen
transpor di-sitrat (CTC784, CTC956, CTC961, CTC1371) diekspresikan selama
fase pertumbuhan lambat, ketika toksin diproduksi (Licona-Cassani dkk.,
2016).
6.5.2. garam mineral
Mueller dkk., 1943melaporkan bahwa garam anorganik kalium,
magnesium dan fosfat diperlukan untukC. tetanipertumbuhan (Mueller dkk.,
1943). Dalam budaya berkelanjutan,Zacharias dan Björklund (1968)
menunjukkan bahwa penambahan 0,1 g/L kalium klorida dalam media
Massachusetts yang dimodifikasi menggandakan produksi toksin (70 Lf/mL
menjadi 130 Lf/mL) dalam turunan regangan Harvard (strain 107). Mereka
menunjukkan bahwa kalium memiliki sifat meningkatkan permeabilitas
membran sel. Mereka mengamati fenomena yang berlawanan (70 Lf/mL
hingga 40 Lf/mL) dengan penambahan 0,15 g/L kalsium klorida, yang
diketahui dapat mengurangi permeabilitas membran sel (Zacharias dan
Bjorklund, 1968). Dalam kultur labu TGY strain CN655, konsentrasi fosfat
anorganik optimal untuk produksi toksin ditemukan 40 mM (dua kali lipat
konsentrasi toksin ekstraseluler dibandingkan dengan TGY tanpa
penambahan fosfat). Suplementasi fosfat meningkatkan transkripsitetXtapi
bukan regulator transkripsinyatetR. Dengan demikian, penulis menyarankan
bahwa regulasi toksin oleh fosfat tidak terkait dengan TetR (Chapeton-
Montes dkk., 2020).
6.5.3. vitamin
Vitamin dan elemen pelacak yang digunakan untuk dipasok oleh infus
jantung sapi ke dalam media Mueller dan Miller untukC. tetanipertumbuhan.
Latham dkk. (1962)menunjukkan bahwa infus jantung sapi tidak penting
untuk pertumbuhan dan produksi toksin. Infus jantung sapi berhasil diganti
dengan asam nikotinat, vitamin B12 dan zat besi (Latham dkk., 1962). Ketika
Hy-Soy®pepton digunakan, penambahan vitamin tidak diperlukan. Hy-Soy®
pepton mungkin mengandung cukup urasil, kalsium pantotenat, tiamin,
riboflavin, piridoksal dan biotin untukC. tetanipertumbuhan dan produksi
toksin. Bahan kompleks ini juga memenuhi persyaratan tirosin dan sistin,
karena suplementasi bahan-bahan ini tidak lagi diperlukan (Demain dkk.,
2007).
Dalam media yang didefinisikan secara kimia, Feeney et al. (1943b) menunjukkan
bahwa sepuluh vitamin dan senyawa berasimilasi sangat penting untuk HarvardC. tetani
pertumbuhan: biotin, kalsium pantotenat, asam folat, asam nikotinat, asam oleat,
riboflavin, piridoksin, thiamin, adenin dan urasil (Feeney dkk., 1943b).
Media yang ditentukan secara kimia yang digunakan olehLicona-Cassani dkk.
(2016) mengandung semua vitamin Feeney dan senyawa yang diasimilasi kecuali
asam oleat, yang mendukung pertumbuhan. Pada media kompleks, mereka
mengamati bahwa kalsium pantotenat dan riboflavin dikonsumsi selama
metabolisme asam amino, sedangkan konsentrasi piridoksin dan asam nikotinat
meningkat selama fermentasi. Mereka juga menemukan bahwa urasil diambil
(metabolisme asam amino) dan dilepaskan (autolisis) selama budidaya (Licona-
Cassani dkk., 2016).
7. Kesimpulan
ItuC. tetanigenom sangat dilestarikan di antara semua galur yang diurutkan,
terutama di antara galur yang digunakan untuk produksi toksin (strain Harvard, clade
1A). Khususnya, gen penyandi toksin menunjukkan identitas urutan 99,3-99,4%. Identitas
ini mencapai 100% untuk urutan gen regulator transkripsi. Sekuensing seluruh genom
dan penentuanC. tetanijalur metabolisme menunjukkan metabolisme berorientasi pada
asimilasi asam amino, dengan banyak enzim yang didedikasikan untuk transportasi dan
degradasi asam amino, yang umum untuk bakteri patogen. Meskipun mikroorganisme
ini telah digunakan selama bertahun-tahun, regulator yang menginduksi sistem regulasi
untuk sintesis toksin belum sepenuhnya diidentifikasi. Beberapa strategi eksperimental
telah mengarah pada pengembangan media yang didefinisikan secara kimia berbeda
yang mampu mempertahankanC. tetanipertumbuhan, tetapi tidak satu pun dari strategi
ini yang mengarah pada produksi toksin. Untuk saat ini, peptida tampaknya penting
untuk induksi produksi toksin. Secara khusus, histidin tampaknya
L. Garrigues dkk.
menjadi sangat penting dalamC. tetanipertumbuhan dan produksi toksin, baik dalam
bentuk bebas maupun peptida. Peran glukosa dalamC. tetaniproduksi toksin masih
belum jelas. Ini mungkin berkontribusi pada sintesis toksin, misalnya, dengan
menghasilkan metabolit yang menarik atau dengan interaksi yang tidak diketahui. Besi
tampaknya meningkatkan produksi toksin tergantung pada bentuk di mana ia dipasok.
Gambaran metabolisme ini dikombinasikan dengan studi nutrisi sebelumnya untukC.
tetanipertumbuhan dan sintesis toksin yang dikumpulkan dalam tinjauan ini dapat
memberikan dukungan untuk desain eksperimen baru pada pertumbuhan dan produksi
toksin dalam media yang ditentukan secara kimia. Misalnya, budidaya dengan
pengambilan sampel reguler dan strategi analisis mendalam (termasuk konsumsi
substrat dan penentuan metabolit) dapat memberikan pengetahuan baru tentang fitur
spesifik dariC. tetani. Menggabungkan analisis transkriptomik dan proteomik dalam
sistem fermentasi terkontrol harus memberikan pemahaman yang lebih baik tentang
metabolisme global dan dapat membantu menentukan senyawa kunci yang terlibat
dalamC. tetanipertumbuhan dan sintesis toksin. Eksperimen-eksperimen ini dapat
membantu menyediakan media baru yang ditentukan secara kimiawi yang akan
mendukung pertumbuhan dan sintesis toksin tetanus dan dengan demikian akan
memenuhi rekomendasi Organisasi Kesehatan Dunia untuk produksi vaksin tetanus.
Pernyataan Kepentingan Bersaing
Para penulis menyatakan tidak ada konflik kepentingan.
Pengakuan
Pekerjaan ini didukung oleh Sanofi-Pasteur dan Institut Bioteknologi
Toulousemelaluiproyek kompetitif INRA-TWB. Penulis berterima kasih
kepada AJE untuk pengeditan dokumen dalam bahasa Inggris (kode
sertifikasi 7F3A-18CA-A42B-AF16-8A4P).
Referensi
Bruggemann, H., Gottschalk, G., 2004. Wawasan dalam metabolisme dan produksi toksin dari
urutan genom lengkap dariClostridium tetani. Anaerob 10 (2), 53–68. https://
doi.org/10.1016/j.anaerobe.2003.08.001.
Bruggemann, H., Baumer, S., Fricke, WF, Wiezer, A., Liesegang, H., Decker, I., dkk.,
2003. Urutan genom dariClostridium tetani, agen penyebab penyakit tetanus. Prok.
Natal akad. Sci. AS 100 (3), 1316–1321.https://doi.org/10.1073/ pnas.0335853100.
Bruggemann, H., Bauer, R., Raffestin, S., Gottschalk, G., 2004. Karakterisasi a
heme oksigenase dariClostridium tetanidan kemungkinan perannya dalam toleransi oksigen.
Lengkungan. Mikrobiol. 182 (2–3), 259–263.https://doi.org/10.1007/s00203-004-0721-1. Bruggemann,
H., Brzuszkiewicz, E., Chapeton-Montes, D., Plourde, L., Speck, D.,
Popoff, MR, 2015. Genomics ofClostridium tetani. Res. Mikrobiol. 166 (4), 326–331.
https://doi.org/10.1016/j.resmic.2015.01.002.
Buckel, W., Barker, HA, 1974. Dua jalur fermentasi glutamat secara anaerobik
bakteri. J. Bakteri. 117 (3), 1248–1260.https://doi.org/10.1128/JB.117.3.1248-
1260.1974.
Chapeton-Montes, D., Plourde, L., Bouchier, C., Ma, L., Diancourt, L., Criscuolo, A., dkk.,
2019. Struktur pendudukClostridium tetanidisimpulkan dari genom pan-nya. Sci.
Rep.9 (1), 1–11.
Chapeton-Montes, D., Plourde, L., Deneve, C., Garnier, D., Barbirato, F., Colombié, V.,
et al., 2020. Sintesis toksin tetanus berada di bawah kendali jaringan kompleks gen
pengatur diClostridium tetani. Racun 12 (5), 328.
Chawal, AK, Das, C., Singh, P., Tiwari, M., Chaudhary, S., 2016. Produksi Tetanus
toksin dengan menggunakan media yang pada dasarnya bebas dari daging dan darah. Asia J.Pharm. klinik Res.
9 (6), 284–287.
Chung, YJ, Jung, MY, Lee, JA, Kim, TY, Choe, YK, Kim, IH, 2016. Toksin tetanus
produksi dariClostridium tetani, menggunakan media berbasis kasein dalam bioreaktor
sekali pakai. Bioteknologi. Bioproses Eng. 21 (4), 531–536.https://doi.org/10.1007/
s12257-016-0355-6.
Cohen, JE, Wang, R., Shen, RF, Wu, WW, Keller, JE, 2017. Perbandingan
patogenomik dariClostridium tetani. PLoS One 12 (8), e0182909.https://doi.org/
10.1371/journal.pone.0182909.
Connan, C., Deneve, C., Mazuet, C., Popoff, MR, 2013. Peraturan sintesis toksin di
Clostridium botulinum danClostridium tetani. Racun 75, 90-100.https://doi.org/
10.1016/j.toxicon.2013.06.001.
Dedic, GA, Koch, OG, 1956. Budidaya aerobikClostridium tetanidi hadapan
kobalt. J. Bakteri. 71 (1), 126.https://doi.org/10.1128/JB.71.1.126-126.1956. Demain,
AL, Gerson, DE, Fang, A., 2005. Tingkat toksin tetanus yang efektif dapat dibuat
dalam media produksi yang sama sekali tidak mengandung protein hewani (misalnya, infus
jantung otak) dan susu (misalnya, hidrolisat kasein). Vaksin 23 (46–47), 5420–5423. https://
doi.org/10.1016/j.vaccine.2005.03.043.
13
Kemajuan Bioteknologi xxx (xxxx) xxx
Demain, AL, Gerson, DF, Kole, M., Fang, A., 2006. Peran serbuk besi tereduksi dalam
produksi fermentasi toksin tetanus. aplikasi Mikrobiol. Bioteknologi. 73 (1), 55–59.
https://doi.org/10.1007/s00253-006-0450-2.
Demain, AL, George, S., Kole, M., Gerson, DF, Fang, A., 2007. Toksin tetanus
produksi dalam media berbasis kedelai: studi nutrisi dan peningkatan menjadi fermentor
kecil. Lett. aplikasi Mikrobiol. 45 (6), 635–638.https://doi.org/10.1111/j.1472-
765X.2007.02238.x.
Demain, Arnold L., Fang, Aiqi, 2003. Paten Google (Paten AS No. 6.558.926). Dineen, SS,
Villapakkam, AC, Nordman, JT, Sonenshein, AL, 2007. Penindasan
Ekspresi gen toksin Clostridium difficile oleh CodY. mol. Mikrobiol. 66 (1),
206–219.https://doi.org/10.1111/j.1365-2958.2007.05906.x.
Evans, AS, Brachmann, PS, 1998. Dalam: Perusahaan, PMB (Ed.), Infeksi Bakteri
Manusia: Epidemiologi dan Kontrol.
Feeney, RE, Mueller, JH, Miller, PA, 1943a. Persyaratan pertumbuhanklostridium
tetani: II. Faktor yang habis oleh pertumbuhan organisme. J. Bakteri. 46 (6), 559–562.
https://doi.org/10.1128/JB.46.6.559-562.1943.
Feeney, RE, Mueller, JH, Miller, PA, 1943b. Persyaratan pertumbuhanklostridium
tetani: AKU AKU AKU. Media “sintetis”. J. Bakteri. 46 (6), 563–571.https://doi.org/
10.1128/JB.46.6.563-571.1943.
Fontaine, L., Meynial-Salles, I., Girbal, L., Yang, X., Croux, C., Soucaille, P., 2002.
Karakterisasi molekuler dan analisis transkripsi adhE2, gen yang mengkode aldehida/
alkohol dehidrogenase yang bergantung pada NADH yang bertanggung jawab untuk
produksi butanol dalam kultur alkohologenikClostridium acetobutylicumATCC824. J. Bakteri.
184, 821–830.https://doi.org/10.1128/JB.184.3.821-830.2002.
Fratelli, F., Siquini, TJ, Prado, SM, Higashi, HG, Converti, A., De Carvalho, JC,
2005. Pengaruh komposisi medium terhadap produksi toksin tetanus dengan cara:
Clostridium tetani. Bioteknologi. Prog. 21 (3), 756–761.https://doi.org/10.1021/
bp049571b.
Fratelli, F., Siquini, TJ, De Abreu, ME, Higashi, HG, Converti, A., De Carvalho, JC,
2010. Produksi Fed-batch toksin tetanus olehClostridium tetani. Bioteknologi. Prog.
26 (1), 88–92.https://doi.org/10.1002/btpr.292.
Gill, DM, 1982. Racun bakteri: tabel jumlah yang mematikan. Mikrobiol. Wahyu 46 (1),
86–94.
Gonzalez-Pajuelo, M., Meynial-Salles, I., Mendes, F., Soucaille, P., Vasconcelos, I., 2006.
Konversi mikroba gliserol menjadi 1,3-propanediol: perbandingan fisiologis
produsen alami, Clostridium butyricum VPI 3266, dan galur rekayasa, Clostridium
acetobutylicum DG1(pSPD5). aplikasi Mengepung. Mikrobiol. 72 (1), 96-101. https://
doi.org/10.1128/AEM.72.1.96-101.2006.
Gutiérrez, I., Garzón, E., Vargas, P., Moreno, N., Piñales, RAP, 2005. Pengaruh
natrium glutamat, gelembung N2-gas dan aerasi superfisial pada produksi
toksin tetanus diClostridium tetanibudaya. Univ. Sci. 10 (2), 79–86.
Helting, TB, Zwisler, O., 1977. Struktur toksin tetanus. I. Pemecahan toksin
molekul dan diskriminasi antara fragmen polipeptida. J.Biol. Kimia 252 (1), 187–193.
Helting, TB, Parschat, S., Engelhardt, H., 1979. Struktur toksin tetanus.
Demonstrasi dan pemisahan enzim spesifik yang mengubah toksin tetanus
intraseluler menjadi bentuk ekstraseluler. J.Biol. Kimia 254 (21), 10728–10733.
Jagicza, A., Molnár, T., Csizér, Z., 1981. Produksi Toksin Tetanus Skala Besar di
Fermentor (Makalah dipresentasikan di Annales Immunologiae Hungaricae)
. Kaufman, L., Humphries, JC, 1958. Studi tentang kebutuhan nutrisi
Clostridium tetani. I. Sebuah media yang didefinisikan secara kimia. aplikasi Mikrobiol. 6 (5),
311–315. Krieglstein, KG, Henschen, AH, Weller, U., Habermann, E., 1991. Proteolisis terbatas
dari toksin tetanus. Kaitannya dengan aktivitas dan identifikasi situs pembelahan.
Eur. J. Biokimia. 202 (1), 41–51.https://doi.org/10.1111/j.1432-1033.1991.tb16342.x.
Latham, WC, Bent, DF, Levine, L., 1962. Produksi toksin tetanus tanpa adanya
protein. aplikasi Mikrobiol. 10, 146-152.
Lerner, EM, Mueller, JH, 1949. Peran glutamin dalam metabolisme glukosa
Clostridium tetani. J.Biol. Kimia 181 (1), 43–45.
Li, F., Hinderberger, J., Seedorf, H., Zhang, J., Buckel, W., Thauer, RK, 2008. Digabungkan
reduksi ferredoxin dan crotonyl coenzyme a (CoA) dengan NADH yang dikatalisis
oleh kompleks butyryl-CoA dehydrogenase/Etf dari Clostridium kluyveri. J. Bakteri.
190 (3), 843–850.https://doi.org/10.1128/JB.01417-07.
Li, JH, Ma, ML, Sarker, MR, McClane, BA 2013. CodY adalah regulator global
sifat terkait virulensi untuk Clostridium perfringens tipe D strain CN3718. Mbio, 4 (5),
e00770-00713. doi:https://doi.org/10.1128/mBio.00770-13. Licona-Cassani, C., Steen,
JA, Zaragoza, NE, Moonen, G., Moutafis, G., Hodson, MP,
et al., 2016. Produksi toksin tetanus dipicu oleh transisi dari konsumsi asam amino
ke peptida. Anaerob 41, 113-124.https://doi.org/10.1016/j. anaerob.2016.07.006.
Martinez, RJ, Rittenberg, SC, 1959. Disimilasi glukosa olehClostridium tetani.
J. Bakteri. 77 (2), 156-163.https://doi.org/10.1128/JB.77.2.156-163.1959.
Marvaud, JC, Eisel, U., Binz, T., Niemann, H., Popoff, MR, 1998. TetR adalah positif
pengatur gen toksin tetanus diClostridium tetanidan homolog dengan BotR.
Menulari. kekebalan. 66 (12), 5698–5702.https://doi.org/10.1128/Iai.66.12.5698-
5702.1998.
Masuyer, G., Conrad, J., Stenmark, P. 2017. Struktur toksin tetanus mengungkapkan pH-
dinamika domain yang dimediasi. Perwakilan EMBO., 18 (8), 1306-1317. doi:10.15252/embr.
201744198.
Medecine, 2020. Perpustakaan Nasional AS (produser). Clostridium tetani. Diterima dari.
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/browse/#!/prokariotes/1098/. Miller, Pauline
A., Gray, Clarke T., Eaton, Monroe D., 1960. Pembentukan dan aksi
peptidase yang menghidrolisis peptida histidin yang diperlukan dalam sintesis toksin
tetanus. J. Bakteri. 79 (1), 95-102.
Mueller, JH, Miller, PA, 1942. Persyaratan pertumbuhan Clostridium tetani. J. Bakteri.
43 (6), 763–772.
L. Garrigues dkk.
Mueller, JH, Miller, PA, 1949. Glutamin dalam produksi toksin tetanus. J.Biol.
Kimia 181 (1), 39–41.
Mueller, JH, Miller, PA, 1953. Partisipasi peptida dalam produksi toksin tetanus.
Trans. NY Acad. Sci. 16 (1), 20–23.https://doi.org/10.1111/j.2164-0947.1953.
tb00369.x.
Mueller, JH, Miller, PA, 1954. Faktor variabel yang mempengaruhi produksi tetanus
toksin. J. Bakteri. 67 (3), 271–277.https://doi.org/10.1128/JB.67.3.271-
277.1954.
Mueller, JH, Miller, PA, 1956. Peran penting peptida histidin dalam toksin tetanus
produksi. J.Biol. Kimia 223 (1), 185–194.
Mueller, JH, Schoenbach, EB, Jezukawicz, JJ, Miller, PA, 1943. Produksi
toksin tetanus pada media bebas pepton. J.klin. Menginvestasikan. 22 (2), 315–318.https://doi. org/
10.1172/JCI101397.
Muniandi, C., Lakshmanan, P., Mani, KR, Rathinasamy, S., 2013. Standarisasi
proses untuk meningkatkan produksi toksin tetanus yang murni dan kuat. J. Mikrobiol.
Menulari. D.3 (03), 133-140.
Orellana, CA, Zaragoza, NE, Licona-Cassani, C., Palfreyman, RW, Cowie, N.,
Moonen, G., et al., 2020. Transkriptomik perjalanan waktu mengungkapkan bahwa katabolisme asam
amino memainkan peran kunci dalam toksinogenesis dan morfologi diClostridium tetani. J.Ind.
Mikrobiol. Bioteknologi. 47 (12), 1059–1073.https://doi.org/10.1007/s10295- 020-02330-3.
Organization, World Health, 1994. Modul III: Prinsip-prinsip Produksi Vaksin Tetanus
Produksi dan Pengendalian Vaksin Tetanus: Sebuah Kurikulum Pelatihan. Organisasi
Kesehatan Dunia.
Organization, World Health, 2013. Manual Pengendalian Mutu Difteri, Tetanus
dan Vaksin Pertusis. Organisasi Kesehatan Dunia.
Organisasi, Kesehatan Dunia, 2017. Vaksin tetanus: makalah posisi WHO–Februari
2017. Epidemi Mingguan. Rek. 92 (6), 53–76.
Organization, World Health, 2019. Laporan Kasus Vaksin Terpilih yang Dapat Dicegah
Penyakit (VPD).
Porfirio, Z., Prado, SM, Vancetto, MD, Fratelli, F., Alves, EW, Raw, I., dkk., 1997.
Peptida spesifik dari pencernaan kasein pankreas meningkatkan produksi toksin
tetanus. J. Aplikasi Mikrobiol. 83 (6), 678–684.https://doi.org/10.1046/j.1365-
2672.1997.00299.x.
Qazi, O., Brailsford, A., Wright, A., Faraar, J., Campbell, J., Fairweather, N., 2007.
Identifikasi dan karakterisasi protein lapisan permukaanClostridium tetani.
Mikrobiol FEMS. Lett. 274 (1), 126-131.https://doi.org/10.1111/j.1574-
6968.2007.00834.x.
14
Kemajuan Bioteknologi xxx (xxxx) xxx
Raffestin, S., Dupuy, B., Marvaud, JC, Popoff, MR, 2005. BotR/a dan TetR adalah
faktor sigma RNA polimerase alternatif yang mengontrol ekspresi neurotoksin dan
gen protein terkait di Clostridium botulinum tipe a dan Clostridium tetani. mol.
Mikrobiol. 55 (1), 235–249.https://doi.org/10.1111/j.1365- 2958.2004.04377.x.
Ramon, G., 1923. La floculation dans les mélanges de toxine et de sérum antidiphtérique.
Ann. Inst. Pasteur 37 (12), 1001–1011.
Schiavo, G., Poulain, B., Rossetto, O., Benfenati, F., Tauc, L., Montecucco, C., 1992.
Toksin tetanus adalah protein seng dan penghambatan pelepasan neurotransmiter dan
aktivitas protease bergantung pada seng. EMBO J. 11 (10), 3577–3583.https://doi.org/
10.1002/j.1460-2075.1992.tb05441.x.
Schuchmann, K., Muller, V., 2014. Autotrofi pada batas termodinamika kehidupan: a
model konservasi energi pada bakteri asetogenik. Nat. Pdt. Mikrobiol. 12 (12), 809–
821.https://doi.org/10.1038/nrmicro3365.
Smith, J., Lipsitch, M., Almond, JW, 2011. Produksi vaksin, distribusi, akses, dan
serapan. Lancet 378 (9789), 428–438.https://doi.org/10.1016/S0140-6736(11)
60478-9.
Takumi, K., Susami, Y., Takeoka, A., Oka, T., Koga, T., 1991. Protein lapisan S dari
Clostridium tetani: pemurnian dan sifat. Mikrobiol. kekebalan. 35 (7), 569–575.
https://doi.org/10.1111/j.1348-0421.1991.tb01587.x.
Yoo, M., Bestel-Corre, G., Croux, C., Riviere, A., Meynial-Salles, I., Soucaille, P., 2015.
Karakterisasi skala sistem kuantitatif dari metabolismeClostridium acetobutylicum.
mBio 6 (6), e01808–e01815.https://doi.org/10.1128/mBio.01808- 15.
Yoo, M., Nguyen, NP, Soucaille, P., 2020. Tren dalam biologi sistem untuk analisis dan
rekayasa dariClostridium acetobutylicummetabolisme. Tren Mikrobiol. 28 (2),
118-140.https://doi.org/10.1016/j.tim.2019.09.003.
Yu, XJ, Walker, DH, Liu, Y., Zhang, L., 2009. Kekurangan biosintesis asam amino pada
bakteri yang berasosiasi dengan inang manusia dan hewan. Menulari. gen. Evolusi 9
(4), 514–517.https://doi.org/10.1016/j.meegid.2009.02.002.
Zacharias, B., Bjorklund, M., 1968. Produksi berkelanjutan dariClostridium tetanitoksin.
aplikasi Mikrobiol. 16 (1), 69–72.
Zhang, Z., Dahlsten, E., Korkeala, H., Lindstrom, M., 2014. Regulasi positif dari
ekspresi gen neurotoksin botulinum oleh CodY di Clostridium botulinum ATCC
3502. Appl. Mengepung. Mikrobiol. 80 (24), 7651–7658.https://doi.org/10.1128/
AEM.02838-14.