suhu 80-85oC selama 15 menit, kemudian ini diratakan dengan cara menggerakkan
didinginkan hingga suhu 37 oC. Selanjutnya secara vertikal membentuk angka 8 dan
dilakukan inokulasi kultur kerja biarkan sampai membeku, kemudian cawan
Lactobacillus casei sebanyak 4% (v/v) dan diinkubasi dengan posisi terbalik pada suhu
diinkubasi dalam inkubator pada suhu 37 oC 37oC selama 24 jam dan dihitung koloni yang
selama 0, 8, 16, 24, 32, 40, dan 48 jam. tumbuh dengan menggunakan alat
Diagram alir proses pembuatan minuman penghitung koloni (colony counter). Total
sinbiotik ekstrak daun cincau hijau dapat koloni yang terhitung harus memenuhi
dilihat pada Gambar 2. standar
(ICMF) yaitu antara 30
Analisis
sampai dengan 300 koloni per cawan petri
1. Total Bakteri Asam Laktat (BAL) (Fardiaz, 1987).
Sebanyak 1 ml sampel diencerkan
dengan 9 ml larutan garam fisiologis steril. Total BAL (CFU/ml )
Dari campuran tersebut diperoleh 1
Jumlah koloni terhit ung x
pengenceran 10-1. Campuran kemudian Faktor Pen genceran
dihomogenkan dan diambil 1 ml larutan dari
tabung pertama dan dimasukkan kedalam
tabung reaksi kedua yang juga berisi 9 ml 2. Total Asam Tertitrasi
larutan garam fisiologis sehingga diperoleh Sebanyak 1 ml sampel ditambahkan 9
pengenceran 10 -2 dan seterusnya sampai ml air destilat. Campuran tersebut kemudian
diperoleh pengenceran yang diinginkan. Dari dititrasi dengan larutan NaOH 0,1 N. Untuk
pengenceran yang dikehendaki diambil mengamati perubahan warna dari tidak
dengan pipet 1 ml sampel lalu dimasukkan ke berwarna menjadi merah muda digunakan
dalam cawan petri steril, lalu ditambahkan phenolphtalein sebagai indikator titik akhir
kira-kira 10-15 ml media MRS Agar steril. titrasi.
Cawan yang telah berisi media dan sampel
10,5
10,25 10,21
10,04 10,09
10,02
10 9,90
9,59
9,5
a a a a
9 b b b b
c c c
8,5 d
08
0 8 16 24 32 40 48
Lama Fermentasi (jam)
Gambar 3. Log Total BAL Minuman Sinbiotik Ekstrak Daun Cincau Hijau yang
Difermentasi selama 0 hingga 48 jam
Keterangan : Nilai tengah yang diikuti dengan huruf yang sama dinyatakan
tidak berbeda menurut uji BNT 5% = 0,187
bakteri asam laktat, dari 8,29x109 CFU/ml dapat pula terjadi sangat cepat, tanpa
menjadi 1,09x1010 CFU/ml atau sebesar 0,1 melewati fase lag, diduga berhubungan
log total bakteri (Gambar 3). Pertambahan dengan kondisi lingkungan dan media
jumlah mikroba tidak terjadi secara pertumbuhan yang sama seperti media dan
signifikan, diduga bakteri asam laktat berada lingkungan sebelumnya, sehingga
dalam fase lag atau pertumbuhan awal. Fase dimungkinkan tidak perlu waktu adaptasi.
ini berlangsung segera setelah inokulasi pada Namun berdasarkan hasil penelitian,
media nutrien dan merupakan periode pertambahan jumlah bakteri asam laktat pada
adaptasi. fermentasi ke 0 menuju 8 jam berjalan
Jika mikroba dipindahkan ke dalam lambat, hal ini mungkin disebabkan sel masih
suatu media, mula-mula akan mengalami berada dalam fase adaptasi dan tingkat
fase adaptasi untuk menyesuaikan dengan pertumbuhannya belum optimal.
kondisi lingkungan sekitarnya yang baru. Peningkatan jumlah sel bakteri terus
Lamanya fase adaptasi dipengaruhi oleh berlanjut hingga waktu fermentasi 16 jam,
beberapa faktor, diantaranya media dan yaitu nilai log total BAL menjadi 10,25. Pada
lingkungan pertumbuhan serta jumlah fermentasi 8 hingga 16 jam, sel berada dalam
inokulum awal. Media dan lingkungan fase logaritmik yaitu fase dimana bakteri
pertumbuhan sama seperti media dan asam laktat membelah dengan cepat dan
lingkungan sebelumnya, mungkin tidak konstan mengikuti kurva logaritmik. Fase
diperlukan waktu adaptasi. Begitu pula logaritmik merupakan periode pertumbuhan
dengan jumlah inokulum, semakin tinggi seimbang atau status mantap dengan laju
jumlah awal sel maka fase adaptasi akan pertumbuhan spesifik konstan
berlangsung singkat (Marniza dan S.Rizal, (Judoamidjojo,dkk., 1990). Dalam seluruh
2004). proses fermentasi, komposisi kimia media
Setelah fase adaptasi sel, yaitu terjadi mengalami perubahan karena nutrien akan
perubahan-perubahan yang diperlukan, sel dikonsumsi dan zat-zat metabolit akan
beranjak ke fase pertumbuhan lambat. Pada diproduksi, sehingga lingkungan berada
fase ini bakteri asam laktat akan mulai dalam suatu status yang mantap. Menurut
membelah dengan kecepatan rendah karena Caldwell (1994), sel akan membelah diri
baru mulai menyesuaikan diri dengan kondisi dengan laju yang konstan, massa sel
lingkungan dan media yang baru. bertambah dan pertumbuhan sel berada
Pertambahan jumlah Lactobacillus casei
9,4
9,2
0
0 8 16 24 32 40 48
Lama fermentasi (j am)
Gambar 4. Kurva Pertumbuhan Bakteri Asam Laktat pada Minuman Sinbiotik Ekstrak Daun
Cincau Hijau selama Fermentasi 0 hingga 48 jam
dalam keadaan seimbang pada fase bertahan hidup pada waktu fermentasi 48 jam
pertumbuhan logaritmik. yaitu 9,59. Penurunan jumlah populasi
Pada waktu fermentasi 24 jam mikroba ini dapat disebabkan oleh telah
pertumbuhan sel bakteri mulai menurun, habisnya nutrisi di dalam media dan energi
namun nilainya relatif konstan dan tidak cadangan di dalam sel telah habis. Selain itu
terlalu signifikan (Gambar 4). Pada waktu hasil-hasil metabolisme mikroba itu sendiri
fermentasi ini jumlah log total sel bakteri kemungkinan beracun, sehingga dapat
asam laktat sebanyak 10,21. Jumlah sel yang menjadi penyebab kematian sel. Menurut
relatif konstan ini menunjukkan bahwa sel Caldwell (1994), jumlah sel yang mati lebih
bakteri berada dalam fase pertumbuhan tetap banyak sehingga terjadi penurunan jumlah
(statis). Menurut Judoamidjojo,dkk. (1990), populasi mikroba.
fase stasioner akan terjadi bila semua sel
Total Asam Tertitrasi Minuman Sinbiotik
berhenti membelah diri atau bila sel hidup
Ekstrak Daun Cincau Hijau
dan sel mati mencapai keseimbangan. Pada
fase ini jumlah populasi yang relatif konstan Hasil sidik ragam menunjukkan bahwa
karena jumlah sel yang tumbuh sama dengan lama fermentasi berpengaruh sangat nyata
jumlah sel yang mati. terhadap total asam minuman sinbiotik
Penurunan laju pertumbuhan kembali ekstrak daun cincau hijau. Minuman
terjadi pada waktu fermentasi 32 hingga 40 sinbiotik ekstrak daun cincau hijau yang
jam, namun nilai penurunan log total bakteri difermentasi selama 48 jam menghasilkan
asam laktat cukup signifikan dari 10,21 pada nilai total asam tertinggi, yaitu 4,95 %/ml.
waktu fermentasi 24 jam menjadi 10,02. Berdasarkan Uji Beda Nyata Terkecil (BNT)
Menurunnya jumlah sel bakteri ini pada taraf 5%, nilai tersebut menunjukkan
menunjukkan sel telah memasuki fase perbedaan yang nyata dengan nilai total asam
menuju kematian. Pada fase ini jumlah sel lainnya (Gambar 5).
yang hidup lebih sedikit dibandingkan Dari Gambar 5, terlihat bahwa pada 0
dengan sel yang mati, hal ini diduga jam, jumlah total asam yang terhitung sangat
disebabkan oleh nutrisi yang telah sangat kecil yaitu 1,50%. Asam yang terdapat di
berkurang dan kondisi lingkungan yang dalam minuman sinbiotik ini diduga berasal
kurang mendukung untuk bertahan hidup. dari asam sitrat yang tersisa pada ekstrak
Fase kematian terjadi setelah waktu daun cincau hijau, karena pada proses
fermentasi ke-40 jam. Hal ini diketahui dari pembuatan bubuk ekstrak daun cincau
penurunan log total bakteri asam laktat. ditambahkan asam sitrat yang berfungsi
Jumlah log total sel bakteri yang masih sebagai penghambat terbentuknya gel dari
4,95
5,00
4,50
3,90
4,00 3,60
3,30
3,00 e
2,40
d
2,00
1,50 c c c
1,00
b
a
0,00
0 8 16 24 32 40 48
Lama fermentasi (jam)
Gambar 5. Nilai Perubahan Total Asam Minuman Sinbiotik Ekstrak Daun Cincau Hijau
yang Difermentasi selama 0 hingga 48 jam
Keterangan : Nilai tengah yang diikuti dengan huruf yang sama dinyatakan
tidak berbeda menurut uji BNT 5% = 0,688
ekstrak daun cincau sehingga seluruh serbuk menjadi asam-asam lemak rantai pendek
daun cincau hijau dapat terlarut. Selain itu seperti asetat, propionat, dan butirat.
asam sitrat digunakan untuk membantu Selama proses fermentasi, komposisi
proses pemecahan pektin dari dinding sel kimia media mengalami perubahan sebagai
serbuk daun cincau hijau. akibat penggunaan nutrisi oleh bakteri asam
Pada fermentasi ke 16 jam, jumlah total laktat dan produksi zat-zat metabolit. Asam
asam yang terhitung sebesar 3,30%. Jumlah laktat yang terbentuk merupakan metabolit
ini meningkat dari perlakuan sebelumnya, primer dari proses fermentasi ini. Pada fase
diduga Lactobacillus casei telah melakukan stasioner, massa sel total mungkin konstan
proses fermentasi terhadap substrat ekstrak tetapi banyaknya sel hidup cenderung
daun cincau hijau dan menghasilkan asam menurun, proses metabolisme mungkin saja
laktat sebagai produk fermentasinya. Jumlah masih berlangsung dan terjadi penimbunan
total asam pada lama fermentasi 16 jam tidak produk (metabolit primer dan sekunder)
berbeda nyata dengan lama fermentasi 24 dalam media. Dengan demikian, meskipun
dan 32 jam yaitu sebesar 3,60 dan 3,90%. terjadinya penurunan jumlah sel bakteri,
Dalam penelitian ini, laju peningkatan total namun jumlah asam sebagai produk
asam tidak selalu berbanding lurus dengan metabolitnya tetap tinggi.
peningkatan jumlah sel bakteri asam laktat. Menurut Judoamidjojo,dkk. (1990),
Walaupun Lactobacillus casei telah sintesis metabolit sekunder dimulai pada saat
memasuki fase stasioner, namun pada fase habisnya beberapa zat gizi di dalam medium
ini, jumlah total asam yang terdapat dalam pertumbuhan bakteri asam laktat.
minuman sinbiotik terus meningkat. Menurut Keterbatasan zat gizi tersebut menyebabkan
Judoamidjojo,dkk. (1990), selama fase terakumulasinya induser enzim metabolit
pertumbuhan logaritmik akan dihasilkan sekunder dan terlepasnya gen-gen yang dapat
asam laktat yang merupakan metabolit memicu sintesis metabolit sekunder.
primer. Setelah sel memasuki fase stasioner, Biosintesis metabolit sekunder berkaitan
laju pertumbuhannya menurun karena dengan terjadinya induksi enzim yang berasal
substrat berkurang dan juga penumpukan dari hasil metabolisme sel sendiri. Beberapa
metabolit primer. Penumpukan asam laktat zat yang diduga sebagai metabolit sekunder
dapat mengaktifkan enzim-enzim yang adalah asam-asam lemak rantai pendek
memetabolisir asam laktat lebih lanjut seperti asam asetat, propionat dan butirat
serta beberapa senyawa antibakteri.
4,50
4,03
4,00
3,50 3,40
a 3,16
3,09 3,04 3,02
3,00 b
c
2,50 d d d
e e e
02,00
0 8 16 24 32 40 48
Lama fermentasi (j am)
Gambar 6. Nilai Perubahan pH Minuman Sinbiotik Ekstrak Daun Cincau Hijau yang
Difermentasi selama 0 hingga 48 jam
laktat mudah mengalami disosiasi sehingga cincau hijau yang berupa karbohidrat
menghasilkan H+ dalam jumlah banyak. Pada kompleks menjadi monosakarida, dan
pengukuran pH-meter, ion H+ inilah yang selanjutnya monosakarida tersebut akan
akan terukur. Oleh karena itu, semakin difermentasi menjadi senyawa-senyawa
banyak jumlah asam laktat maka dengan struktur yang lebih sederhana,
+
semakinbesar pula ion H yang terukur, termasuk asam laktat.
sehingga pH semakin rendah. Dari Tabel 1 diketahui bahwa
Penguraian substrat dan senyawa persentase peningkatan total asam tidak
pektin oleh bakteri asam laktat akan sebanding dengan persentase penurunan pH.
menghasilkan energi untuk aktivitas bakteri Pada fermentasi 32, 40, dan 48 jam nilai pH
asam laktat, serta menghasilkan senyawa- produk tidak berbeda nyata, hal ini
senyawa lain termasuk asam laktat. Asam disebabkan oleh kemampuan mikroba untuk
laktat yang dihasilkan oleh Lactobacillus merombak senyawa-senyawa organik sudah
casei tersebut akan tersekresikan keluar sel menurun. Bakteri asam laktat telah
dan akan terakumulasi dalam produk memasuki fase kematian, dengan demikian
fermentasi. Dengan meningkatnya jumlah penurunan pH tidak akan terjadi secara
asam yang disekresikan tersebut, maka signifikan. Penurunan pH tetap terjadi
keasaman produk sinbiotik akan meningkat, sebagai akibat terakumulasinya total asam,
dan peningkatan akumulasi asam ini akan namun sebagian besar bukan lagi berupa
menyebabkan terjadinya penurunan pH asam yang esensial (asam laktat) melainkan
(Misgiyarta dan Widowati, 2003). asam-asam lemah rantai pendek seperti asam
Dalam penelitian ini, laju penurunan asetat, propionat dan butirat yang merupakan
pH berbanding lurus dengan laju peningkatan hasil hidrolisis asam laktat.
total asam. Semakin lama waktu fermentasi Akibat metabolisme sel bakteri asam
maka total asam akan meningkat, maka laktat akan dihasilkan senyawa lain termasuk
derajat keasaman (pH) minuman sinbiotik asam laktat. Asam laktat yang dihasilkan
akan semakin menurun. Penurunan pH ini oleh bakteri asam laktat akan terekskresikan
disebabkan oleh penumpukan asam-asam keluar sel dan akan terakumulasi dalam
organik sebagai hasil dari proses fermentasi. cairan fermentasi. Dengan meningkatnya
Asam organik terbentuk akibat terjadinya jumlah asam yang diekskresikan oleh bakteri
pemecahan polimer pektin menjadi monomer asam laktat karena proses akumulasi asam
yang lebih sederhana oleh bakteri asam dalam substrat, maka akan meningkatkan
laktat. Bakteri asam laktat akan keasaman produk. Peningkatan akumulasi
menghidrolisis serat (pektin) pada ekstrak