9221-9222 Apha

Diterjemahkan dari bahasa Inggris ke bahasa Indonesia - www.onlinedoctranslator.
com
9221MULTIPLE-TUBE TEKNIK FERMENTASI UNTUK ANGGOTA COLIFORM

GROUP*
9221 A. Pendahuluan
Bakteri Coliform telah lama digunakan sebagai indikator atau jika bakteri Jumlah porsi sampel yang dipilih akan diatur oleh
kualitas air berdasarkan premis bahwa, karena organisme ini ada presisi hasil yang diinginkan. Tabel MPN didasarkan pada asumsi
di usus hewan berdarah panas, keberadaannya di air dapat distribusi Poisson (dispersi acak). Namun, jika sampel tidak cukup
menunjukkan bahwa telah terjadi kontaminasi feses baru-baru terguncang sebelum alikuot dihilangkan atau jika bakteri Jumlah
ini. Secara historis, kelompok organisme ini ditentukan oleh porsi sampel yang dipilih akan diatur oleh presisi hasil yang
kemampuannya memfermentasi laktosa, bukan melalui prinsip diinginkan. Tabel MPN didasarkan pada asumsi distribusi Poisson
bakteriologi sistematis, sehingga kelompok tersebut terdiri dari (dispersi acak). Namun, jika sampel tidak cukup terguncang
bakteri dari beberapa genera yang termasuk dalam famili sebelum alikuot dihilangkan atau jika bakteri
Enterobacteriaceae.
Metode yang dijelaskan pada bagian ini menggunakan * Disetujui oleh Komite Metode Standar, 2014.
Kelompok Tugas Gabungan: Ellen B. Braun-Howland (kursi), Jennifer Best, Robert
medium kaldu berbahan dasar laktosa untuk mendeteksi produk J. Blodgett, Laura Boczek, Gil Dichter, Clifford H. Johnson.
akhir metabolik dari fermentasi laktosa. Kehadiran koliform
harus dipastikan dalam media yang mengandung laktosa dan
garam empedu [brilliant green lactose bile (BGLB) broth]. Jadi
ketika teknik fermentasi dalam bagian ini digunakan, koliform
didefinisikan sebagai semua bakteri anaerob fakultatif, Gram-
negatif, tidak membentuk spora, berbentuk batang yang
memfermentasi laktosa dengan produksi gas dan asam dengan
adanya garam empedu di dalamnya. 48 jam pada 35°C.
Uji standar untuk kelompok koliform dapat dilakukan dengan
teknik fermentasi tabung ganda atau prosedur ada-tidak adanya
(melalui fase yang dikonfirmasi dugaan atau uji lengkap)dijelaskan
di sini, teknik filter membran (MF) (Bagian 9222), atau uji
substrat coliform enzimatik (Bagian 9223). Setiap teknik dapat
diterapkan dalam batasan yang ditentukan dan dengan
mempertimbangkan tujuan pemeriksaan. Produksi hasil yang
valid membutuhkan kepatuhan yang ketat terhadap prosedur
kontrol kualitas (QC). Pedoman QC diuraikan dalam Bagian
9020.
Teknik fermentasi dapat digunakan untuk mendeteksi
koliform dalam air minum atau menghitung koliform dalam air
yang dapat diminum dan tidak dapat diminum. Ketika beberapa
tabung digunakan, densitas coliform diperkirakan melalui tabel
angka yang paling mungkin (MPN). Angka ini, dihasilkan
dengan menggunakan rumus probabilitas tertentu, merupakan
perkiraan kerapatan rata-rata coliform dalam sampel. Hasil
pengujian Coliform, bersama dengan informasi lain yang
diperoleh dari survei teknik atau sanitasi, memberikan penilaian
terbaik tentang efektivitas pengolahan air dan kualitas sanitasi
sumber air. Ketepatan uji fermentasi dalam memperkirakan
densitas coliform bergantung pada jumlah tabung yang
digunakan. Informasi yang paling memuaskan akan diperoleh
bila inokulum sampel terbesar yang diperiksa menunjukkan
asam dan/atau gas di beberapa atau semua tabung dan sampel
inokulum terkecil tidak menunjukkan asam atau gas di salah
satu atau sebagian besar tabung. Kepadatan bakteri dapat
diperkirakan dengan rumus yang diberikan atau dari tabel
dengan menggunakan jumlah tabung positif dalam beberapa
pengenceran (9221C.2). Jumlah porsi sampel yang dipilih akan
diatur oleh presisi hasil yang diinginkan. Tabel MPN didasarkan
pada asumsi distribusi Poisson (dispersi acak). Namun, jika
sampel tidak cukup terguncang sebelum alikuot dihilangkan
https://doi.org/10.2105/SMWW.2882.192 1
sel menggumpal, nilai MPN akan terlalu rendah dari
kepadatan bakteri yang sebenarnya.
1. Air Minum-Kualitas Air
Saat menganalisis minumair untuk menentukan apakah

kualitasnya memenuhi
Standar Badan Perlindungan Lingkungan AS (EPA), 100
mLsampel harus dianalisis; gunakan teknik fermentasi dengan
10 tabung ulangan masing-masing berisi 10 mL, 5 tabung
ulangan masing-masing berisi 20 mL, atau satu botol berisi
porsi sampel 100 mL. Saat memeriksa air minum melalui
teknik fermentasi, proses semua tabung atau botol yang
menunjukkan pertumbuhan—dengan atau tanpa reaksi asam
atau gas positif—melalui fase yang dikonfirmasi (9221B.4).
Sampel air minum yang positif untuk koliform total juga
harus diuji untuk koliform termotoleran (tinja) (9221E) atau
Escherichia coli (9221F).
Untuk pemeriksaan rutin pasokan air publik, tujuan uji total
coliform adalah untuk menentukan efisiensi operasi instalasi
pengolahan dan integritas sistem distribusi. Tes ini juga
digunakan untuk menyaring keberadaan kontaminasi tinja.
Beberapa kejadian koliform dalam sistem distribusi dapat
dikaitkan dengan pertumbuhan atau kelangsungan hidup
koliform dalam biofilm bakteri pada saluran utama daripada
kegagalan pengolahan pada sumber tanaman atau sumur, atau
kontaminasi dari luar sistem distribusi. Karena sulit untuk
membedakan koliform yang masuk ke sistem distribusi dan
koliform yang sudah ada dalam biofilm pipa dan sedimen,
asumsikan bahwa semua koliform berasal dari sumber di luar
sistem distribusi.
2. Kualitas Air Selain Air Minum
Saat menganalisis air yang tidak dapat diminum,

inokulasikan serangkaian tabung dengan pengenceran desimal
air yang sesuai (kelipatan 10 mL) berdasarkan kepadatan
coliform yang mungkin. Gunakan fase yang dikonfirmasi
dugaan dari prosedur multi-tabung. Gunakan tes lengkap yang
lebih padat karya (9221B.5) sebagai ukuran QC pada 10%
(atau persentase yang ditetapkan) sampel air yang tidak dapat
diminum positif coliform setiap tiga bulan. Secara umum,
tujuan menganalisis air yang tidak dapat diminum adalah
untuk memperkirakan kepadatan bakteri, menentukan sumber
pencemaran, menerapkan standar kualitas air, atau melacak
kelangsungan hidup mikroorganisme. Teknik fermentasi
beberapa tabung dapat digunakan untuk mendapatkan
perkiraan kepadatan coliform MPN yang valid secara statistik.
Periksa sampel air dalam jumlah yang cukup untuk
menghasilkan hasil yang representatif untuk stasiun
pengambilan sampel. Umumnya,
3. Sampel Lainnya
Teknik fermentasi beberapa tabung berlaku untuk analisis

air asin atau payau, serta lumpur, sedimen, dan lumpur.
Kumpulkan sampel seperti yang diarahkan pada Bagian
9060A, menggunakan wadah sampel yang ditentukan pada
Bagian 9030B.19. Ikuti
https://doi.org/10.2105/SMWW.2882.192 2
TEKNIK FERMENTASI MULTIPLE-TUBE (9221)/Teknik Fermentasi Koliform Total Standar
tindakan pencegahan yang diberikan di atas pada ukuran porsi tabung blender steril, tambahkan 270 mL buffer fosfat steril atau
dan jumlah tabung per pengenceran. 0,1%air pengenceran pepton, dan haluskan selama 1 hingga 2
Untuk menyiapkan sampel padat atau semipadat, timbang menit dengan kecepatan tinggi (8000 rpm). Persiapkan
sampel dan tambahkanpengencer untuk membuat pengenceran pengenceran desimal yang sesuai dari bubur homogen secepat
10-1. Misalnya, masukkan 30 g sampel mungkin untuk meminimalkan pengendapan.
9221 B. Teknik Fermentasi Koliform Total Standar
1. Sampel triptosa. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20,0g

Laktosa. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5,0 g
9060A, menggunakan wadah sampel yang ditentukan pada
Bagian 9030B.19. Ikuti panduan QC untuk botol sampel yang
dijelaskan di Bagian 9020B.5d. Pastikan bahwa sampel
memenuhi kriteria penerimaan laboratorium pada saat diterima.
2. Kontrol kualitas
Semua fase teknik fermentasi (9221B–G) memerlukan

kepatuhan terhadap pedoman jaminan kualitas/kontrol kualitas
(QA/QC) yang disajikan dalam Bagian 9020, termasuk, namun
tidak terbatas pada, QC analitik (Bagian 9020B.9),
instrumentasi /peralatan (Bagian 9020B.4 dan 9030B), dan
perlengkapan (Bagian 9020B.5). Lihat Tabel 9020:I untuk
prosedur QC utama. Juga, perhatikan bagian yang berkaitan
dengan penyimpanan dan persiapan yang tepat dari media kultur
dehidrasi dan kualitas air (Bagian 9050 dan 9020B.5f).
Gunakan media dehidrasi komersial bila memungkinkan, dan
pastikan formulasinya sesuai dengan yang ditentukan di sini
karena formulasi komersial mungkin berbeda. Media fermentasi
yang sudah disiapkan dapat disimpan dalam tabung atau botol
yang tertutup rapat hingga 3 bulan di tempat gelap, jika suhu
antara 1 dan 30°C dan penguapan kurang dari 10% dari volume
aslinya. Jika tabung didinginkan setelah sterilisasi, tabung harus
diinkubasi semalaman pada suhu kamar (20°C) sebelum
digunakan dan yang menunjukkan pertumbuhan atau gelembung
harus dibuang untuk menghindari hasil positif palsu. Untuk
menunjukkan kinerja medium yang dapat diterima, kontrol
biakan positif dan negatif harus diuji sebelum penggunaan
pertama dan sebagaimana ditentukan (lihat Tabel 9020:VI).
Sterilitas, volume per tabung, dan pH juga harus diverifikasi dan
dicatat.
Jika laboratorium beralih ke teknik fermentasi tabung ganda,
analis idealnya pertama-tama harus melakukan uji paralel
dengan metode sebelumnya untuk menunjukkan penerapan dan
keterbandingan. Hasil dari banyak studi kinerja coliform
tersedia dalam literatur, dan tingkat positif palsu dan
-Hasil negatif dapat berbeda di antara berbagai media. Pengguna
harus hati-hati memilih media dan prosedur yang paling sesuai
dengan kebutuhan mereka.
3. Fase Dugaan
Gunakan kaldu lauril triptosa dalam fase uji beberapa tabung

ini, mengikuti pedoman QC yang dikutip dalam 9221B.2.
a. Reagen dan media biakan:
Kaldu Lauryl triptosa:
https://doi.org/10.2105/ 3
TMAMPU9221:I. PREPARASI DARILAURYLTRYPTOSBROTH
Jumlah Volume Diperlukan Kaldu
Media Media + Lauryl Tryptosa
Inokulum dalam Inokulum Dehidrasi
Tabung
ml ml ml g/L
1 10 atau 11 atau 35.6
lebih lebih
10 10 20 71.2
10 20 30 53.4
20 10 30 106.8
100 50 150 106.8
100 35 135 137.1
100 20 120 213.6
Dipotasium hidrogen fosfat (K2HPO4)2.75........................... G

Kalium dihidrogen fosfat (KH2PO4)2.75.............................. G
Natrium klorida (NaCl). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5,0 g
Natrium lauril sulfat. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,1 g
Air tingkat reagen. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1L
Tambahkan bahan kering ke dalam air, aduk rata, dan

panaskan hingga larut. Sebelum sterilisasi, masukkan media
secukupnya ke dalam tabung fermentasi yang berisi vial terbalik
(juga dikenal sebagai tabung Durham)untuk menutupi botol
terbalik setidaknya setengah sampai dua pertiga setelah
sterilisasi. Sebagai alternatif, hilangkan vial terbalik dan
tambahkan 0,01 g/L bromocresol purple ke dalam kaldu lauril
triptosa (untuk menentukan produksi asam, indikator hasil
positif pada bagian uji coliform ini). Tutup tabung dengan
tutup logam atau plastik tahan panas. Persiapkan sesuai
dengan Tabel 9221:I, membuat kaldu lauril triptosa cukup
pekat sehingga penambahan 100-, 20-, atau 10-mL porsi
sampel ke media tidak akan mengurangi konsentrasi bahan di
bawah konsentrasi media standar. Autoklaf
media pada 121 ° C selama 12 hingga 15 menit. Pastikan vial
terbalik, jika digunakan, bebas dari gelembung udara. PH
medium harus 6,8 ± 0,2 setelah sterilisasi.
b. Prosedur:
1) Atur tabung fermentasi dalam barisan masing-masing
lima atau sepuluh tabung di rak tabung reaksi. Jumlah baris
dan volume sampel yang dipilih bergantung pada kualitas dan
karakter air yang akan diperiksa. Untuk air minum, 100 mL
harus diuji. Gunakan lima porsi 20 mL, sepuluh porsi 10 mL,
atau satu porsi 100 mL (satu botol). Untuk air yang tidak
dapat diminum, gunakan lima tabung per pengenceran (10, 1,
0,1 mL, dll.).
Saat membuat pengenceran dan mengukur volume sampel
yang diencerkan, ikuti tindakan pencegahan yang diberikan di
Bagian 9215B.2. Gunakan Gambar 9215:1 sebagai panduan
untuk menyiapkan pengenceran. Kocok sampel dan
pengenceran dengan kuat selama 5 detik (sekitar 25 kali).
Inokulasikan setiap tabung dalam satu set lima dengan
replikasi volume sampel dalam pengenceran desimal yang
meningkat, jika jumlah sampel desimal digunakan. Campur
bagian uji dalam media dengan agitasi lembut.
2) Segera inkubasikan tabung atau botol yang telah

diinokulasi, kultur kontrol, dan/atau blanko sterilitas pada suhu ke dalam lebih dari satu media, inokulasikan media yang paling
35 ± 0,5°C. Setelah 24 ± 2 jam, putar setiap tabung atau botol menghambat (kaldu BGLB) terakhir.
dengan hati-hati dan periksa pertumbuhan, gas, dan/atau reaksi Segera inkubasi tabung kaldu BGLB yang telah diinokulasi pada
asam (bayangan warna kuning) dan, jika tidak ada gas atau suhu 35 ± 0,5°C. Setiap jumlah gas yang terbentuk dalam vial
terbalik dari tabung fermentasi kaldu BGLB setiap saat dalam
reaksi asam yang terlihat, inkubasi ulang dan periksa kembali waktu 48 ± 3 jam merupakan fase konfirmasi positif. Untuk
pada akhir 48 ± 3 jam. Catat ada tidaknya pertumbuhan, gas, memperkirakan coliform
dan/atau produksi asam. Jika vial bagian dalam dihilangkan, densitas, hitung nilai MPN dari jumlah tabung BGLB positif
pertumbuhan dengan keasaman (warna kuning) menandakan
reaksi dugaan-positif. seperti yang dijelaskan dalam 9221C.
c. Penafsiran:Deteksi reaksi asam (warna kuning) dan/atau c. Prosedur alternatif:Gunakan alternatif ini hanya untuk air
gas dalam tabung atau botol dalam waktu 48 ± 3 jam merupakan tercemar atau air limbah yang diketahui memberikan hasil
dugaan reaksi positif. Serahkan tabung atau botol dengan reaksi positif secara konsisten.
dugaan-positif ke fase yang dikonfirmasi (9221B.4). Jika semua tabung diduga positif dalam dua atau lebih
Tidak adanya reaksi asam dan/atau pembentukan gas pada pengenceran berturut-turut dalam waktu 24 jam, maka hanya
akhir 48 ± 3 jam inkubasi merupakan uji negatif. Kirim sampel serahkan tabung dengan pengenceran tertinggi (inokulum
air minum yang menunjukkan pertumbuhan tanpa gas positif sampel terkecil) ke fase terkonfirmasi yang semua tabungnya
atau reaksi asam ke fase yang dikonfirmasi (9221B.4). positif, bersama dengan tabung positif lainnya dengan
pengenceran yang lebih tinggi. pengenceran. Kirim ke fase yang
dikonfirmasi semua tabung di mana pertumbuhan gas atau asam
4. Fase Konfirmasi diproduksi dalam 24 hingga 48 jam.
a. Media budaya:Gunakan tabung fermentasi kaldu BGLB
untuk fase yang dikonfirmasi, mengikuti pedoman QC yang 5. Fase Selesai
dikutip dalam 9221B.2.
Kaldu empedu laktosa hijau cemerlang: Uji lengkap seperti yang dijelaskan di sini tidak diperlukan
untuk analisis sampel kepatuhan air minum. Untuk sampel air
Pepton . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .10.0g yang tidak dapat diminum yang dikumpulkan berdasarkan
Laktosa. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .10.0g Undang-Undang Air Bersih, persyaratan bahwa 10% dari semua
Oxgall. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .20.0g tabung total-coliform-positif harus menjalani pengujian lengkap
Cemerlanghijau0.0133....................................................... G berdasarkan musim tidak ada lagi. Tes yang telah selesai
Air tingkat reagen. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1L disertakan di sini sebagai rekomendasi QC dan untuk digunakan
Tambahkan bahan kering ke dalam air, aduk rata, dan saat hasil pengujian tidak pasti. Karena pengujian tambahan
panaskan hingga larut. Sebelum sterilisasi, masukkan media ke untuk coliform termotoleran (tinja) dan/atau E. coli diperlukan
dalam tabung fermentasi dengan vial terbalik, pastikan volume untuk uji coliform positif, pengujian lebih lanjut menggunakan
media yang cukup untuk menutupi vial terbalik setidaknya kaldu EC dan/atau EC-MUG dianggap sebagai pengujian
setengah hingga dua pertiga setelah sterilisasi. Tutup tabung lengkap. Untuk tujuan QC, jika tidak ada sampel air minum
dengan tutup logam atau plastik tahan panas. Media autoklaf positif yang diterima dalam seperempat, analisis setidaknya satu
pada 121 ° C selama 12 hingga 15 menit. Pastikan vial terbalik sampel air sumber positif untuk mengonfirmasi bahwa media
bebas dari gelembung udara. pH sedang seharusnya merespons dengan tepat.
7,2 ± 0,2 setelah sterilisasi. Untuk memverifikasi keberadaan bakteri koliform dan
b. Prosedur:Segera serahkan semua tabung dugaan atau bot- menyediakan data QC untuk analisis sampel air yang tidak dapat
file yang menunjukkan pertumbuhan, sejumlah gas, atau reaksi diminum, gunakan tes yang telah selesai pada setidaknya satu
asam dalam 24 ± 2 jam inkubasi ke fase yang dikonfirmasi. Jika sampel positif per kuartal. Jika tidak ada sampel positif yang
tabung atau botol dugaan tambahan menunjukkan fermentasi muncul dalam seperempat, lakukan pemeriksaan QC
aktif atau reaksi asam pada akhir masa inkubasi 48 ± 3 jam, menggunakan sampel positif yang diketahui. Analis dapat
segera kirimkan ke fase konfirmasi. Untuk mengkonfirmasi pra- secara bersamaan menginokulasi media dugaan-positif ke dalam
Koloni sumptive coliform yang tumbuh pada media padat kaldu BGLB untuk konfirmasi koliform total dan kaldu EC
menggunakan media fermentasi, lihat Bagian 9222B.4g. untuk koliform termotoleran (tinja) (9221E) atau kaldu EC
Goyangkan atau putar perlahan tabung atau botol dugaan MUG untuk Escherichia coli (9221F) selama kaldu BGLB
yang menunjukkan pertumbuhan gas atau asam untuk diinokulasi terakhir. Hasil positif dari inkubasi dalam kaldu EC
meresuspensi organisme. Dengan loop steril berdiameter 3,0 dan/atau EC-MUG pada peningkatan
hingga 3,5 mm, pindahkan satu atau lebih kultur ke dalam suhu (44,5 ± 0,2°C) dapat dianggap sebagai pengujian yang
tabung fermentasi yang berisi kaldu BGLB. Sebagai alternatif, lengkap. Kultur kaldu BGLB positif paralel dengan kultur kaldu
masukkan setidaknya aplikator kayu yang steril EC atau EC-MUG negatif menunjukkan adanya coli nonfecal.
2,5 cm ke dalam biakan, segera angkat, dan masukkan aplikator formulir. Tabung EC atau EC-MUG positif paralel dan biakan
ke dasar tabung fermentasi yang berisi kaldu BGLB. Hapus dan kaldu BGLB negatif masing-masing menunjukkan adanya
buang aplikator. Ulangi untuk semua tabung dugaan-positif coliform termotoleran (tinja) atau E. coli. Sebagai alternatif, uji
lainnya. Analis dapat secara bersamaan menginokulasi kaldu lengkap untuk total coliform positif dapat dilakukan sebagai
BGLB untuk koliform total dan kaldu EC untuk koliform berikut.
termotoleran (fekal) (lihat 9221E) atau kaldu EC-MUG untuk a. Media biakan dan reagen:Ikuti pedoman QC yang dikutip
Escherichia coli (lihat 9221F). Namun, jika menggunakan loop dalam 9221B.2.
yang sama atau tongkat aplikator kayu untuk menginokulasi 1) Agar-agar LES Endo—Lihat Bagian 9222B.2a. Gunakan
biakan 100- ×
Pelat Petri 15 mm.
2) Agar-agar MacConkey:
Pepton . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .17g
Pepton proteosa. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .3g
Laktosa. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .10g
Garam empedu. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1,5g d) coret pelat untuk isolasi dengan bagian jarum yang
Natrium klorida (NaCl). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .5 melengkung bersentuhan dengan agar-agar untuk
menghindari permukaan yang tergores atau sobek. Nyalakan
GAgar . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .13.5 loop antara kuadran kedua dan ketiga untuk meningkatkan
isolasi koloni.
G Piring inkubasi, terbalik, pada 35 ± 0,5 ° C selama 24 ± 2 jam.
Merah netral. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,03 g
Kristalungu0.001.................................................................. G
Air tingkat reagen. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1L
Tambahkan bahan ke dalam air, aduk rata, dan panaskan

hingga mendidih agar larut. Sterilkan dengan autoklaf selama 15
menit pada suhu 121°C. Temper agar setelah sterilisasi dan
tuangkan ke cawan Petri (100 × 15 mm).
PH medium harus 7,1 ± 0,2 setelah sterilisasi.
3) Agar nutrisi:
Pepton5.0................................................................................. G
Daging sapiekstrak3.0.............................................................. G
Agar15.0................................................................................ G
Air tingkat reagen. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 L
Tambahkan bahan ke dalam air, aduk rata, dan panaskan

untuk melarutkannya. Sebelum sterilisasi, masukkan ke dalam
tabung bertutup ulir. Autoklaf pada suhu 121°C selama 15
menit. PH medium harus 6,8 ± 0,2 setelah sterilisasi. Setelah
sterilisasi, segera letakkan tabung dalam posisi miring agar
agar-agar memadat dengan miring
permukaan. Kencangkan tutup sekrup setelah didinginkan dan
simpan di tempat penyimpanan yang sejuk dan terlindung.
4) Reagen pewarna gram—Reagen tersedia secara komersial
sebagai larutan siap pakai.
a) Amonium oksalat-kristal violet (Hucker's)—Larutkan 2 g
kristal violet (kadar pewarna 90%) dalam 20 mL etil alkohol
95%. CAUTION: Mudah terbakar.Larutkan 0,8 g (NH4)2C2O4
· H2O dalam 80 mL air tingkat reagen. Campur kedua larutan
dan umurkan selama 24 jam sebelum digunakan. Saring melalui
kertas ke dalam botol pewarnaan.
b) Solusi Lugol, modifikasi Gram—Giling 1 g kristal yodium
dan 2 g KI dalam mortar. Tambahkan air tingkat reagen,
beberapa mililiter sekaligus, dan haluskan secara menyeluruh
setelah setiap penambahan sampai larutan selesai. Bilas larutan
ke dalam botol kaca amber dengan sisa air, gunakan total 300
mL.
c) Counterstain—Larutkan 2,5 g pewarna safranin dalam 100
mL etil alkohol 95%. Tambahkan 10 mL ke dalam 100 mL air
tingkat reagen. CAUTION: Mudah terbakar.
d) Alkohol aseton—Campurkan etil alkohol dengan volume
yang sama (95%) dengan aseton. CAUTION: Mudah terbakar.
b. Prosedur:
1) Dengan menggunakan teknik aseptik, goreskan satu agar
LES Endo (Bagian 9222B.2a) atau lempeng agar MacConkey
dari masing-masing tabung kaldu BGLB yang diduga positif
sesegera mungkin setelah gas terlihat. Coret pelat sedemikian
rupa untuk memastikan adanya beberapa koloni terpisah yang
dipisahkan paling sedikit 0,5 cm. Untuk memperoleh proporsi
keberhasilan isolasi yang tinggi jika terdapat organisme
koliform, gunakan pendekatan berikut:
a) Gunakan loop steril berdiameter 3 mm atau jarum
inokulasi yang sedikit melengkung di ujungnya;
b) ketuk dan miringkan tabung fermentasi untuk menghindari
terangkatnya selaput atau buih pada jarum;
c) masukkan ujung loop atau jarum ke dalam cairan di dalam
tabung hingga kedalaman kurang lebih 0,5 cm; Dan
2) Koloni yang berkembang pada agar LES Endo Gram; Tek. Banteng. No. 128. Stasiun Percobaan Pertanian Negara
didefinisikan sebagai koloni khas (merah muda hingga merah Bagian NY, Jenewa, NY
tua dengan permukaan hijau kemilau metalik) atau atipikal COWLES, PB 1939. Tabung fermentasi yang dimodifikasi. J.Bakteriol.
(koloni merah muda, merah, putih, atau tidak berwarna tanpa 38:677. SKERMAN, VBD 1967. Panduan Identifikasi Genera
Bakteri. Williams & Wilkins, Baltimore, Md.
kemilau) setelah inkubasi 24 jam. Koloni fermentasi laktosa
khas yang berkembang pada agar MacConkey berwarna
merah dan mungkin dikelilingi oleh zona buram empedu yang
diendapkan. Dari setiap cawan, pilih satu atau lebih koloni
koliform yang khas dan terisolasi dengan baik atau, jika tidak
ada koloni yang khas, pilih dua atau lebih koloni yang
dianggap paling mungkin koliform. Transfer pertumbuhan
dari masing-masing isolat ke tabung fermentasi kaldu triptosa
lauril berkekuatan tunggal dan ke agar miring nutrisi.
Jika diperlukan, gunakan alat pembesar koloni untuk
menghasilkan perbesaran optimal saat koloni diambil dari
cawan agar LES Endo atau MacConkey. Saat memindahkan
koloni, pilih yang terisolasi dengan baik dan hampir tidak
menyentuh permukaan koloni dengan jarum transfer
berpendingin udara yang disterilkan dengan api untuk
meminimalkan bahaya pemindahan kultur campuran.
Inkubasi tabung kaldu sekunder (kaldu lauril triptosa
dengan vial fermentasi terbalik) pada suhu 35 ± 0,5°C selama
24 ± 2 jam; jika gas tidak dihasilkan dalam 24 ± 2 jam,
inkubasi kembali dan periksa kembali pada 48 ± 3 jam.
Periksa secara mikroskopis preparat yang diwarnai Gram dari
biakan miring agar nutrien 24 jam yang sesuai dengan
tabung sekunder yang menunjukkan gas.
3) Teknik pewarnaan Gram—Pewarnaan Gram dapat
dihilangkan dari uji lengkap untuk sampel air minum hanya
karena bakteri Gram-positif dan organisme pembentuk spora
dalam air minum jarang bertahan dalam prosedur penyaringan
selektif ini.
Berbagai modifikasi teknik pewarnaan Gram ada. Gunakan
modifikasi Hucker (sebagai berikut) untuk apusan kultur
murni; termasuk kultur Gram-positif dan Gram-negatif
sebagai kontrol.
Pada satu slide, siapkan emulsi cahaya terpisah dari
pertumbuhan bakteri uji dan kultur kontrol positif dan negatif
menggunakan tetesan air suling pada slide. Keringkan di
udara, fiksasi dengan melewatkan slide melalui nyala api, dan
warnai selama 1 menit dengan larutan amonium oksalat-
kristal violet. Bilas slide dengan air keran dan tiriskan
kelebihannya; oleskan larutan Lugol selama 1 menit.
Bilas slide bernoda dalam air keran. Dekolorisasi selama
kurang lebih 15 sampai 30 detik dengan alkohol aseton
dengan memegang preparat di antara jari-jari dan membiarkan
alkohol aseton mengalir melintasi apusan yang diwarnai
sampai pelarut mengalir tanpa warna dari preparat. Jangan
menghilangkan warna secara berlebihan. Counterstain dengan
safranin selama 15 detik, bilas dengan air ledeng, keringkan
dengan kertas penyerap atau udara kering, dan periksa secara
mikroskopis. Organisme gram positif berwarna biru;
Organisme gram negatif berwarna merah. Hasil dapat diterima
hanya ketika kontrol telah memberikan reaksi yang tepat.
c. Penafsiran:Pembentukan gas dalam tabung sekunder
kaldu triptosa lauril dalam waktu 48 ± 3 jam dan demonstrasi
bakteri Gram-negatif, pembentuk nonspora, berbentuk batang
dari kultur agar merupakan hasil positif untuk tes lengkap,
menunjukkan bahwa anggota dari adanya gugus coliform.
6. Bibliografi
HUCKER, GJ & HJ CONN. 1927. Studi Lanjutan Metode Pewarnaan
TEKNIK FERMENTASI MULTIPLE-TUBE (9221)/Pendugaan Kepadatan Bakteri
eVANS, TM, CEWAARVICK, RJ SEIDLER& MWLeCLEBIH HEVALLIER.

GARRITAS, GM, red. 2005. Bagian B: Gammaproteobacteria. Dalam
1981. Kegagalan teknik angka yang paling mungkin untuk
Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, edisi ke-2; Volume
mendeteksi koliform dalam air minum dan persediaan air baku.
2: Proteobakteri. Springer, New York, NY
Aplikasi Mengepung. Mikrobiol. 41:130.
GERHARDS, P., ed. 1981. Manual Metode Bakteriologi Umum. MENGGUNAKANLINGKUNGANPROTEKSIAGENSI. 2005. Pedoman
Soc Amerika. Mikrobiologi, Washington, DC Sertifikasi Laboratorium Analisis Air Minum; EPA 815-R-05-004.
SEIDLER, RJ, TMEVANS, JR KAUFMAN, CE WAARVICK& MW Mati. Tek Air Tanah dan Air Minum. Rtk Dukungan, Cincinnati,
LeCLEBIH HEVALLIER. 1981. Keterbatasan teknik enumerasi coliform Ohio.
standar. J.Amer. Asosiasi Pekerjaan Air. 73:538. MENGGUNAKANLINGKUNGANPROTEKSIAGENSI. 2012. Pedoman
MENGGUNAKANLINGKUNGANPROTEKSIAGENSI. 2000. Peraturan air Penyusunan Tata Cara Uji Analisis Bahan Pencemar Berdasarkan
minum primer nasional. 40 CFR Bagian 141, dan 142; Diberi UU Air Bersih; Prosedur Analisis dan Pengambilan Sampel:
makan. Reg. 65(8):1950. Aturan Akhir. 40 CFR Bagian 136, 260, dkk.; Diberi makan. Reg.
77(97):29797.
9221 C. Pendugaan Kepadatan Bakteri
1. Ketepatan Uji Fermentasi Tabung Berganda

pengenceran tertinggi (volume sampel terkecil) jika memiliki
semua tabung negatif dan setidaknya satu pengenceran tersisa
Uji fermentasi tabung ganda tidak terlalu tepat kecuali banyak
memiliki tabung negatif. Selanjutnya, keluarkan pengenceran
bagian sampel diperiksa, jadi berhati-hatilah saat
terendah (volume sampel terbesar) jika memiliki semua tabung
menginterpretasikan signifikansi sanitasi dari setiap hasil
positif dan setidaknya satu pengenceran tersisa memiliki tabung
koliform tunggal. Presisi meningkat pesat ketika beberapa
positif. Menurut pedoman ini, tiga pengenceran dalam Contoh A
sampel dari titik pengambilan sampel tertentu diperkirakan
dipilih dengan menghilangkan pengenceran tertinggi (0,001-
secara terpisah dan rata-rata geometrisnya dihitung.
mL) dan pengenceran terendah (10-mL).
Meskipun tabel dan perhitungan sebagian besar kemungkinan
Jika pengenceran terendah tidak memiliki semua tabung
(MPN) dijelaskan untuk digunakan dalam uji coliform, mereka
positif, dan beberapa pengenceran tertinggi memiliki semua
juga dapat digunakan untuk menentukan MPN dari setiap
tabung negatif, maka keluarkan pengenceran negatif tertinggi
organisme selama media uji yang sesuai tersedia. Kalkulator
(Contoh B).
MPN online tersedia, tetapi hingga keakuratan kalkulator
diverifikasi, konfirmasikan hasilnya menggunakan tabel MPN TMAMPU9221:II. MPN INDEX DAN95% CKEPERCAYAANLIMIT
di bagian ini. UNTUKAIICOMBINASI DARIPPOSITIF DANNEGATIVERHASILWINDUK
AYAMFAKU20-MLPORSIAULANGASSED
Batas
2. Penggunaan Tabel untuk Menentukan MPN Jumlah Tabung yang
Keyakinan 95%
Memberikan Reaksi Indeks
(Tepat)
Positif dari 5 MPN/
Catat konsentrasi coliform sebagai MPN/100 mL. MPN (Masing-masing 20 100 mL BawahAtas
mL)
nilai untuk berbagai kombinasi tabung positif dan 0 <1.1–3.5
negatifdiberikan dalam Tabel 9221:II, III, dan IV. Volume 11.10.0515.4
sampel yang ditunjukkan pada Tabel 9221:II dan III dipilih 22.60.408.4
secara khusus untuk pemeriksaan air minum. Tabel 9221: IV 3 4.6 1.0 13
4 8.0 2.1 23
mengilustrasikan nilai MPN untuk kombinasi hasil positif dan
negatif ketika lima volume 10 mL, lima 1,0 mL, dan lima porsi
5 >8.0 3.4 –
sampel 0,1 mL dari air yang tidak dapat diminum diuji. Jika
volume bagian sampel yang diuji identik dengan yang
ditemukan dalam tabel, maka laporkan nilai yang sesuai dengan TMAMPU9221:III. MPN INDEX DAN95% CKEPERCAYAANLIMIT
UNTUKAIICOMBINASI DARIPPOSITIF DANNEGATIVERHASILWINDUK
kombinasi hasil positif dan negatif yang sesuai sebagai
AYAMTEN10-MLPORSIAULANGASSED
MPN/100 mL. Namun, jika deret pengenceran desimal berbeda,
maka pilih nilai MPN pada Tabel 9221:IV yang sesuai dengan
kombinasi hasil positif dan hitung MPN aktual menggunakan Batas Keyakinan
Jumlah Tabung
rumus berikut: 95% (Tepat)
Memberikan Reaksi Indeks
Positif Keluar MPN/
MPN/100 mL = (Tabel MPN/100 mL) × 10/V
Jika deret desimal1 mencakup lebih dari tiga
Di mana: pengenceran, gunakan pedoman berikut untuk memilih
tiga pengenceran yang paling tepat, lalu gunakan Tabel
V= volume bagian sampel pada pengenceran 9221:IV dan persamaan di atas untuk menghitung MPN.
terpilih terendah. Lihat Tabel 9221:V, yang memberikan beberapa contoh
(A–G) kombinasi positif. Pertama, hapus
dari 10 (Masing- 100 mL Lebih Atas
masing Kepadatan
TEKNIK FERMENTASI MULTIPLE-TUBE (9221)/Pendugaan 10 mL) Bakteri rendah
0 <1.1 – 3.4
1 1.1 0,051 5.9
2 2.2 0,37 8.2
3 3.6 0,91 9.7
4 5.1 1.6 13
5 6.9 2.5 15
6 9.2 3.3 19
7 12 4.8 24
8 16 5.8 34
10 >2313–
TMAMPU9221:IV. MPN INDEX DAN95% CKEPERCAYAANLIMIT UNTUKVARIOUSCOMBINASI DARIPPOSITIFRHASILWINDUK AYAMFAKUTUBESAULANGASSED

PERDILUSI(10ML, 1.0ML, 0,1ML)*
Kepercayaa Kepercayaan
n diriBatas diriBatas
Kombinasi dari Kombinasi dari
Positif MPN Indeks/ ml RendahTinggi Positif MPN Indeks/100 mL Rendah Tinggi
100
0-0-0 <1,8 — 6.8 4-0-3 25 9.8 70
0-0-1 1.8 0,090 6.8 4-1-0 17 6.0 40
0-1-0 1.8 0,090 6.9 4-1-1 21 6.8 42
0-1-1 3.6 0,70 10 4-1-2 26 9.8 70
0-2-0 3.7 0,70 10 4-1-3 31 10 70
0-2-1 5.5 1.8 15 4-2-0 22 6.8 50
0-3-0 5.6 1.8 15 4-2-1 26 9.8 70
1-0-0 2.0 0,10 10 4-2-2 32 10 70
1-0-1 4.0 0,70 10 4-2-3 38 14 100
1-0-2 6.0 1.8 15 4-3-0 27 9.9 70
1-1-0 4.0 0,71 12 4-3-1 33 10 70
1-1-1 6.1 1.8 15 4-3-2 39 14 100
1-1-2 8.1 3.4 22 4-4-0 34 14 100
1-2-0 6.1 1.8 15 4-4-1 40 14 100
1-2-1 8.2 3.4 22 4-4-2 47 15 120
1-3-0 8.3 3.4 22 4-5-0 41 14 100
1-3-1 10 3.5 22 4-5-1 48 15 120
1-4-0 11 3.5 22 5-0-0 23 6.8 70
2-0-0 4.5 0,79 15 5-0-1 31 10 70
2-0-1 6.8 1.8 15 5-0-2 43 14 100
2-0-2 9.1 3.4 22 5-0-3 58 22 150
2-1-0 6.8 1.8 17 5-1-0 33 10 100
2-1-1 9.2 3.4 22 5-1-1 46 14 120
2-1-2 12 4.1 26 5-1-2 63 22 150
2-2-0 9.3 3.4 22 5-1-3 84 34 220
2-2-1 12 4.1 26 5-2-0 49 15 150
2-2-2 14 5.9 36 5-2-1 70 22 170
2-3-0 12 4.1 26 5-2-2 94 34 230
2-3-1 14 5.9 36 5-2-3 120 36 250
2-4-0 15 5.9 36 5-2-4 150 58 400
3-0-0 7.8 2.1 22 5-3-0 79 22 220
3-0-1 11 3.5 23 5-3-1 110 34 250
3-0-2 13 5.6 35 5-3-2 140 52 400
3-1-0 11 3.5 26 5-3-3 170 70 400
3-1-1 14 5.6 36 5-3-4 210 70 400
3-1-2 17 6.0 36 5-4-0 130 36 400
3-2-0 14 5.7 36 5-4-1 170 58 400
3-2-1 17 6.8 40 5-4-2 220 70 440
3-2-2 20 6.8 40 5-4-3 280 100 710
3-3-0 17 6.8 40 5-4-4 350 100 710
3-3-1 21 6.8 40 5-4-5 430 150 1100
3-3-2 24 9.8 70 5-5-0 240 70 710
3-4-0 21 6.8 40 5-5-1 350 100 1100
3-4-1 24 9.8 70 5-5-2 540 150 1700
3-5-0 25 9.8 70 5-5-3 920 220 2600
4-0-0 13 4.1 35 5-5-4 1600 400 4600
4-0-1 17 5.9 36 5-5-5 >160 700 —
0
4-0-2 21 6.8 40
* Hasil ke dua angka penting.
Lebih dari tiga pengenceran dapat tersisa setelah penghilangan tertinggi dengan setiap tabung positif dan dua pengenceran yang
pengenceran terendah dengan semua tabung positif lebih rendah. Dalam Contoh C, pengenceran tertinggi
danpengenceran tinggi dengan semua tabung negatif. Dalam hal
ini, jika pengenceran tertinggi dengan semua tabung positif
berada dalam dua pengenceran dari pengenceran tertinggi
dengan setiap tabung positif, maka gunakan pengenceran
dengan semua tabung positif adalah 0,1 mL, yang berada dalam
dua pengenceran
0,001 mL, yang memiliki satu tabung positif. Dalam Contoh
D, pengenceran tertinggi dengan semua tabung positif adalah
0,01 mL, yang berada dalam dua pengenceran desimal 0,001
mL, untuk menghasilkan kombinasi 4-5-1.
Jika, setelah mengeluarkan pengenceran terendah dengan
semua tabung positif, tidakpengenceran dengan semua reaksi
positif tetap, lalu pilih yang terendah
TMAMPU9221:V. eCONTOH UNTUKCHOICE OFTHREECOMBINASI DARIPPOSITIF DARIFAKUDILUSI

Volume
ml
Kombinasi dari Indeks MPN
Contoh 10 1 0,1 0,01 0,001 Positif No./100 mL
A 5 5 1 0 0 x-5-1-0-x 330
B 4 5 1 0 0 4-5-1-xx 48
C 5 2 5 2 1 xx-5-2-1 7000
D 4 5 4 5 1 xx-4-5-1 4800
e 5 4 4 0 1 x-4-4-1-x 400
F 4 3 0 1 1 4-3-2-xx 39
G 4 3 3 2 1 xx-3-2-1 1700
dua pengenceran dan tetapkan jumlah pengenceran yang tersisa Misalnya pada deret xx-3-0-0, dimana kadar pengenceran
untuk pengenceran ketiga. Pada Contoh E, pengenceran ketiga (zs) sama dengan 0,1 mL, xszs = 0,3, dan njz j = 0,555.
tertinggi dengan semua tabung positif berisi 10 mL; Jadi, MPN yang dihitung = 7800/100 mL.
pengenceran ini telah dihapus pada langkah kedua. Empat Formula ini juga berlaku untuk pengenceran serial yang
pengenceran, tidak ada yang memiliki semua tabung positif, semuanya positif
tetap ada. Dalam keadaan ini, pilih dua pengenceran terendah tabung dalam pengenceran tunggal, dan dapat berfungsi sebagai
yang tersisa sesuai dengan 1 dan 0,1 mL sampel. Untuk perkiraan untuk hasil seperti 5-5-5-0-0-0, di mana lima tabung
pengenceran ketiga, tambahkan jumlah tabung positif pada digunakan per pengenceran, dengan hanya menggunakan empat
semua pengenceran yang lebih tinggi (0,01 dan 0,001 mL pengenceran terakhir.
sampel), untuk menghasilkan kombinasi akhir 4-4-1. Tabel 9221:IV menunjukkan semua kecuali kombinasi tabung
Jika tidak ada pengenceran yang semua tabungnya positif positif yang mustahil untuk seri tiga pengenceran. Dalam
(Contoh F), pilih dua pengenceran terendah, sesuai dengan 10 menguji 10 sampel, terdapat peluang 99% untuk menemukan
dan 1 mL sampel. Untuk pengenceran ketiga, tambahkan jumlah semua hasil di antara 95 hasil tersebut. Jika kombinasi yang
tabung positif pada pengenceran yang tersisa (0,1, 0,01, dan tidak dibulatkan terjadi dengan frekuensi lebih besar dari 1%,
0,001 mL sampel), untuk menghasilkan kombinasi akhir 4-3-2. ini menunjukkan bahwa teknik tersebut salah atau asumsi
Jika pengenceran ketiga diberikan lebih dari lima tabung positif, statistik yang mendasari estimasi MPN tidak terpenuhi
maka kombinasi yang dipilih tidak akan ada pada Tabel (misalnya, penghambatan pertumbuhan pada pengenceran
9221:IV. rendah).
Jika ketiga pengenceran yang dipilih tidak ditemukan pada MPN untuk kombinasi yang tidak tercantum dalam tabel, atau
Tabel 9221:IV, maka sesuatu dalam pengenceran berseri tidak untuk kombinasi tabung atau pengenceran lainnya, dapat
biasa. Dalam hal ini, metode biasa untuk menghitung MPN, diperkirakan sebagai berikut: Pertama, pilih pengenceran
yang disajikan di sini, mungkin tidak berlaku. Jika sampel baru terendah yang tidak memiliki semua hasil positif. Kedua, pilih
tidak dapat diambil dan nilai MPN masih diinginkan, gunakan pengenceran tertinggi dengan setidaknya satu hasil positif.
pengenceran tertinggi dengan setidaknya satu tabung positif dan Terakhir, pilih semua pengenceran di antaranya. Misalnya, dari
kedua pengenceran segera lebih rendah dari tiga pengenceran (10/10, 10/10, 4/10, 1/10, 0/10) gunakan hanya (–, –, 4/10, 1/10,
yang dipilih. Dalam Contoh G, pilihan pertama, 4-3-6 (hasil dari –), sesuai dengan 4/10 @ 0,1 mL sampel/tabung dan 1/10 @
tiga pengenceran tertinggi), tidak ada dalam Tabel 9221:IV 0,01 mL sampel/tabung. Demikian juga, dari (10/10, 10/10,
karena 6 lebih besar dari 5. Pilihan kedua, menurut pedoman di 10/10, 0/10, 0/10), pilih hanya (–, –, 10/10, 0/10, –), sesuai
atas, adalah 3 -2-1. Jika set pengenceran terpilih yang kedua ini dengan 10/10 @ 0,1 mL sampel/tabung dan 0/10 @
tidak ada dalam Tabel 9221:IV, maka gunakan rumus berikut 0,01 mL sampel/tabung. Gunakan hanya pengenceran terpilih
untuk menghitung MPN: dalam formula Thomas berikut:1
MPN/100 mL (kurang lebih) = 100 × P/(N × T)1/2
xs zs
1—
( ) njz
log1 j
230.3 K Di mana:
Di 0
J=
s P= jumlah hasil positif,
N= volume sampel di semua bagian negatif
mana: — digabungkan,
zs mL, dan
T= volume total sampel dalam pengenceran terpilih, mL.
zS= jumlah sampel asli yang diinokulasi ke dalam Yaitu, N = Z(n -x )z , P = Z x , dan T = Z nz Dimana
setiap tabung
dari pengenceran sth, Jj jj jj,
dan
X S= jumlah
jumlah pengenceran,
tabung positif pada pengenceran sth, penjumlahan melebihi pengenceran
K= nada positif dalam pengenceran j. yang dipilih, dan xj = angka
J= pengenceran, Pada contoh pertama di atas,
S= pengenceran tertinggi dengan sedikitnya satu
MPN/100 mL (kurang-lebih) = 100 × 5/(0,69 ×
tabung positif,
1,1)1/2
NJ= jumlah tabung pada pengenceran ke-j, dan
zJ= jumlah sampel asli yang diinokulasikan ke dalam
= 500/0,87 = 570/100 mL
setiap tabung pada pengenceran ke-j.
TEKNIK FERMENTASI MULTIPLE-TUBE (9221)/Presence–Absence (P–A) Coliform Test
Pada contoh kedua di atas, MCCRADY, MH 1918. Tabel interpretasi cepat hasil tabung fermentasi.
Pub. Kesehatan J.9:201.
MPN/100 mL (kurang-lebih) = 100 × 10/(0,1 × 1,1)1/2 HALVORSON, HO & NR ZIEGLER. 1933–35. Penerapan statistik untuk
masalah dalam bakteriologi. J.Bakteriol. 25:101; 26:331, 559;
= 1000/0,332 = 3000/100 mL
29:609.
HOSKIN, JK 1933. Jumlah B. coli yang paling mungkin dalam analisis
Kedua contoh ini sangat cocok dengan MPN yang air. J.Amer. Asosiasi Pekerjaan Air. 25:867.
sebenarnya, masing-masing 590/100 mL dan 2400/100 mL. HOSKIN, JK 1934. Angka yang paling mungkin untuk evaluasi uji
Contoh kedua adalah kasus khusus dimana solusi eksak dapat coliaerogen dengan metode tabung fermentasi. Pub. Rep Kesehatan
dihitung secara langsung untuk dua pengenceran yang dipilih. 49:393.
Jika ingin meringkas hasil dari beberapa sampel dengan satu eISENHART, C. & PWWILSON. 1943. Metode statistik dan kontrol dalam
nilai MPN, gunakan rata-rata geometrik atau median. Rata-rata bakteriologi. Bakteri. Wahyu 7:57.
COCHRAN, WG 1950. Estimasi kepadatan bakteri dengan menggunakan
geometris dihitung dengan rata-rata nilai logaritmik; misalnya,
"jumlah yang paling mungkin". Biometrik 6:105.
rata-rata geometrik A, B, dan C adalah 10L di mana: WTINGGI, RL 1957. Seberapa besar kemungkinan bilangan yang paling
mungkin?
L=(log10 A+ log10 B + log10 C)/3 J.Amer. Asosiasi Pekerjaan Air. 49:1060.
DeMSEBUAH, JC 1983. Tabel MPN, dikoreksi. eur. J.Appl. Bioteknologi.
17:301.
Nilai rata-rata dilaporkan sebagai antilog dari L. BLODGETT, RJ & WE GARTHRIGHT. 1998. Beberapa model MPN untuk
pengenceran serial dengan pertumbuhan yang ditekan pada
pengenceran rendah. Mikrobiol Pangan. 15:91.
3. Referensi GARTHRIGHT, WE 1998. Lampiran 2: Angka yang paling mungkin dari
pengenceran berantai. Manual Analitik Bakteriologi FDA, edisi ke-
1.THOMAS, HA, JR. 1942. Kepadatan bakteri dari uji tabung fermentasi J. 8, Rev. A. AOAC International, Gaithersburg, Md.
Amer. Asosiasi Pekerjaan Air. 34:572. BLODGETT, RJ 2002. Mengukur ketidakmungkinan hasil dari tes
pengenceran serial. Komunal. Statis. Teori Met. 31:2209.
4. Bibliografi GARTHRIGHT, KAMI & RJ BLODGETT. 2003. MPN Pilihan FDA
metode untuk pengujian standar, besar, atau tidak biasa, dengan
MCCRADY, MH 1915. Interpretasi numerik hasil tabung fermentasi. J. spreadsheet.
Menginfeksi. Dis. 12:183. Mikrobiol Pangan. 20:439.
BLODGETT, RJ 2010. Lampiran 2: Angka yang paling mungkin dari
pengenceran berantai. Manual Analitik Bakteriologis FDA.
Tersedia
di:http://www.fda.gov/food/foodscienceresearch/laboratory
metode/ucm109656.htm.Diakses November 2016.
9221 D. Tes Coliform Kehadiran-Ketidakhadiran (P-A).
Tes ada-tidaknya (P-A) untuk kelompok coliform adalah

modifikasi sederhana dari prosedur multi-tabung yang Kumpulkan sampel seperti yang diarahkan pada Bagian 9060,
dimaksudkan untuk digunakan pada sampel rutin yang menggunakan wadah sampel yang ditentukan pada Bagian
dikumpulkan dari sistem distribusi atau instalasi pengolahan air. 9030B.19. Ikuti panduan QC-
Penyederhanaan ini dengan menggunakan satu bagian uji besar
(100 mL) dalam satu botol kultur untuk menentukan secara
kualitatif apakah ada atau tidak ada koliform dibenarkan
berdasarkan teori bahwa koliform tidak boleh ada dalam 100
mL sampel air minum. Juga, ini memungkinkan analis untuk
memeriksa lebih banyak sampel dalam periode waktu tertentu
dibandingkan dengan metode kuantitatif. Studi perbandingan
dengan prosedur membran-filter menunjukkan bahwa uji PA
dapat memaksimalkan deteksi koliform dalam sampel yang
mengandung banyak organisme yang dapat menumbuhkan
koloni koliform dan menyebabkan masalah deteksi.
Kaldu P–A mengandung laktosa dan indikator pH untuk
mendeteksi adanya produksi asam. Analis mengamati botol
kultur untuk produksi gas dan/atau asam—produk akhir
metabolik dari fermentasi laktosa. Hasil dugaan-positif coliform
yang diperoleh dari kaldu P-A harus dikonfirmasi menggunakan
kaldu BGLB.
1. Sampel
baris untuk botol sampel yang dijelaskan dalam Bagian
9020B.5d. Pastikan bahwa sampel memenuhi kriteria
penerimaan laboratorium pada saat diterima.
2. Fase Dugaan
a. Media budaya:
kaldu PA:Ikuti pedoman QC yang dikutip dalam 9221B.2.
Ekstrak daging sapi. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .3.0g
Pepton . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .5.0g
Laktosa. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .7.46g
triptosa. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .9,83g
Dipotasium hidrogen fosfat (K2HPO4) . . . . . . . . 1,35 g Kalium
dihidrogen fosfat (KH2PO4) . . . . . . . . 1,35 g Natrium klorida
(NaCl) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2,46g
Natrium lauril sulfat. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .0,05g
Bromocresolungu0,0085.................................................... G
Air tingkat reagen. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1L
Buat formulasi ini dengan kekuatan tiga kali lipat (3×) saat
memeriksa sampel 100 mL. Larutkan media P–A dalam air
dengan cara diaduk (jangan menggunakan panas). Keluarkan
50 mL media yang sudah disiapkan ke dalam sekrup
tutup botol pengenceran susu 250 mL atau wadah yang setara.
Sisipan botol fermentasi tidak diperlukan. Autoklaf selama 12
menit pada 121°C; batasi total waktu dalam autoklaf hingga
30 menit atau kurang. PH medium harus 6,8 ± 0,2 setelah
sterilisasi.
Gambar 9221:1. Garis besar skema fase dugaan, konfirmasi, dan penyelesaian untuk deteksi coliform total.
Jika disterilkan melalui filtrasi, media P–A berkekuatan 6x

dapat digunakan. Buang 20 mL media 6× secara aseptik ke tabung dugaan-positif lainnya dan inokulasi pada suhu 35 ±
dalam botol pengenceran 250 mL steril atau wadah yang setara. 0,5°C (lihat 9221B.4).
b. Prosedur:Kocok sampel dengan kuat selama 5 detik (kira- Kultur penuh dari botol yang diduga positif juga dapat
kira 25 kali) dan inokulasi 100 mL ke dalam botol kultur P–A. dipindahkan ke dalam EC broth [untuk penentuan thermo-
Aduk rata dengan membalik botol sekali atau dua kali untuk tolerant (fecal) coliforms] dan/atau EC-MUG broth (untuk
mendistribusikan sampel secara merata ke seluruh media. penentuan E. coli) pada waktu yang sama, selama sebagian
Inkubasi pada suhu 35 ± 0,5°C dan besar media penghambat (kaldu BGLB) diinokulasi terakhir.
periksa setelah 24 ± 2 jam dan 48 ± 3 jam untuk reaksi asam. c. Penafsiran:Produksi gas dalam kultur kaldu BGLB dalam
c. Penafsiran:Jika kondisi asam ada mengikuti laktosa waktu 48 ± 3 jam memastikan adanya bakteri koliform.
fermentasi, warna kuning yang berbeda akan terbentuk di Laporkan hasil sebagai uji P–A positif atau negatif untuk total
media. Jika gas juga diproduksi, maka busa akan terjadi saat koliform dalam 100 mL sampel. Sampel air minum yang positif
botol dikocok perlahan. Sejumlah gas dan/atau asam merupakan total coliform juga harus diuji termotoleran (feses)
uji dugaan-positif yang memerlukan konfirmasi. coliforms (9221E) atau E. coli (9221F).
3. Fase Konfirmasi
4. Fase Selesai
Fase yang dikonfirmasi diuraikan dalam Gambar 9221:1. Tahapan lengkap, yang diperlukan untuk analisis sampel air
a. Media budaya:Gunakan tabung fermentasi kaldu BGLB yang tidak dapat diminum, diuraikan dalam 9221B.5 dan
(lihat 9221B.4). Gambar 9221:1.
b. Prosedur:Setelah inkubasi, segera gunakan loop steril
berdiameter 3,0 hingga 3,5 mm untuk memindahkan satu atau 5. Bibliografi
lebih loop kultur dari botol yang diduga positif ke tabung
fermentasi yang berisi kaldu BGLB. Sebagai alternatif, WEISS, JE & CAHUNTER. 1939. Pemeriksaan bakteriologi air yang
masukkan aplikator kayu steril sekurang-kurangnya 2,5 cm ke disederhanakan. J.Amer. Asosiasi Pekerjaan Air. 31:707.
dalam biakan, segera angkat, dan masukkan aplikator ke dasar CLARK, JA 1969. Deteksi berbagai bakteri yang mengindikasikan
tabung fermentasi yang berisi kaldu BGLB. Hapus dan buang pencemaran air dengan prosedur ada-tidaknya (P-A). Bisa. J.
aplikator. Ulangi untuk semua Mikrobiol. 15:771.
TEKNIK FERMENTASI MULTIPLE-TUBE (9221)/Prosedur Coliform Termotoleran (Fekal)
CLARK, JA & LTVLASSOFF. 1973. Hubungan antara bakteri indikator

JACOBS, NJ, WL ZEIGLER, FC REED, TA STUKEL& EW RES.
pencemaran yang diisolasi dari air baku dan sistem distribusi
dengan uji ada-tidaknya (P-A). Laboratorium Kesehatan. Sains. 1986. Perbandingan filter membran, tabung multi-fermentasi, dan
10:163. teknik ada-tidaknya untuk mendeteksi coliform total dalam sistem
CLARK, JA 1980. Pengaruh meningkatnya jumlah organisme air komunitas kecil. Aplikasi Mengepung. Mikrobiol. 51:1007.
nonindikator terhadap deteksi organisme indikator oleh filter RES, EW, EE GELDREICH& EJ READ. 1989. Kehadiran-ketidakhadiran
membran dan uji ada-tidaknya. Bisa. J. Mikrobiol. 26:827. uji coliform untuk memantau kualitas air minum. Pub. Perwakilan
CLARK, JA, CABURGER& LE SABATINOS. 1982. Karakterisasi bakteri Kesehatan 104:54.
indikator pada sampel air baku kota, air minum dan air induk baru.
Bisa. J. Mikrobiol. 28:1002.
9221 E. Prosedur Koliform Termotoleran (Fekal).
Secara tradisional disebut coliform tinja, coliform gelembung. PH medium harus 6,9 ± 0,2 setelah sterilisasi.
termotoleran (yang memfermentasi laktosa untuk menghasilkan
gas pada suhu 44,5°C) telah didokumentasikan di perairan yang
kaya secara organik atau iklim tropis tanpa adanya kontaminasi
tinja baru-baru ini. Jadi, saat mencari bukti kontaminasi feses,
pengujian E. coli—indikator yang lebih spesifik—disarankan.
Namun demikian, peraturan mungkin mengharuskan coliform
termotoleran (tinja) diidentifikasi dan dihitung.
Untuk menguji koliform termotoleran, gunakan salah satu
dari prosedur multi-tabung yang dijelaskan di sini atau metode
membran-filter yang dijelaskan pada Bagian 9222D dan E.
Dalam teknik fermentasi tabung ganda, koliform termotoleran
diidentifikasi dengan
kemampuan memfermentasi laktosa untuk menghasilkan gas
pada suhu 44,5 ± 0,2°C dalam waktu 24 ± 2 jam.
1. Tes Coliform Termotoleran (EC Medium)
Tes coliform termotoleran menggunakan media EC berlaku

untuk investigasi air minum, polusi sungai, sumber air mentah
tanpa filter, sistem pengolahan air limbah, air mandi, air laut,
dan pemantauan kualitas air secara umum. Jangan gunakan
media EC untuk mengisolasi secara langsung coliform
termotoleran dari air; pengayaan sebelumnya dalam media
dugaan diperlukan untuk pemulihan optimal koliform
termotoleran. (Untuk menguji dugaan koloni koliform yang
tumbuh pada media padat, lihat Bagian 9222G.3c)
a. media EC:Persiapkan media EC mengikuti pedoman QC
yang dikutip dalam 9221B.2.
Triptosa atautrypticase20.0.................................................... G
Laktosa5.0................................................................................ G
Campuran garam empedu atau garam empedu No.31.5........... G
Dipotasium hidrogen fosfat (K2HPO4)4.0............................... G
Kalium dihidrogen fosfat (KH2PO4)1.5.................................. G
Natrium klorida(NaCl)5.0........................................................ G
Air tingkat reagen. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 L

panaskan hingga larut. Sebelum sterilisasi, masukkan media
secukupnya ke dalam tabung fermentasi dengan vial terbalik
untuk menutupi vial terbalik setidaknya setengah hingga dua
pertiga setelah sterilisasi. Tutup tabung dengan tutup logam atau
plastik tahan panas. Media autoklaf pada 121 ° C selama 12
hingga 15 menit. Pastikan vial terbalik bebas dari udara
TEKNIK FERMENTASI MULTIPLE-TUBE (9221)/Prosedur Coliform Termotoleran (Fekal)
b. Prosedur:
1) Setelah inkubasi, goyangkan perlahan atau putar tabung
atau botol fermentasi yang menunjukkan gas, pertumbuhan,
atau keasaman untuk meresuspensi organisme. Segera
gunakan loop steril berdiameter 3 hingga 3,5 mm untuk
memindahkan satu atau lebih kultur dari botol atau tabung
yang menunjukkan pertumbuhan dengan produksi asam
dan/atau gas ke tabung fermentasi yang berisi kaldu EC.
Sebagai alternatif, masukkan aplikator kayu steril sekurang-
kurangnya 2,5 cm ke dalam biakan, segera angkat, dan
masukkan aplikator ke dasar tabung fermentasi yang berisi
kaldu EC. Hapus dan buang aplikator. Ulang-
gambut untuk semua tabung dugaan-positif lainnya dan
inkubasi pada suhu 44,5 ± 0,2°C.
Inokulasi simultan ke dalam EC broth dan/atau EC-MUG
kaldu bersama dengan kaldu BGLB dapat diterima, jika media
yang paling menghambat (kaldu BGLB) diinokulasi terakhir.
2) Tempatkan semua tabung EC ke dalam penangas air
yang bersirkulasi (sebaiknya dengan penutup runcing) dalam
waktu 30 menit setelah inokulasi. Inkubasi tabung kaldu EC
yang diinokulasi pada suhu 44,5 ± 0,2°C selama 24 ± 2 jam.
Pertahankan kedalaman air yang cukup dalam inkubator
penangas air untuk membenamkan tabung ke tingkat atas
media.
c. Penafsiran:Produksi gas dengan pertumbuhan kultur
kaldu EC dalam waktu 24 ± 2 jam atau kurang dianggap
sebagai reaksi coliform (tinja) termoleran positif. Kegagalan
menghasilkan gas (dengan sedikit atau tanpa pertumbuhan)
merupakan reaksi negatif. Jika banyak
tabung yang digunakan, hitung MPN coliform termotoleran
dari jumlah tabung kaldu EC positif, seperti dijelaskan dalam
9221C. Bila hanya menggunakan satu tabung untuk subkultur
dari satu botol dugaan, laporkan ada tidaknya coliform yang
tahan panas. Jika pertumbuhan yang berat terjadi tanpa
produksi gas, uji biakan dengan coliform termotoleran atau uji
E. coli menggunakan media yang berbeda.
2. Tes Coliform Direct Thermotolerant (Fecal) (A-1 Medium)
a. Media A-1:Media ini dapat digunakan untuk secara

langsung mengisolasi coliform termotoleran dari air sumber
yang tidak disaring, air limbah yang diolah, dan air laut, tetapi
bukan air minum. Ikuti panduan dalam 9221B.1 untuk
pengambilan sampel. Tidak seperti media EC, media A-1
tidak memerlukan pengayaan sebelumnya dalam media
dugaan untuk pemulihan optimal koliform termotoleran.
Gunakan pedoman QC yang dikutip dalam 9221B.2.
Laktosa5.0................................................................................ G
Tryptone20.0.......................................................................... G
TEKNIK FERMENTASI MULTIPLE-TUBE (9221)/Escherichia coliProsedur Menggunakan Substrat Fluorogenik
Salicin0.5.................................................................................. G
3. Bibliografi
Polietilen glikol p-isooctylphenyleter*1.0............................... ml
Air tingkat reagen. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 L PERRY, CA & AAHAJNA. 1933. Media Eijkman yang dimodifikasi.
Panaskan untuk melarutkan bahan padat, tambahkan J.Bakteriol.26:419.
polietilen glikol p-isooctylphenyl ether, dan atur ke pH 6,9 ± PERRY, CA & AAHAJNA. 1944. Evaluasi lebih lanjut media EC untuk
0,1. Untuk sampel 10 mL, siapkan media kekuatan ganda isolasi bakteri coliform dan Escherichia coli. Amer. J.Pub.
sehingga konsentrasi akhir bahan setelah penambahan sampel Kesehatan 34:735.
benar. Sebelum sterilisasi, keluarkan media secukupnya dalam GELDREICH, EE, HF CLARK, PWKABEL, CBHUFF& RH BPEMESANAN.
tabung fermentasi dengan posisi terbalik 1958. Kelompok coliform. II. Reaksi dalam medium EC pada 45°C.
vial untuk menutupi vial terbalik setidaknya setengah sampai Aplikasi Mikrobiol.6:347.
dua pertiga setelah sterilisasi. Tutup dengan tutup logam atau GELDREICH, EE, RH BPEMESANAN, CBHUFF, HF CLARK& PW
plastik tahan panas. Sterilkan dengan autoklaf pada suhu 121°C KABEL. 1962. Jenis penyebaran bakteri Coliform pada feses hewan
selama 10 menit. Pastikan vial terbalik bebas dari gelembung berdarah panas. J. Pencemaran Air. Kontrol Fed. 34:295.
udara. Simpan di tempat gelap pada suhu kamar tidak lebih dari GELDREICH, EE 1966. Signifikansi Sanitasi Koliform Tinja di
7 hari. Abaikan endapan yang terbentuk selama penyimpanan. Lingkungan; Pub FWPCA. WP-20-3. Departemen Dalam Negeri
b. Prosedur:Inokulasi tabung kaldu A-1 seperti yang AS, Washington, DC
diarahkan pada 9221B.3b. Inkubasi selama 3 jam pada suhu 35 ANDREWS, WH & MW PRESELL. 1972. Pemulihan cepat Escherichia coli
± 0,5°C. Pindahkan tabung ke penangas air pada suhu 44,5 ± dari air muara. Aplikasi Mikrobiol. 23:521.
0,2°C dan inkubasi lagi selama 21 ± 2 jam. HAILSON, BH 1978. Peningkatan akurasi pengujian coliform di air laut
c. Penafsiran:Produksi gas dalam budaya kaldu A-1 dengan modifikasi metode angka yang paling mungkin. Aplikasi
dalam waktu 24 jam atau kurang adalah reaksi positif [yaitu, Mikrobiol. 36:438.
coliforms termotoleran (tinja) yang hadir]. Hitung MPN STANDRIDGE, JH & JJ DELFINO. 1981. Media A-1: Teknik alternatif untuk
coliform termotoleran (tinja) dari jumlah tabung kaldu A-1 pencacahan organisme fecal coliform dalam air limbah terklorinasi.
positif, seperti dijelaskan pada 9221C. Aplikasi Mengepung. Mikrobiol. 42:918.
* Triton X-100, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, atau setara.
9221 F.Escherichia coliProsedur Menggunakan Substrat Fluorogenik
Escherichia coliadalah anggota flora tinja asli hewan a. Media EC-MUG:Persiapkan media EC-MUG mengikuti
berdarah panas. Kehadiran E. coli dalam air dianggap sebagai pedoman QC yang dikutip dalam 9221B.2.
indikator spesifik kontaminasi tinja dan kemungkinan adanya
patogen enterik. Pengujian E. coli berlaku untuk analisis air Tryptosa atau trypticase . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20,0 g Laktosa
minum, permukaan, tanah, dan air limbah. Pengujian untuk E. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5,0 g
coli dapat dilakukan dengan menggunakan multiple- Campuran garam empedu atau garam empedu No.3. . . . . . . . . . . . . . .
1,5g
Dipotassium hidrogen fosfat (KHPO ). . . . . . . . . . 4.0g
prosedur tabung dijelaskan di sini, oleh filter membranmetode 24
dijelaskan dalam Bagian 9222G, atau dengan uji substrat enzim Gunakan media EC-MUG untuk menguji E. coli dalam kultur
kromogenik dijelaskan dalam Bagian 9223. Prosedur E. coli total coliform-positif, mengikuti pedoman QC yang dikutip dalam
lainnya disajikan dalam 9221G. 9221B.2.
Untuk uji E. coli menggunakan media EC-MUG, E. coli
didefinisikan sebagai spesies bakteri coliform yang memiliki
enzim β-glucuronidase, yang dapat membelah substrat
fluorogenik 4-methylumbelliferyl-β-D-glucuronide (MUG),
sehingga melepaskan fluorogen dalam waktu 24 ± 2 jam atau
kurang saat ditanam di EC-MUG
sedang pada suhu 44,5 ± 0,2°C.
1. Escherichia coliTes (Media EC-MUG)
Penggunaan media EC-MUG untuk mendeteksi E. coli dapat

diterapkan untuk investigasi air minum, pencemaran sungai,
sumber air baku tanpa filter, sistem pengolahan air limbah, air
mandi, air laut, dan pemantauan kualitas air secara umum.
Jangan gunakan EC-MUG untuk isolasi langsung E. coli;
pengayaan sebelumnya dalam media dugaan diperlukan untuk
pemulihan optimal. (Untuk menguji dugaan koloni koliform
yang tumbuh pada media padat, lihat Bagian 9222G.2.)
Kalium dihidrogen fosfat (KH2PO4) . . . . . . . . . . 1,5 g Natrium
klorida (NaCl) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5,0 g 4-
Methylumbelliferyl-β-D-glukoronida(MUG)0,05................... G
Air tingkat reagen. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 L
panaskan hingga larut. Sebelum sterilisasi, masukkan ke
dalam tabung yang tidak berpendar di bawah sinar ultraviolet
(UV) dengan panjang gelombang panjang (365–366 nm).
Tabung terbalik tidak diperlukan. Tutup tabung dengan logam
atau tutup plastik tahan panas. PH medium harus 6,9 ± 0,2
setelah sterilisasi selama 15 menit pada suhu 121°C.
b. Prosedur:
1) Goyangkan atau putar perlahan tabung atau botol
fermentasi yang menunjukkan pertumbuhan, gas, atau
keasaman untuk meresuspensi organisme. Dengan
menggunakan loop steril berdiameter 3 atau 3,5 mm,
pindahkan satu atau lebih loop penuh pertumbuhan dari
tabung atau botol fermentasi ke kaldu EC-MUG. Sebagai
alternatif, masukkan setidaknya tongkat aplikator kayu steril
2,5 cm ke dalam biakan, segera angkat, dan masukkan
aplikator ke dasar tabung fermentasi yang berisi kaldu EC-
MUG.
2) Tempatkan semua tabung EC-MUG dalam bak air dalam
waktu 30 menit setelah inokulasi. Inkubasi tabung EC-MUG
yang telah diinokulasi dan kontrol negatif selama 24 ± 2 jam
dalam penangas air yang bersirkulasi (sebaiknya dengan
penutup atap pelana) dipertahankan pada 44,5 ± 0,2°C.
Pertahankan secukupnya
TEKNIK FERMENTASI MULTIPLE-TUBE (9221)/LainnyaEscherichia coliProsedur
kedalaman air dalam inkubator penangas air untuk 2) Tempatkan semua tabung EC-MUG dalam bak air dalam
membenamkan tabung ke tingkat media yang lebih tinggi. waktu 30 menit setelah inokulasi. Inkubasi tabung EC-MUG
c. Penafsiran:Periksa semua tabung yang menunjukkan yang telah diinokulasi, bersama dengan kontrol positif dan
pertumbuhan fluoresensi menggunakan lampu UV panjang negatif, selama 24 ± 2 jam dalam air yang bersirkulasi
gelombang 6W, 365–366 nm. Kehadiran fluoresensi biru cerah mandi (sebaiknya dengan penutup atap pelana) dipertahankan pada
dianggap sebagai hasil positif untuk E. coli. Pertumbuhan tanpa 44,5 ± 0,2°C.
adanya fluoresensi biru cerah dianggap sebagai hasil negatif. Pertahankan kedalaman air yang cukup di dalam inkubator
Untuk membantu menginterpretasikan hasil dan menghindari penangas air
kesalahan identifikasi autofluoresensi lemah dari medium atau merendam tabung ke tingkat atas media.
tabung gelas sebagai respon positif, sertakan dalam pengujian c. Penafsiran:Periksa semua tabung yang menunjukkan
kontrol positif [kultur E. coli (MUG-positif) yang diketahui], pertumbuhan dan/atau gas untuk fluoresensi menggunakan
kontrol negatif [Klebsiella termotoleran pneumoniae (MUG- lampu UV panjang gelombang 6W, 365–366 nm. Pertumbuhan
negatif) kultur], dan media kontrol yang tidak diinokulasi. Jarak dengan produksi gas dianggap sebagai hasil positif untuk
antara lampu UV dan tabung harus sedemikian rupa sehingga coliform termotoleran. Kehadiran fluoresensi biru cerah
kontrol positif E. coli menunjukkan fluoresensi yang berbeda dianggap sebagai hasil positif untuk E. coli. Tabung dengan
sedangkan kontrol MUG-negatif dan tidak diinokulasi tidak. pertumbuhan dan/atau gas dan fluoresensi dianggap positif
Jika menggunakan banyak tabung, hitung MPN untuk E. coli untuk coliform termotoleran dan E. coli. Tabung dengan
dari jumlah tabung kaldu EC-MUG positif, seperti yang pertumbuhan dan/atau gas tetapi tanpa fluoresensi biru cerah
dijelaskan pada 9221C. Bila hanya menggunakan satu tabung, dianggap positif untuk koliform termotoleran dan negatif untuk
atau melakukan subkultur dari satu botol atau koloni dugaan, E. coli.
laporkan sebagai ada atau tidaknya Karena media autofluoresensi asli atau tabung kaca/ sisipan,
E.coli. berhati-hatilah dalam menginterpretasikan hasil. Untuk
membantu menginterpretasikan hasil, masukkan kontrol positif
2. Penentuan Simultan Coliform Termoleran danE.coli [kultur E. coli (MUG-positif)] dalam setiap pengujian], kontrol
negatif [kultur Klebsiella pneumoniae (MUG-negatif)
Kehadiran coliforms termotoleran dan E. coli dapat termotoleran], dan kontrol medium yang tidak diinokulasi. Jarak
ditentukan secara bersamaan dengan memasukkan vial terbalik antara lampu UV dan tabung harus sedemikian rupa sehingga
(tabung Durham) dalam tabung kaldu EC-MUG. Siapkan kaldu kontrol positif E. coli menunjukkan fluoresensi yang berbeda
EC-MUG sesuai dengan 9221F.1. sedangkan kontrol MUG-negatif dan tidak diinokulasi tidak.
a. Mempersiapkan:Sebelum sterilisasi dikeluarkan, dalam Jika digunakan banyak tabung, hitung MPN untuk E. coli dan
tabung fermentasi dengan vial terbalik, media yang cukup untuk coliform termotoleran dari jumlah tabung kaldu EC-MUG yang
menutupi vial terbalik setidaknya setengah sampai dua pertiga positif, seperti dijelaskan dalam 9221C. Saat menggunakan
setelah sterilisasi. Tutup dengan tutup logam atau tahan panas. hanya satu tabung, atau melakukan subkultur dari satu botol
PH medium harus 6,9 ± 0,2 setelah sterilisasi selama 15 menit atau koloni dugaan, laporkan ada tidaknya E. coli dan coliform
pada suhu 121°C. termotoleran.
b. Prosedur:
1) Goyangkan atau putar perlahan tabung atau botol 3. Bibliografi
fermentasi yang menunjukkan pertumbuhan, gas, atau keasaman
untuk meresuspensi organisme. Dengan menggunakan loop FENG, PCS & PA HARTMAN. 1982. Tes fluorogenik untuk konfirmasi
steril berdiameter 3 atau 3,5 mm, pindahkan satu atau lebih loop langsung dari Escherichia coli. Aplikasi Mengepung. Mikrobiol.
penuh pertumbuhan dari tabung atau botol fermentasi ke kaldu 43:1320.
EC-MUG. Sebagai alternatif, masukkan setidaknya tongkat HARTMAN, PA 1989. Tes MUG (glucuronidase) untuk E. coli dalam
aplikator kayu steril makanan dan air. Dalam A. Balows, RC Tilton & A. Turano, eds.
2,5 cm ke dalam biakan, segera angkat, dan masukkan aplikator Metode Cepat dan Otomasi dalam Mikrobiologi dan Imunologi.
Proses 5th Intl. Simp. tentang Metode Cepat dan Otomasi dalam
ke dasar tabung fermentasi yang berisi kaldu EC-MUG. Mikrobiologi & Imunologi, Florence, Italia, 4 – 6 November 1987.
SHADIX, LC & EWRES. 1991. Evaluasi uji β-glukuronidase untuk
deteksi Escherichia coli dari perairan lingkungan. Bisa. J.
Mikrobiol. 37:908.
9221 G. LainnyaEscherichia coliProsedur
Untuk uji E. coli menggunakan reagen GAD, E. coli coliform. Prosedur ini sangat berguna untuk menentukan adanya
didefinisikan sebagai spesies bakteri coliform yang memiliki strain MUG-negatif
enzim glutamate decarboxylase (GAD), yang dapat E.coli,beberapa di antaranya bersifat patogen (lihat juga Bagian 9260F).
menghasilkan reaksi basa dalam waktu 4 jam dalam reagen
yang mengandung asam glutamat dan litik. agen. Prosedur ini
digunakan untuk menguji E. coli setelah pengayaan sebelumnya
dalam media yang digunakan untuk mengidentifikasi bakteri
1. Escherichia coliTes (Prosedur GAD)
Gunakan prosedur GAD untuk menguji E. coli dalam total

coliform-positifbudaya mengikuti pedoman QC dikutip dalam
9221B.2.
a. reagen GAD:
L-Asam glutamat . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1,0 g
Natrium klorida (NaCl). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 90,0g
Bromocresolhijau0,05........................................................ G
Polietilen glikol oktilfenil eter* . . . . . . . . . . . 3,0 mL air tingkat

Tambahkan bahan ke air dan aduk hingga larut. Sesuaikan pH
reagen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1L
ke 7,5. Masukkan 5 mL ke dalam tabung, tutup, dan sterilkan
Tambahkan bahan ke dalam air dan aduk hingga semua bahan selama 10 menit pada suhu 121°C.
larut. PH harus 3,4 ± 0,2. Reagen stabil selama 2 bulan bila 2) reagen Kovac:
disimpan pada suhu 5°C. Ini dapat disterilkan dengan filter
(filter 0,2 µm) dan diperlakukan sebagai larutan steril. P-Dimethylaminobenzaldehyde5............................................ G
b. Prosedur: Amil alkohol (analitikkelas)75.............................................. ml
1) Kocok perlahan atau putar tabung atau botol dugaan yang Asam hidroklorik,conc25...................................................... ml
menunjukkan pertumbuhan, gas, atau keasaman. Dengan
menggunakan pipet ukur, pindahkan 5 mL kaldu dari tabung Larutkan aldehida dalam alkohol. Tambahkan asam dengan
atau botol fermentasi ke tabung sentrifus 15 mL. hati-hati ke dalam campuran aldehida-alkohol dan aduk hingga
2) Konsentrasikan sel bakteri dengan mensentrifugasi kaldu rata. Simpan di tempat gelap pada suhu 4°C. PERHATIAN:
pada 2500 hingga 3000 × g selama 10 menit. Buang supernatan Reagen bersifat korosif dan mudah terbakar. Reagen ini harus
dan resuspensi sel dalam 5 mL dapar fosfat. Rekonsentrasi sel berwarna kuning pucat hingga coklat muda. Penggunaan amil
dengan sentrifugasi pada 2500 hingga 3000 × g selama 10
menit. Buang supernatan dan tambahkan 1,0 mL reagen GAD. alkohol berkualitas rendah dapat menghasilkan reagen berwarna
Putar tabung dengan kuat untuk disuspensikan kembali gelap; jangan gunakan reagen seperti itu.
sel dalam reagen GAD. b. Prosedur:Kocok perlahan atau putar tabung atau botol
3) Inkubasi tabung pada suhu 35°C dan amati setelah 1 jam. dugaan yang menunjukkan pertumbuhan, gas, atau keasaman.
Tabung dapat diinkubasi selama maksimal 4 jam. Menggunakan loop logam steril berdiameter 3 atau 3,5 mm atau
c. Penafsiran:Periksa semua tabung untuk perubahan warna tongkat aplikator kayu steril, pindahkan pertumbuhan dari
yang berbeda dari kuning menjadi biru, yang dianggap sebagai tabung atau botol fermentasi dugaan ke tabung berisi 5 mL air
hasil positif tryptone. Inkubasi tabung air tryptone yang telah diinokulasi
E.coli. Untuk membantu dalam menginterpretasikan hasil, dalam penangas air atau inkubator yang dipelihara di
masukkan kontrol positif [kultur E. coli (GAD-positif)] ke 44,5 ± 0,2°C selama 24 ± 2 jam. Setelah inkubasi, tambahkan
dalam pengujian], kontrol negatif [organisme coliform total 0,2 hingga 0,3 mL reagen Kovac ke setiap tabung air tryptone.
yang diketahui, seperti Enterobacter cloacae (GAD-negatif)], c. Penafsiran:Periksa semua tabung untuk melihat warna
dan kontrol reagen GAD yang tidak diinokulasi. Jika digunakan merah tua di lapisan atas, yang dianggap sebagai hasil positif
beberapa tabung, hitung MPN untuk E. coli dari jumlah tabung untuk E. coli. Untuk membantu interpretasi hasil, masukkan ke
GAD positif, seperti dijelaskan pada 9221C. Bila hanya dalam pengujian kontrol positif [kultur E. coli (indole-positif)
menggunakan satu tabung atau botol dugaan, laporkan ada yang diketahui], kontrol negatif [organisme coliform total yang
tidaknya E. coli. diketahui, seperti Enterobacter cloacae (indole-negatif)], dan
kontrol reagen yang tidak diinokulasi. Jika digunakan beberapa
2. Escherichia coliTes (Produksi Indole) tabung, hitung MPN untuk E. coli dari jumlah tabung indole-
positif, seperti dijelaskan pada 9221C. Bila hanya menggunakan
Untuk keperluan pengujian ini, E. coli didefinisikan sebagai satu tabung atau botol dugaan, laporkan ada tidaknya E. coli.
spesies bakteri coliform yang dapat menghasilkan indole dalam
waktu 24 ± 2 jam bila ditumbuhkan dalam air tryptone pada suhu 3. Bibliografi
44,5 ± 0,2°C. Ada pengecualian: Klebsiella oxytoca dan beberapa
strain C. freundii FIEDLER, J. & J.REISKE. 1990. Glutaminsauredecarboxylase-schnelltest
dan Enterobacter spp. juga indole positif. Gunakan air tryptone zur identifikasi von Escherichia coli. Z.Ges. Hyg. Grenzgeb.
dan reagen Kovac untuk menguji E. coli dalam kultur total 36:620.
coliform-positif. RES, EW, CHJOHNSON, SAYA DUNNIGAN& DJ REASONER. 1993.
a. Reagen:Siapkan air tryptone dan reagen Kovac mengikuti Uji dekarboksilase glutamat cepat untuk deteksi Escherichia coli.
Aplikasi Mengepung. Mikrobiol. 59:4347. Errata. 1995. Aplikasi.
pedoman yang dikutip dalam 9221B.2.
lingkungan. Mikrobiol. 61:847.
1) Air tripton: STANDINGCKOMITE DARIANALYST. 1994. Laporan Kesehatan Masyarakat
Trypton20.................................................................................. G dan Bidang Kedokteran No. 71: Metode Pemeriksaan Air dan
Natrium klorida(NaCl)5.............................................................. G Bahan Terkait, Mikrobiologi Air Bagian 1—Air Minum. Buku
Tingkat reagenair1...................................................................... L HMSO, London, Inggris
RES, EW, CHJOHNSON& DJ REASONER. 1996. Deteksi Pelarian
richia coliO157:H7 dalam air dari kultur pengayaan coliform.
Lett. Aplikasi Mikrobiol. 23:179.
* Triton X-100, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, atau setara.
9222 TEKNIK FILTER MEMBRAN UNTUK ANGGOTA KELOMPOK COLIFORM*
9222 A. Pendahuluan
Teknik filter membran (MF) dapat direproduksi, dapat

* Disetujui oleh Komite Metode Standar, 2015.
digunakan untuk menguji volume sampel yang relatif besar, dan Kelompok Tugas Gabungan: Nancy H. Hall (kursi), Jennifer Best, Gil Dichter,
biasanya menghasilkan hasil numerik lebih cepat daripada Sandra M. Kleunder, Mark W. LeChevallier, Mark Rodgers.
prosedur fermentasi tabung ganda. Ini berguna dalam memantau
air minum dan berbagai perairan alami. Namun, teknik MF
memiliki keterbatasan, khususnya saat menguji air dengan
kekeruhan tinggi atau bakteri noncoliform (latar belakang)
dalam jumlah besar. Jika terjadi gangguan bakteri heterotrofik,
misalnya, hasil sampel mungkin perlu dibatalkan dan sampel
baru dikumpulkan.
Jika laboratorium belum pernah menggunakan teknik MF
sebelumnya, analis harus melakukan uji paralel dengan metode
laboratorium saat ini untuk menunjukkan penerapan dan
keterbandingan. Banyak studi kinerja coliform telah dilaporkan
dalam literatur; tingkat hasil positif-palsu dan negatif-palsu
dapat berbeda di antara berbagai media coliform, sehingga
pengguna harus hati-hati memilih media dan prosedur yang
paling sesuai dengan kebutuhan mereka.
1. Terminologi
Dalam teknik MF, kelompok coliform didefinisikan sebagai

bakteri anaerob fakultatif, Gram-negatif, tidak membentuk
spora, berbentuk batang yang mengembangkan koloni dengan
ciri khas pada media tertentu. Ketika biakan bakteri coliform
yang dimurnikan diuji, mereka menghasilkan sitokrom oksidase
negatif dan reaksi uji β-galaktosidase positif. Rincian
karakteristik coliform ini diberikan di bawah ini untuk prosedur
total coliform MF standar (9222B) (¶ a di bawah) dan untuk dua
prosedur untuk mendeteksi total coliform dan E. coli secara
bersamaan (9222J dan K) (¶sb dan c di bawah) .
a. Media agar tipe endo (Endo agar LES atau Endo broth
MF):Dalam prosedur ini, bakteri koliform didefinisikan sebagai
bakteri yang mengembangkan koloni merah dengan kemilau
metalik (hijau keemasan) dalam waktu 24 jam pada suhu 35°C
pada media tipe Endo yang mengandung laktosa. Beberapa
anggota kelompok koliform total juga menghasilkan koloni
berwarna merah tua, mukoid, atau berinti tanpa kilau logam;
ketika diverifikasi, ini diklasifikasikan sebagai koloni coliform
atipikal. Umumnya, koloni merah muda (non-mukoid), biru,
putih, atau tidak berwarna yang kurang berkilau pada media
Endo dianggap nonkoliform dalam teknik ini.
b. Media kromogen ganda m-ColiBlue24:Media filter
membran diferensial ini secara bersamaan mendeteksi dan
menghitung total coliform (TC) dan Escherichia coli (E. coli)
dalam sampel air dalam 24 jam berdasarkan aktivitas enzim
spesifiknya. Bakteri coliform (selain E. coli) didefinisikan
sebagai bakteri yang menghasilkan koloni berwarna merah
dalam waktu 24 jam pada suhu 35°C pada media ini, yang
mengandung laktosa dan pewarna nonselektif [2,3,5-
triphenyltetrazolium chloride (TTC). )]. E. coli dibedakan dari
bakteri coliform lainnya dengan koloni biru hingga ungu dari
aksi
Enzim ß-glukuronidase pada 5-bromo-4-kloro-3-indolyl-ß-D- lebih presisi
glukuronida (BCIG), juga terdapat dalam medium.
c. Media MI fluorogen/kromogen:Media filter membran
diferensial ini secara bersamaan mendeteksi dan menghitung
total coliform (TC) dan Escherichia coli (E. coli) dalam
sampel air dalam 24 jam berdasarkan aktivitas enzim
spesifiknya. Media tersebut mencakup dua substrat enzim —
fluorogen 4-methylumbelliferyl-β-D-galactopyranoside
(MUGal) dan kromogen indoksil-β-D-glucuronide (IBDG)
untuk mendeteksi enzim β-galactosidase dan β-glucuronidase
yang diproduksi oleh TC dan
E.coli, masing-masing. Dalam prosedur ini, bakteri koliform
didefinisikan sebagai bakteri yang menghasilkan koloni
fluoresen dalam waktu 24 jam saat terpapar sinar ultraviolet
(UV) gelombang panjang (365–366 nm) pada suhu 35°C,
sedangkan koloni E. coli tampak berwarna biru pada media
ini.
2. Aplikasi
Teknik MF dapat digunakan untuk menguji air minum,

permukaan, tanah, kolam renang, dan laut. Jangan
menggunakannya untuk menguji efluen pengolahan air limbah
primer kecuali sampel diencerkan, karena tingkat kekeruhan
yang tinggi dapat menyumbat filter membran sebelum sampel
yang cukup disaring. Limbah yang diklorinasi harus memiliki
jumlah dan kekeruhan yang rendah. Selain itu, jangan
gunakan teknik MF untuk menguji air limbah yang
mengandung logam beracun tingkat tinggi atau senyawa
organik beracun (misalnya fenol) karena filter dapat
mengkonsentrasikan zat tersebut, sehingga menghambat
pertumbuhan koliform. Untuk sampel non-air limbah, tingkat
kekeruhan yang tinggi dapat menyumbat filter dan konsentrasi
bakteri heterotrofik yang tinggi dapat mengganggu
pertumbuhan koliform pada filter, kemungkinan memerlukan
penggunaan beberapa filter per sampel dan/atau berbagai
pengenceran sampel. Untuk mendeteksi stres total coliform
dalam air minum yang diolah dan limbah pengolahan air
limbah sekunder atau tersier yang diklorinasi, gunakan
metode yang dirancang untuk pemulihan organisme yang stres
(lihat Bagian 9212B.1). Teknik MF yang dimodifikasi untuk
koliform termotoleran dalam air limbah terklorinasi (Bagian
9212) dapat digunakan jika pengujian paralel selama 3 bulan
dengan teknik fermentasi tabung ganda menunjukkan
perbandingan untuk setiap jenis sampel spesifik lokasi.
Volume standar yang akan disaring adalah 100 mL untuk
sampel air minum; ini dapat didistribusikan di antara banyak
membran, jika perlu. Namun, untuk tujuan pemantauan
khusus (misalnya, mengatasi masalah kualitas air atau
mengidentifikasi penerobosan coliform dalam konsentrasi
rendah dari penghalang perlakuan), mungkin diinginkan untuk
menguji sampel 1-L. Jika partikulat mencegah satu filter
memproses sampel 1-L, bagilah sampel menjadi empat bagian
250 mL untuk analisis. Jumlahkan jumlah koliform pada
setiap membran untuk melaporkan jumlah koliform per liter.
Sampel selain air minum harus dianalisis menggunakan
beberapa tingkat pengenceran. Pengenceran yang
direkomendasikan untuk pengukuran koliform total disajikan
pada Tabel 9222:I dan untuk koliform termotoleran dan E.
coli pada Tabel 9222:IV.
Perbandingan statistik dari hasil yang diperoleh dengan
metode multiple-tube dan teknik MF menunjukkan bahwa MF
TEKNIK MEMBRANE FILTER (9222)/Prosedur Filter Membran Total Coliform Standar menggunakan Media Endo
(bandingkan Tabel 9221:III dan IV dengan Tabel 9222:III). deteksi total coliform dan Escherichia coli dalam air. Aplikasi
Data dari setiap pengujian menghasilkan informasi kualitas air Mengepung. Mikrobiol. 59:3534.
yang kira-kira sama, meskipun hasil numeriknya tidak identik. BRENNER, KP, CC RANKIN, MSIVAGANESAN& PV SCARPINO. 1996.
Perbandingan pemulihan Escherichia coli dan total coliform dari
3. Bibliografi air minum dengan metode agar MI dan
CLARK, HF, EEGELDREICH, HL JETER& PW KABEL. 1951. Itu Metode filter membran yang disetujui Badan Perlindungan
filter membran dalam bakteriologi sanitasi. Pub. Rep Kesehatan Lingkungan AS. Aplikasi Mengepung. Mikrobiol. 62:203.
66:951. GMENGOCEH, MA 1997. Sebuah media filtrasi membran baru untuk
KABEL, PW 1954. Pemeriksaan air dengan filter membran dan prosedur deteksi simultan dan pencacahan Escherichia coli dan total
MPN. Amer. J.Pub. Kesehatan 44:379. coliform. Aplikasi Mengepung. Mikrobiol. 63:3526.
THOMAS, HA & RL WTINGGI. 1956. Penggunaan membran filter molekuler FRANCY, DS & RA DARNER. 2000. Perbandingan metode untuk
untuk kontrol potensi air minum. J.Amer. Asosiasi Pekerjaan Air. menentukan konsentrasi Escherichia coli di perairan rekreasi. Air
48:1391. Res. 34:2770.
MCCSENI, JA, JE DELANEY& RJGRASSO. 1961. Mengukur coli- MENGGUNAKANLINGKUNGANPROTEKSIAGENSI. 2002. Metode 1604:
bentuk dalam air. Pekerjaan Air Limbah 108:238. Total Coliform dan Escherichia coli dalam Air dengan Filtrasi
LDI DALAM, S. 1973. Evaluasi uji coliform untuk limbah sekunder Membran Menggunakan Teknik Deteksi Simultan (Media MI);
terklorinasi. J. Pencemaran Air. Kontrol Fed. 45:498. EPA 821-R-02-024. Mati. Air, Washington, DC
MANDEL, J. & LF NANNI. 1978. Evaluasi Pengukuran. Dalam SL Inhorn, HAILSTADT, J., JJ SHAUER, J.STANDRIDGE& S.KLENDER. 2007. Sebuah kom-
ed. Praktik Penjaminan Mutu untuk Laboratorium Kesehatan, perbandingan sepuluh total coliform/E yang disetujui USEPA. tes
P. 209. Asosiasi Kesehatan Masyarakat Amerika, Washington, DC koli.
BRENNER, KP, CC RANKIN, YR ROYBAL, GN STELMA, JR., PV J. Air dan Kesehatan05:267.
SCARPINO& AP DUFOUR. 1993. Media baru untuk simultan
9222 B. Prosedur Filter Membran Total Coliform Standar menggunakan Media Endo
Metode ini dapat digunakan untuk mengukur total koliform kertas pembungkus tebal yang sesuai saat diautoklaf. Inkubasi
dalam air minum, tidak dapat diminum, dan air lainnya dengan dengan tutup longgar
menggunakan media jenis Endo. Koloni tipikal yang ditanam kaca dan piring kultur plastik sekali pakai dalam wadah tertutup
pada media tipe Endo dapat dipartisi lebih lanjut untuk rapat untuk mencegah penguapan kelembaban dengan hasil
membedakan coliform termotoleran (tinja) dan E.coli pengeringan
menggunakan metode partisi pada 9222G, H, dan I. Metode ini
mungkin tidak sesuai untuk sampel dengan partikel tinggi yang
dapat menyumbat filter atau sampel dengan proporsi total
coliform yang tinggi relatif terhadap E.coli. Untuk pengukuran
total coliform dan E.coli secara simultan menggunakan filtrasi
membran, lihat Metode 9222J dan K.
1. Peralatan Laboratorium
Untuk analisis MF, gunakan peralatan gelas dan peralatan lain

yang terbuat dari bahan yang bebas dari bahan yang dapat
mempengaruhi pertumbuhan bakteri.
a. Botol sampel:Lihat Bagian 9030B.19.
b. Botol pengenceran:Lihat Bagian 9030B.13.
c. Pipet dan silinder ukur:Lihat Bagian 9030B.9.
Sebelumsterilisasi, tutup bukaan silinder ukur dengan lembaran
logam atau pengganti kertas pembungkus berat yang sesuai.
Segera setelah sterilisasi, tutup rapat untuk mencegah
kontaminasi.
d. Wadah untuk media kultur:Gunakan labu kaca borosilikat
yang bersih. Labu dengan berbagai ukuran atau bentuk dapat
digunakan, tetapi labu Erlenmeyer dengan tutup logam, penutup
foil logam, atau tutup ulir menyediakan pencampuran media
yang memadai di dalamnya dan nyaman untuk penyimpanan.
e. Hidangan budaya:Gunakan gelas borosilikat steril atau
cawan Petri plastik sekali pakai yang sudah disterilkan, 15- ×
60-mm, 9- × 50-mm, atau ukuran lain yang sesuai. Bungkus
cawan biakan gelas yang bersih dalam jumlah yang nyaman
dalam foil logam jika disterilkan melalui panas kering, atau
media dan untuk menjaga lingkungan yang lembab untuk
perkembangan koloni yang optimal.
Piring plastik sekali pakai yang disterilkan dengan penutup
rapat yang memenuhi spesifikasi di atas tersedia secara
komersial dan digunakan secara luas. Segel kembali paket
persediaan piring sekali pakai yang dibuka untuk
penyimpanan.
f. Unit filtrasi:Rakitan penahan filter (terbuat dari kaca,
plastik yang dapat diautoklaf, porselen, baja tahan karat, atau
plastik sekali pakai) terdiri dari corong tanpa sambungan yang
diikat ke alas melalui perangkat pengunci atau gaya magnet.
Desainnya harus memungkinkan filter membran ditahan
dengan aman di pelat berpori wadah tanpa kerusakan mekanis
dan memungkinkan semua cairan melewati membran selama
filtrasi. Buang corong plastik dengan goresan dalam pada
permukaan bagian dalam atau corong kaca dengan permukaan
terkelupas. Ganti layar yang rusak pada unit stainless steel.
Bungkus rakitan (secara keseluruhan atau bagian terpisah)
dengan kertas pembungkus tebal atau aluminium foil, atau
tempatkan dalam kantong otoklaf komersial; mensterilkan
melalui autoklaf; dan simpan sampai digunakan. Unit
lapangan dapat dibersihkan dengan mencelupkan atau
menyemprot dengan alkohol dan kemudian menyalakan atau
merendamnya dalam air mendidih selama 2 menit. Gunakan
air reagen untuk menghindari endapan air sadah (lihat Bagian
9020B.4d untuk spesifikasi kualitas air tingkat reagen).
Setelah merendam unit dalam air mendidih, dinginkan hingga
suhu kamar sebelum digunakan kembali. Jangan menyalakan
komponen plastik. Unit lapangan yang steril dan sekali pakai
juga dapat digunakan.
Untuk filtrasi, pasang wadah penahan filter pada labu filter
1-L dengan lengan samping atau perangkat lain yang sesuai
(manifold untuk menampung tiga hingga enam unit filter)
sehingga perbedaan tekanan (34 hingga 51 kPa) dapat
diberikan pada membran penyaring. Sambungkan labu ke
saluran vakum, pompa vakum elektrik, pompa filter yang
beroperasi pada tekanan air, aspirator tangan, atau cara lain
untuk mengamankan perbedaan tekanan (138 hingga 207
kPa). Hubungkan labu kira-kira
kapasitas yang sama antara labu penyaringan dan sumber untuk memberikan kemilau maksimum. Optimalnya, gunakan
vakumuntuk menjebak air yang terbawa. binocular wide-field dissecting
g. Filter membran:Gunakan filter membran dengan nilai mikroskop. Jangan gunakan mikroskop dengan iluminator yang
diameter pori untuk mempertahankan bakteri coliform mengkonsentrasikan cahaya dari sumber pijar saat melihat koloni
sepenuhnya (biasanya koliform pada media tipe Endo.
0,45 µm) (untuk spesifikasi tambahan, lihat Bagian 9020B.5i).
Hanya gunakan membran filter yang telah ditemukan—melalui
pengujian kontrol kualitas (QC) yang memadai dan sertifikasi
pabrikan—untuk menunjukkan hal-hal berikut:
• retensi penuh dari organisme yang akan dibudidayakan,
• stabilitas dalam penggunaan,
• kebebasan dari bahan kimia yang dapat diekstraksi yang
dapat menghambat pertumbuhan dan perkembangan
bakteri,
• kecepatan filtrasi yang memuaskan (dalam 5 menit),
• tidak berpengaruh nyata pada pH medium (melebihi ±0,2
unit), dan
• tidak ada peningkatan jumlah koloni konfluen atau
penyebar dibandingkan dengan filter membran kontrol.
Gunakan membran bertanda kisi agar pertumbuhan bakteri
tidak terhambat atau terstimulasi sepanjang garis kisi saat
membran dengan bakteri yang terperangkap diinkubasi pada
media yang sesuai. Sebaiknya gunakan persediaan filter
membran segar dan, jika perlu, simpan di lingkungan tanpa suhu
dan kelembapan ekstrem. Dapatkan pasokan tidak lebih dari
satu tahun pada satu waktu.
Lebih disukai menggunakan filter membran pra-sterilisasi
yang telah disertifikasi oleh pabriknya bahwa teknik
sterilisasinya tidak menyebabkan toksisitas atau mengubah sifat
kimia atau fisik membran. Jika membran disterilkan di
laboratorium, autoklaf selama 10 menit pada suhu 121–124°C
dan kemudian biarkan uap keluar dengan cepat untuk
meminimalkan kondensasi pada filter.
h. Bantalan penyerap:Gunakan piringan kertas saring atau
bahan lain yang telah disertifikasi oleh produsen, secara lot, agar
berkualitas tinggi dan bebas dari sulfit atau bahan beracun
lainnya pada konsentrasi yang dapat menghambat pertumbuhan
bakteri. Gunakan bantalan berdiameter sekitar 48 mm dan cukup
tebal untuk menyerap 1,8 hingga 2,2 mL media. Beberapa
bantalan mungkin memerlukan 3,0 mL media. Sterilkan
bantalan dalam amplop kraft yang dapat ditutup kembali, atau
secara terpisah dalam wadah lain yang sesuai selama 15 menit
dalam autoklaf (siklus kering). Bantalan kering sehingga bebas
dari kelembapan yang terlihat sebelum digunakan. Lihat
prosedur sterilisasi membran-filter dalam ¶ g di atas.
i. Tang:Gunakan forsep tumpul halus, tanpa kerutan di sisi
dalam ujungnya. Sterilkan sebelum digunakan dengan
mencelupkan ke dalam 95% etil atau alkohol metil absolut dan
nyalakan.
j. Inkubator:Gunakan inkubator untuk memberikan suhu
35 ± 0,5°C. Untuk menghindari pengeringan yang berlebihan,
pertahankan lingkungan yang lembap untuk pelat selama
inkubasi dengan menggunakan inkubator yang dilembabkan
(antara 60 dan 90% kelembapan relatif) atau
menempatkan piring dalam wadah tertutup dengan penutup
yang rapat (atau kantong tertutup). Pelat tidak boleh kehilangan
lebih dari 15% berat agar selama inkubasi.
k. Mikroskop dan sumber cahaya:Untuk menentukan jumlah
koloni pada filter membran, gunakan perbesaran 10 hingga 15x
dan sumber cahaya fluoresen putih dingin yang disesuaikan
2. Bahan dan Media Kultur kelembapan. Buang media yang tidak digunakan setelah 2
minggu [atau lebih cepat jika ada bukti kehilangan kelembaban,
Karena hasil uji harus seragam, gunakan media dehidrasi kontaminasi media, kerusakan media (penggelapan media), atau
komersial; jangan pernah menyiapkan media dari bahan dasar pembentukan kemilau permukaan].
saat media dehidrasi yang sesuai tersedia. Ikuti petunjuk
produsen untuk rehidrasi. Simpan persediaan media dehidrasi
yang telah dibuka di dalam desikator (jika perlu). Media cair
komersial (ampula steril, dll.) dapat digunakan jika diketahui
memberikan hasil yang setara. Lihat Bagian 9020B.5j. Uji
setiap lot media baru untuk memastikan kinerjanya
memuaskan (lihat Bagian 9020B.5j). Penggunaan bagan
kendali sangat membantu untuk mengidentifikasi tren dan
memastikan konsistensi jangka panjang dalam kinerja media.
Dengan setiap lot media jenis Endo baru, verifikasi minimal
10% koloni coliform (diperoleh dari sampel alami atau sampel
dengan penambahan yang diketahui) untuk menetapkan
pemulihan komparatif lot tersebut.
Sebelum digunakan, uji kinerja setiap batch media MF yang
disiapkan di laboratorium dengan kontrol biakan positif dan
negatif. Jika media yang disiapkan secara komersial tidak
tersedia, siapkan dari masing-masing komponen seperti yang
dijelaskan dalam ¶sa dan b di bawah ini.
a. Endo agar LES (formulasi Lawrence Experimental
Station):
Ekstrak ragi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1,2g
Casitone atau trypticase . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3,7g
Thiopeptone atau tioton. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3,7 g
triptosa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7,5 gram
Laktosa. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9,4g
Dipotasium hidrogen fosfat (K2HPO4) . . . . . . . . . 3,3 g Kalium
dihidrogen fosfat (KH2PO4). . . . . . . . . . 1,0 g Natrium klorida
(NaCl) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3,7g
Natrium desoksikolat. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,1 g
Natrium laurilsulfat0,05......................................................... G
Natrium sulfit (Na2SO3) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1,6g
fuchsin dasar. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,8g
Agar. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15.0g
Air tingkat reagen. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1L
PERHATIAN: Dasar fuchsin adalah karsinogen dan

mutagen yang dicurigai. Hindari kontak kulit, konsumsi,
dan paparan selaput lendir. Ikuti instruksi produsen dan
lembar data keselamatan (SDS).
Rehidrasi produk sesuai petunjuk produsen atau masing-
masing komponen dalam 1 L air yang mengandung 20 mL
etanol 95%. Jangan gunakan etanol terdenaturasi, yang
mengurangi pertumbuhan latar belakang dan ukuran koloni
koliform. Didihkan hingga hampir mendidih untuk melarutkan
agar, segera angkat dari api, dan dinginkan hingga antara 45
dan 50°C. Jangan mensterilkan dengan autoklaf. pH akhir
seharusnya
7,2 ± 0,2. Endapan adalah normal pada media tipe Endo.
Keluarkan dalam jumlah 5 hingga 7 mL ke bagian bawah
gelas Petri 60 mm
piring atau jumlah 4- hingga 6-mL ke bagian bawah cawan
Petri plastik 50 mm dan biarkan mengeras. Jika piringan
dengan ukuran lain digunakan, sesuaikan jumlahnya untuk
memberikan kedalaman setara 4 hingga 5 mm. Jangan
memaparkan piring yang dituangkan ke sinar matahari
langsung; dinginkan dalam gelap, sebaiknya dalam kantong
plastik tertutup atau wadah lain untuk mengurangi hilangnya
b. media m-Endo:* TMAMPU9222:I. SDISARANKANSCUKUPVOLUM

triptosa atau polipepton. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .10.0g UNTUKMEMBRANFILTERTOTALCOLIFORMTEst
Thiopeptone atau tioton. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .5.0g VOLUME(X)THAIBeFTERPILIH

Casitone atau trypticase. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .5.0g ML
Ekstrak ragi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1,5g WATERSOURCE 100 50 10 1 0,1 0,01 0,001 0,0001
Laktosa. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .12,5g Air minum
Natrium klorida (NaCl). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .5.0g X
Kolam renang
Dipotassium hidrogen fosfat (KHPO ). . . . . . . . . . 4.375G X
2 4
Kalium dihidrogen fosfat (KH PO)1.375............................. G Sumur, mata air X X X
24
Danau, waduk X X X
Natrium lauril sulfat. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,05G Asupan pasokan air X X X
Sodiumdesoxycholate0.10 G Pantai pemandian X X X
Natrium sulfit (Na2SO3)2.10 G air sungai X X X X
Dasarfuchsin1.05 G Limbah terklorinasi X X X
Agar(opsional)15.0 G Limbah mentah X X XX
Tingkat reagenair1 L
PERHATIAN: Dasar fuchsin adalah karsinogen dan latar tipikal, atipikal, dan nonkoliform) pada permukaan filter
mutagen yang dicurigai. Hindari kontak kulit, konsumsi, membran (Tabel 9222:II). Analisis air minum dengan menyaring
atau paparan selaput lendir. Ikuti petunjuk produsen dan 100 mL atau
SDS.
1) Persiapan agar—Rehidrasi produk dalam 1 L air yang * Dehidrasi Difco m-Endo Broth MF (No. 274920), atau setara.
mengandung 20 mL etanol 95%. Jangan gunakan etanol
terdenaturasi, yang mengurangi pertumbuhan latar belakang dan
ukuran koloni koliform. Jangan mensterilkan dengan autoklaf.
Panaskan hingga hampir mendidih untuk melarutkan agar,
segera angkat dari api, dan dinginkan hingga antara 45 dan
50°C. Tuangkan 5 hingga 7 mL ke dalam gelas steril 60 mm
atau 4 hingga 6 mL ke dalam cawan Petri plastik 50 mm. Jika
piring dengan ukuran lain digunakan, sesuaikan jumlahnya
untuk memberikan kedalaman yang setara.
pH akhir harus 7,2 ± 0,2. Endapan adalah normal pada media
tipe Endo.
Dinginkan media yang sudah jadi dalam gelap, dan buang
agar-agar yang tidak terpakai setelah 2 minggu [atau lebih cepat
jika ada bukti kehilangan kelembapan, kontaminasi media,
kerusakan media (penggelapan media), atau pembentukan
kemilau permukaan].
2) Persiapan kaldu—Siapkan seperti di atas, hilangkan agar.
Keluarkan media cair (setidaknya 2,0 mL per piring) ke
bantalan penyerap steril (lihat 9222B.1h) dan hati-hati buang
kelebihan media dengan menuang piring. Kaldu mungkin
memiliki endapan tetapi ini tidak mengganggu kinerja sedang
jika pembalut disertifikasi bebas dari sulfit atau bahan beracun
lainnya pada konsentrasi yang dapat menghambat pertumbuhan
bakteri. Kaldu yang didinginkan dalam botol atau termos
bertutup ulir dapat disimpan hingga 96 jam.
c. Air bilasan pengenceran buffer:Lihat Bagian 9050C.1.
3. Sampel

9060A.
4. Prosedur
a. Pemilihan ukuran sampel:Ukuran sampel akan diatur oleh

kepadatan bakteri yang diharapkan, tingkat kekeruhan dan, jika
berlaku, persyaratan peraturan. (Lihat Tabel 9222:I untuk
volume sampel yang disarankan.)
Volume sampel yang ideal akan menghasilkan 20 hingga 80
koloni koliform total dan ≤200 koloni dari semua jenis (koloni
TMAMPU9222:II. NJUMLAH DARICOLONI
DISAYAKESEPAKATANRANJING UNTUK
QUANTATIFDPENGHENTIAN
Kisaran Penghitungan Koloni
TestMinimumMaximum
Jumlah koliform 20 80
Koliform tinja 20 60
Streptococcus tinja 20 100
enterokokus 20 60
E.coli 20 80
ulangan dari volume sampel yang lebih kecil (misalnya,

duplikat bagian 50-mL atau empat ulangan dari bagian 25-
mL). Analisis air lain dengan menyaring tiga volume yang
berbeda (diencerkan atau tidak diencerkan), bergantung pada
kepadatan bakteri yang diharapkan. (Lihat Bagian 9215B.2
untuk persiapan pengenceran.) Saat menyaring <10 mL dari
sampel (diencerkan atau tidak diencerkan), tambahkan kira-kira
10 mL steril
air pengenceran buffer ke corong dan kemudian tambahkan
sampel diikuti dengan 25 sampai 50 mL air pengenceran
lainnya sebelum penyaringan atau pipet volume sampel ke
dalam air pengenceran steril dan kemudian saring seluruh isi
botol pengenceran. Peningkatan volume air ini membantu
membubarkan suspensi bakteri secara merata di seluruh
permukaan penyaringan yang efektif.
b. Unit filtrasi steril dan kontrol kualitas:Gunakan unit
filtrasi steril di awal setiap rangkaian filtrasi sebagai tindakan
pencegahan minimum untuk menghindari kontaminasi yang
tidak disengaja. Serangkaian filtrasi terputus ketika selang
waktu 30 menit atau lebih lama berlalu antara filtrasi sampel.
Setelah interupsi tersebut, perlakukan filtrasi sampel lebih
lanjut sebagai seri filtrasi baru dan sterilkan semua penahan
filter membran yang digunakan. (Lihat 9222B.1f untuk
prosedur sterilisasi dan Bagian 9020B.4l dan m untuk
panduan keselamatan dan pembersihan UV.)
c. Filtrasi sampel:Dengan menggunakan forceps steril,
tempatkan filter membran steril (sisi grid menghadap ke atas)
di atas pelat alas yang berpori. Tempatkan unit corong yang
cocok dengan hati-hati di atas alas (kunci di tempatnya, jika
ada). Campur sampel atau pengenceran sampel secara
menyeluruh dengan mengocok kuat-kuat (misalnya, 25 kali
naik turun dalam busur 1 kaki dalam 7 detik) untuk memecah
gumpalan bakteri, yang sangat penting untuk metode
kuantitatif mikroba. Jika botol sampel tidak memiliki ruang
kepala yang cukup untuk pencampuran yang memadai,
tuangkan sampel ke dalam bejana steril yang lebih besar
untuk mencampurnya dengan tepat. Saring sampel di bawah
vakum parsial (tekanan yang biasa digunakan: 81 kPa, 24 in.
Hg, atau vakum 79%).
Dengan saringan masih terpasang, bilas permukaan bagian LES, yang telah dibiarkan mencapai suhu kamar. Penempatan
dalam corong dengan menyaring tiga porsi 20 sampai 30 mL air filter yang salah langsung terlihat jelas karena tambalan membran
pengenceran buffer steril dari botol pencet (atau alat lain yang yang tidak ternoda menunjukkan udara yang terperangkap. Jika
sesuai). Ini memuaskan hanya jika botol pencet dan isinya tidak tambalan seperti itu muncul, pasang kembali filter dengan hati-
terkontaminasi selama penggunaan. Jangan menggunakan hati pada permukaan agar. Jika media kaldu digunakan, siapkan
kembali botol air pengenceran yang terisi sebagian. Pembilasan biakan akhir dengan membuang biakan pengayaan dari inkubator
di antara sampel mencegah kontaminasi sisa. dan pisahkan bagian cawan. Tempatkan bantalan steril baru di
Saat pembilasan dan filtrasi akhir selesai, gunakan teknik dasar piring, jenuh dengan setidaknya 2,0 mL media m-Endo,
aseptik untuk melepaskan vakum, buka kunci dan lepas corong,
segera lepas filter membran dengan forceps steril, dan gulung
filter ke media yang dipilih untuk menghindari udara yang
terperangkap. Penempatan filter yang salah langsung terlihat
jelas karena tambalan membran yang tidak ternoda
menunjukkan udara yang terperangkap. Jika tambalan seperti itu
terjadi, hati-hati
pasang kembali filter sepenuhnya pada permukaan agar.
Tempatkan hanya satu filter membran per piringan. Balik
cawan, dan inkubasi pada suhu 35 ± 0,5°C selama 22 hingga 24
jam untuk m-Endo LES atau m-Endo MF. Secara opsional,
untuk membersihkan corong di antara sampel setelah pelepasan
filter, paparkan semua permukaan rakitan yang telah
dibersihkan dan disterilkan sebelumnya ke radiasi UV selama
2 menit sebelum menggunakan kembali unit untuk filtrasi
berturut-turut.
Jika menggunakan kaldu, tempatkan bantalan steril secara
aseptis di cawan biakan, jenuh dengan setidaknya 2,0 hingga 3,0
mL media (tergantung pada produsen bantalan), dan hati-hati
buang kelebihan media dengan menuangnya perlahan dari piring
ke dalam handuk terry sekali pakai atau kosongkan piring.
Tempatkan filter sampel langsung pada bantalan, balikkan
cawan, dan inkubasi seperti yang ditentukan di atas. Jika
digunakan wadah dengan tutup longgar, tempatkan di ruang
lembab (atau inkubator yang dilembabkan).
Diferensiasi beberapa koloni dapat hilang jika biakan
diinkubasi >24 jam.
Untuk sampel air yang tidak dapat diminum, corong harus
dibilas atau
dibersihkan dengan UV setelah penghilangan filter atau setelah
setiap sampel (seperti yang dijelaskan di atas) karena tingginya
jumlah bakteri coliform dan flora latar belakang yang ada dalam
sampel ini.
d. Sampel QC:Periksa sterilitas dan kontaminasi coliform
pada awal dan akhir setiap seri filtrasi, masing-masing, dengan
menyaring 20 hingga 30 mL pengenceran atau air bilasan
melalui filter (satu corong per batch sterilisasi). Jika kontrol
menunjukkan kontaminasi, tolak semua data dari sampel yang
terpengaruh dan minta sampel baru. Selain itu, untuk memeriksa
kemungkinan kontaminasi silang atau air bilasan yang
terkontaminasi, masukkan sampel air bilasan steril (100 mL)
setelah penyaringan 10 sampel. Inkubasi sampel QC ini di
bawah kondisi yang sama dengan sampel yang dianalisis.
e. Teknik pengayaan alternatif:Gunakan teknik ini hanya
dengan media m-Endo LES. Tempatkan bantalan penyerap steril
di tutup cawan biakan steril, dan pipet setidaknya 2,0 mL kaldu
lauril triptosa (disiapkan sesuai petunjuk pada Bagian 9221B.3a)
ke bantalan jenuh. Keluarkan cairan berlebih dengan hati-hati
dari bantalan penyerap dengan pelat decanting. Tempatkan filter
secara aseptik—di mana sampel telah dilewatkan—pada
bantalan. Filter inkubasi, tanpa pembalik
ing dish, selama 1,5 hingga 2 jam pada suhu 35 ± 0,5°C dalam
atmosfer dengan kelembapan relatif minimal 60%.
Keluarkan biakan pengayaan dari inkubator, angkat filter dari
bantalan pengayaan, dan gulingkan ke permukaan agar m-Endo
dan dengan hati-hati keluarkan kelebihan cairan dari bantalan 0,2°C selama 24 ± 2 jam akan memberikan informasi adanya
penyerap dengan pelat decanting. Pindahkan filter, dengan coliform termotoleran. Termasuk inokulasi EC-MUG yang
tindakan pencegahan yang sama seperti di atas, ke bantalan diinkubasi pada suhu 44,5 ± 0,2°C selama 24 jam akan
baru. Buang bantalan pengayaan bekas. memberikan informasi keberadaan E. coli. Urutan inokulasi
harus selalu dari yang paling sedikit sampai yang paling
Dengan media agar atau kaldu dan menggunakan prosedur
dua langkah ini, balik cawan dan inkubasi selama 22 ± 2 jam menghambat [1) EC atau EC-MUG, 2) lauril triptosa
pada suhu 35 ± 0,5°C. Lanjutkan ke ¶ f di bawah ini. kaldu, 3) kaldu laktosa hijau cemerlang]. (Lihat 9222G dan H
f. Perhitungan:Untuk menghitung unit pembentuk koloni untuk prosedur partisi MF.)
(CFU) pada filter membran Endotype, gunakan mikroskop
binokular medan lebar berdaya rendah (perbesaran 10 hingga
15×) atau perangkat optik lainnya, dengan sumber cahaya
neon putih dingin yang diarahkan ke memberikan tampilan
kemilau yang optimal. Sudut cahaya pada
koloni mempengaruhi deteksi kemilau untuk koloni coliform
yang tumbuh di piring m-Endo. Menggoyang dan memutar
pelat Petri memantulkan cahaya pada sudut yang berbeda dan
membantu mendeteksi kemilau pada koloni. Koloni koliform
yang khas pada media tipe Endo berwarna merah jambu
hingga merah tua dengan kemilau permukaan metalik. Hitung
koloni koliform tipikal dan atipikal segera setelah inkubasi.
Area kemilau dapat bervariasi dalam ukuran dari kepala peniti
kecil hingga menutupi seluruh permukaan koloni. Koloni
koliform atipikal dapat berwarna merah tua, mukoid, atau
berinti tanpa kemilau. Umumnya koloni berwarna merah
muda, biru, putih, atau tidak berwarna yang kurang berkilau
dianggap nonkoliform. Jumlah koloni noncoliform yang
tinggi
(>200 CFU) dapat mengganggu perkembangan maksimum
coliform. Mendinginkan biakan dengan kepadatan koloni
nonkoliform yang tinggi (setelah inkubasi) selama 0,5 hingga
1 jam sebelum dihitung
dapat membantu ketajaman kemilau. Sampel air yang
didesinfeksi atau limbah air limbah mungkin termasuk
organisme yang tertekan yang tumbuh relatif lambat dan
menghasilkan kemilau maksimum dalam 22 hingga 24 jam.
g. Verifikasi coliform:Kadang-kadang pada media tipe
Endo, organisme nonkoliform dapat menghasilkan koloni
kemilau yang khas, dan koloni atipikal (koloni berwarna
merah muda, merah tua, atau berinti tanpa kemilau) dapat
berupa koliform; dengan demikian verifikasi semua jenis
koloni tipikal dan atipikal direkomendasikan. Verifikasi
semua koloni pada media Endo dengan mengusap seluruh
membran atau mengambil setidaknya lima koloni tipikal dan
lima koloni atipikal dari biakan filter membran tertentu. (Lihat
Bagian 9020B.9.) Berdasarkan kebutuhan dan jenis sampel,
laboratorium dapat melakukan tindakan QC yang lebih ketat
(misalnya, untuk sampel yang tidak dapat diminum, verifikasi
setidaknya satu koloni dari setiap jenis koloni tipikal atau
atipikal dari biakan filter membran tertentu, atau verifikasi
10% sampel positif). Sesuaikan hitungan berdasarkan hasil
verifikasi. Tes verifikasi tercantum di bawah ini.
1) Fermentasi laktosa—Transfer pertumbuhan dari setiap
koloni, atau usap seluruh membran dengan kapas steril (untuk
hasil ada-tidaknya) dan tempatkan dalam kaldu lauril triptosa
berkekuatan tunggal; inkubasi kaldu pada 35 ± 0,5 ° C hingga
48 jam. Gas terbentuk dalam kaldu triptosa lauril dan
dikonfirmasi dalam warna hijau cemerlang
kaldu laktosa dalam waktu 48 jam memverifikasi koloni
sebagai coliform. (Lihat Bagian 9221B.3 dan 4 untuk
persiapan media.) Inokulasi simultan dari kedua media dapat
diterima (jika menggunakan loop, jarum, atau tongkat kayu
steril yang sama, inokulasi kaldu triptosa lauril terlebih
dahulu). Termasuk inokulasi kaldu EC yang diinkubasi pada
44,5 ±
2) Verifikasi coliform alternatif—Terapkan prosedur

verifikasi coliform alternatif ini ke koloni terisolasi pada media estimasi kotor populasi coliform aktual pada waktu
filter membran Endo. Jika kultur campuran dicurigai atau jika pengumpulankarena distribusi yang tidak seragam dalam
pemisahan koloni <2 mm, gores pertumbuhan ke media m-Endo matriks.
atau agar MacConkey untuk memastikan kemurnian kultur atau Dalam air minum yang baik, kejadian coliform umumnya
kirimkan akan minimal. Oleh karena itu, hitung semua koloni coliform
pertumbuhan campuran dengan metode tabung fermentasi. (mengabaikan batas bawah 20 yang disebutkan di atas) dan
a) Uji cepat—Verifikasi cepat koloni menggunakan reaksi uji gunakan rumus yang diberikan di atas untuk mendapatkan
untuk sitokrom oksidase (CO) dan β-galaktosidase. Reaksi densitas coliform.
Coliform adalah CO negatif dan β-galaktosidase positif dalam 4 Jika terjadi pertumbuhan konfluen— menutupi salah satu
jam inkubasi kultur tabung atau prosedur uji mikro (spot). membranseluruh area filtrasi atau sebagian darinya dengan
b) Sistem multi-tes komersial—Verifikasi dan/atau koloni yang tidak terpisah—laporkan hasil sebagai
identifikasi bakteri coliform dengan memilih koloni yang “pertumbuhan konfluen dengan (atau tanpa) koliform.” Jika
terisolir dengan baik, gores untuk isolasi, dan inokulasi koloni jumlah total koloni bakteri—koliform ditambah nonkoliform—
murni ke dalam sistem identifikasi multi-tes untuk >200 per membran atau jika
Enterobacteriaceae yang mencakup fermentasi laktosa dan/atau koloni tidak cukup berbeda untuk dihitung secara akurat, lalu
β -galaktosidase dan reaksi uji CO. laporkan
hasilnya sebagai "terlalu banyak untuk dihitung" (TNTC) atau
5. Perhitungan Kepadatan Coliform
"konfluen". Untuk sampel air minum yang menggunakan media
jenis Endo, keberadaan koliform dalam biakan tersebut dapat
dipastikan (lihat 9222B.4g). Sebagai alternatif, sikat seluruh
Pilih membran dengan jumlah koloni yang dapat diterima
permukaan filter dengan loop steril, tongkat aplikator, atau
(Tabel 9222:II) dan ≤200 unit pembentuk koloni (CFU) dari
kapas dan inokulasikan pertumbuhan ini ke dalam 1) tabung
semua jenis per membran, dengan persamaan berikut:
lauril triptosa berkekuatan tunggal dan 2) tabung kaldu empedu
laktosa hijau cemerlang. Jika empedu hijau cemerlang
(Total) coliform, No./100 mL tabung kaldumenghasilkan gas dalam waktu 48 jam pada suhu
koloni coliform dihitung × 100
35 ± 0,5°C, terdapat koliform. Untuk mematuhi Aturan Total
= = No. CFU/100 Coliform EPA, laporkan pertumbuhan konfluen atau TNTC
sampel mLtersaring dengan setidaknya satu coliform yang terdeteksi
mL
koloni (verifikasi hanya diperlukan dengan media tipe Endo)
sebagai "sampel positif coliform total." Laporkan pertumbuhan
Untuk sampel air minum, jika tidak ditemukan koloni konfluen atau TNTC tanpa koliform yang terdeteksi sebagai
koliform total, laporkan koloni koliform total yang dihitung “tidak valid”.
sebagai “<1 CFU/100 mL” atau laporkan “total bakteri koliform Untuk sampel yang tidak valid, mintalah sampel baru dari
yang tidak ada per 100 mL sampel”. lokasi yang sama dalam waktu 24 jam. Pilih volume yang lebih
Untuk sampel air yang tidak dapat diminum, jika bagian tepat untuk disaring per membran (perlu diingat bahwa standar
10,0-, 0,1-, dan 0,01-mL diperiksa dan semua hitungan adalah 0, porsi air minum adalah 100 mL, sesuai aturan). Jadi, alih-alih
maka hitung jumlah koliform per 100 mL yang akan dilaporkan menyaring 100 mL melalui satu membran, filter bagian 50 mL
jika terdapat 1 CFU pada filter yang mewakili terbesar melalui dua membran, bagian 25 mL melalui empat membran
volume filtrasi. Misalnya, laporkan <10 CFU/100 mL untuk terpisah, dll. untuk mengurangi interferensi karena terlalu padat.
volume sampel 10 mL tanpa koloni koliform, yaitu, Jika ada membran yang mengandung koloni coliform total yang
terverifikasi, laporkan seluruh sampel sebagai “total coliform
1/10 × 100 = <10 CFU/100 mL positif”. Jika penentuan densitas diinginkan, jumlahkan jumlah
koliform yang diamati pada semua membran dan laporkan
Untuk jumlah coliform terverifikasi, sesuaikan jumlah awal sebagai “[angka] per 100 mL.” (Alternatifnya, pilih metode
berdasarkan persentase verifikasi positif (baik tipikal maupun coliform lain yang tidak terlalu rentan terhadap gangguan
atipikal) dan laporkan sebagai berikut: bakteri heterotrofik.)
b. Perairan lainnya:Seperti pada sampel air minum, jika tidak
Koliform (total) terverifikasi, No./100 mL ada filter yang memiliki jumlah koliform dalam kisaran ideal,
jumlahkan jumlah koliform pada semua filter dan laporkan
jumlah koloni yang diverifikasi
= sebagai “[angka] per 100 mL”. Sebagai contoh, jika duplikat
jumlah total koloni coliform bagian 50-mL diperiksa dan kedua membran masing-masing
dikenakan verifikasi memiliki lima dan tiga koloni koliform, maka laporkan jumlah
× jumlah total koloni dugaan koliform total sebagai 8 CFU per 100 mL:
a. Air minum:Dalam Aturan Coliform Totalnya, Badan [(5+ 3)× 100]

= 8 CFU/100 mL
Perlindungan Lingkungan AS (EPA) hanya mensyaratkan (50+50)
catatan ada tidaknya coliform total dalam 100 mL sampel air
minum; namun, informasi kuantitatif dapat menunjukkan Atau, jika porsi 50-, 25-, dan 10-mL diperiksa dan jumlahnya
besarnya peristiwa pencemaran dan/atau kemajuan remediasi, masing-masing adalah 15, 6, dan <1 koloni coliform, kemudian
terutama saat membandingkan hasil sampel dari lokasi yang hitung berdasarkan nilai yang paling dapat diterima dan
berbeda (misalnya, sampel berulang). Informasi kuantitatif laporkan jumlah coliform total dengan pernyataan kualifikasi
hanya menyediakan a sebagai "diperkirakan 30 CFU/100 mL":
[(15)× 100]
= perkiraan 30 CFU/100 mL
(50)
Di sisi lain, jika porsi 10-, 1,0-, dan 0,1 mL diperiksa

dengan jumlah 40, 9, dan <1 koloni coliform,
TMAMPU9222:III. CKEPERCAYAANLIMIT
UNTUKMEMBRANFILTERCOLIFORMRHASILASMENYAN
indikator dengan volume filtrasi terkecil dan melaporkan hasil
>800 000 CFU/100 mL (untuk total coliform):
YI100-MLSCUKUP
Batas Keyakinan 95%. 80 × 100

Jumlah Coliform
Koloni Dihitung Lebih rendah Atas =>800 000 CFU/100 mL
0,01
0 0,0 3.7 c. Keandalan statistik hasil filter membran:Meskipun hasil
1 0,1 5.6
2 0,2 7.2
MF dianggap lebih tepat daripada hasil MPN (most probable
3 0,6 8.8 number) tabung ganda (format fermentasi tabung ganda 5 dan
4 1.0 10.2 10 tabung), jumlah membran mungkin meremehkan jumlah
5 1.6 11.7 bakteri coliform yang layak dan keadaan dapat mempengaruhi
6 2.2 13.1 presisi ini (latar belakang bakteri dan tingkat pengenceran, jenis
7 2.8 14.4 sampel, dll.). Tabel 9222:III mengilustrasikan beberapa batas
8 3.4 15.8 kepercayaan 95% untuk hasil MF. Nilai tersebut didasarkan
9 4.0 17.1 pada asumsi bahwa bakteri terdistribusi secara acak dan
10 4.7 18.4 mengikuti distribusi Poisson.
11 5.4 19.7
d. Presisi hasil MF:Hitung ketepatan analisis ulangan untuk
12 6.2 21.0
13 6.9 22.3
setiap jenis sampel yang diperiksa dan metode yang digunakan
14 7.7 23.5 jika tersedia cukup sampel untuk analisis ulangan (air minum,
15 8.4 24.8 air sekitar, dll.). (Lihat Bagian 9020B.9e.)
16 9.2 26.0
17 9.9 27.2 6. Bibliografi
18 10.7 28.4
19 11.5 29.6 FIFELD, CW & CP SCHAUFUS. 1958. Peningkatan media filter membran
20 12.2 30.8 untuk mendeteksi organisme koliform. J.Amer. Asosiasi Pekerjaan
Air. 50:193.
MCCSENI, JA & JE DELANEY. 1958. Studi media filter membran.
Pekerjaan Air Limbah105:292.
masing-masing, kemudian hitung densitas coliform hanya jumlah maksimum koloni yang dapat diterima untuk penentuan
berdasarkan porsi 10 mL karena filter ini memiliki jumlah kuantitatif
coliform dalam kisaran yang dapat diterima (lihat Tabel 9222:II)
dan laporkan hasilnya sebagai 400 CFU/100 mL:
(40× 100)
= 400 coliform/100 mL
10
Dalam contoh terakhir ini, jika membran dengan 40 koloni
koliform juga memiliki jumlah total koloni bakteri >200, maka
laporkan jumlah koliform sebagai ≥400 CFU/100 mL atau
dengan kualifikasi
beri komentar sebagai “diperkirakan 400 CFU/100 mL.”
Jika bagian 10,0-, 1,0-, dan 0,1-mL diperiksa dengan jumlah
koloni TNTC, 150, dan 92 koliform, masing-masing, kemudian
hitung berdasarkan nilai yang paling dapat diterima dan
laporkan dengan pernyataan kualifikasi sebagai “diperkirakan
92.000 CFU/ 100 mL”:
(92× 100)
= perkiraan 92 000 CFU/100 mL
0,1
Jika bagian 1,0-, 0,3-, 0,1-, dan 0,03-mL diperiksa dengan
jumlah koloni coliform TNTC, TNTC, 78, dan 21, masing-
masing, kemudian jumlahkan total jumlah coliform pada dua
filter terakhir yang dapat dihitung dan dibagi dengan jumlahkan
volumenya untuk mendapatkan nilai akhir yang dilaporkan
sebesar 76.000 CFU/100 mL:
(78+ 21)× 100

= 76 000 CFU/100 mL
(0,1+ 0,03)
Jika bagian 1,0-, 0,3-, dan 0,01-mL diperiksa dengan jumlah

TNTC pada semua bagian, kemudian hitung menggunakan
RHINE, CE & WP CHEEVERS. 1965. Dekontaminasi pemegang filter
membran dengan sinar ultraviolet. J.Amer. Asosiasi Pekerjaan
Air. 57:500.
GELDREICH, EE, HL JETER& RAHANGANTAR. 1967. Pertimbangan
teknis
asi dalam menerapkan prosedur filter membran. Laboratorium
Kesehatan. Sains.
4:113.
WATLING, SDM & RJ WATLING. 1975. Catatan tentang kandungan
logam jejak filter membran. SA Air 1:28.
GELDREICH, EE 1976. Variabilitas kinerja prosedur filter membran.
Pub. Laboratorium Kesehatan. 34:100.
LDI DALAM, SD 1976. Evaluasi filter membran Millipore HA dan HC
untuk pencacahan bakteri indikator. Aplikasi Mengepung.
Mikrobiol. 32:300.
STANDRIDGE, JH 1976. Perbandingan morfologi pori permukaan dua
merek membran filter. Aplikasi Mengepung. Mikrobiol. 31:316.
MENGGUNAKANLINGKUNGANPROTEKSIAGENSI. 1978. Metode
Mikrobiologi untuk Pemantauan Lingkungan Air dan Limbah;
EPA 600/ 8-78-017. Mati. Res. Berkembang., Cincinnati, Ohio.
GRAB, WOK & M.DASPREEZ. 1979. Perbandingan media m-Endo
LES, MacConkey dan Teepol untuk penghitungan filtrasi
membran total bakteri coliform dalam air. Aplikasi Mengepung.
Mikrobiol. 38:351.
DUTKA, BD, red. 1981. Aplikasi, Teknik dan Permasalahan Filtrasi
Membran. Marcel Dekker, Inc., New York, NY
eVANS, TM, RJSEIDLER& MWLeCLEBIH HEVALLIER. 1981. Dampak dari
verifikasi media dan resusitasi terhadap akurasi teknik enumerasi
total coliform membrane filter. Aplikasi Mengepung. Mikrobiol.
41:1144.
FRANZBLAU, SG, BJHINNEBUSCH, TM KELLEY& NA SINCLAIR. 1984.
Pengaruh noncoliforms pada deteksi coliform dalam air tanah
yang dapat diminum: pemulihan yang lebih baik dengan teknik
filter membran anaerobik. Aplikasi Mengepung. Mikrobiol.
48:142.
MCFETER, GA, JSKIPPIN& MWLeCLEBIH HEVALLIER. 1986. Terluka
coliform dalam air minum. Aplikasi Mengepung. Mikrobiol. 51:1.
BRENNER, KP, CC RANKIN, YR ROYBAL, GN STELMA, JR., PV
SCARPINO& AP DUFOUR. 1993. Media baru untuk simultan
TEKNIK FILTER MEMBRAN (9222)/Prosedur Koliform Total Inkubasi Tertunda
deteksi total coliform dan Escherichia coli dalam air. Aplikasi

MENGGUNAKANLINGKUNGANPROTEKSIAGENSI. 2002. Metode 1604:
Mengepung. Mikrobiol. 59:3534. Total coliform dan Escherichia coli dalam air dengan filtrasi
BRENNER, KP, CC RANKIN, MSIVAGANESAN& PV SCARPINO. 1996. membran menggunakan teknik deteksi simultan (media MI); EPA
Perbandingan pemulihan Escherichia coli dan total coliform dari air 821- R-02-024. Mati. Air, Washington, DC
minum dengan metode agar MI dan MENGGUNAKANLINGKUNGANPROTEKSIAGENSI. 2013. Regulasi Air
Metode filter membran yang disetujui Badan Perlindungan Minum Primer Nasional; Revisi Peraturan Total Coliform; Aturan
Lingkungan AS. Aplikasi Mikrobiol Lingkungan. 62:203. Akhir. 40 CFR Bagian 141 dan 142; Diberi makan. Reg. 78:10270.
9222 C. Prosedur Koliform Total Inkubasi Tertunda
Modifikasi teknik MF standar ini memungkinkan pengiriman pecah dalam perjalanan. Dalam keadaan darurat atau saat cawan
atau pengangkutan membran setelah filtrasi ke laboratorium plastik tidak tersedia, gunakan cawan Petri kaca steril yang
yang jauh untuk dipindahkan ke substrat lain, inkubasi, dan dibungkus dengan plastik film atau bahan serupa. (Lihat
penyelesaian pengujian. Tes inkubasi tertunda dapat digunakan 9222B.1e.)
saat
• prosedur konvensional tidak praktis;
• suhu sampel yang diinginkan tidak dapat dipertahankan
selama pengangkutan;
• waktu yang berlalu antara pengumpulan sampel dan analisis
akan melebihi batas waktu yang disetujui; atau
• lokasi pengambilan sampel jauh dari layanan laboratorium
(lihat Bagian 9060B).
Studi independen menggunakan sampel air tawar dan air laut
telah menunjukkan hasil yang konsisten antara inkubasi tertunda
dan tes MF standar. Tentukan penerapan uji inkubasi tertunda
untuk sumber air tertentu dengan membandingkannya dengan
hasil metode MF konvensional.
Untuk melakukan uji penundaan inkubasi, saring sampel di
lapangan segera setelah pengambilan, tempatkan saringan pada
media transportasi, dan kirimkan ke laboratorium. Penentuan
coliform lengkap di laboratorium dengan mentransfer membran
ke m-Endo standar
atau media Endo LES, diinkubasi pada suhu 35 ± 0,5°C selama
20 sampai 22 jam, dan menghitung koloni coliform tipikal dan
atipikal yang berkembang. Untuk sampel air minum yang
dikumpulkan untuk kepatuhan
dengan Peraturan Total Coliform EPA, laporkan ada tidaknya
coliform terverifikasi dalam sampel 100 mL. Verifikasi koloni
seperti yang dijelaskan sebelumnya di 9222B.4g.
Media transportasi dirancang untuk menjaga organisme
coliform tetap hidup dan umumnya tidak memungkinkan
pertumbuhan yang terlihat selama waktu transit. Agen
bakteriostatik dalam media penahan/pengawet menekan
pertumbuhan mikroorganisme dalam perjalanan tetapi
memungkinkan pertumbuhan coliform normal setelah
dipindahkan ke media segar.
Tes inkubasi tertunda mengikuti metode yang diuraikan untuk
prosedur MF coliform total, kecuali seperti yang ditunjukkan di
bawah ini. Dua metode alternatif diberikan: satu menggunakan
media pengawet m-Endo dan yang lainnya menggunakan media
holding m-ST. Jika media yang disiapkan secara komersial tidak
tersedia, siapkan dari masing-masing komponen seperti
dijelaskan dalam 9222B.2a dan 9222C.2b.
a. Hidangan budaya:Gunakan cawan Petri plastik sekali

pakai yang steril (9 × 50 mm) dengan penutup yang rapat.
Wadah seperti itu ringan dan kecil kemungkinannya untuk
TEKNIK FILTER MEMBRAN (9222)/Prosedur Koliform Total Inkubasi Tertunda
b. Unit filtrasi lapangan:Lihat 9222B.1f. Desinfeksi sinar
ultraviolet dapat digunakan di lapangan jika sumber daya
yang sesuai tersedia (115 V, 60 Hz). Unit filtrasi gelas atau
logam dapat disterilkan dengan merendam dalam air mendidih
selama 2 menit. Gunakan air reagen untuk menghindari
endapan air sadah. Gunakan aspirator tangan untuk
mendapatkan vakum yang diperlukan.
c. Bantalan penyerap:Lihat 9222B.1j.
d. Tang:Lihat 9222B.1i.
2. Bahan dan Media Transportasi
a. metode m-Endo:
1) media pengawet m-Endo—Siapkan media m-Endo
seperti dijelaskan dalam 9222B.2b. Setelah didinginkan
hingga <45°C, tambahkan secara aseptik 3,84 g natrium
benzoat [US Pharmacopeia (USP) grade]/L atau 3,2 mL
larutan natrium benzoat 12% ke dalam 100 mL media.
Campur bahan dan dinginkan dituangkan
piring. Buang media yang tidak digunakan setelah 96 jam.
2) larutan natrium benzoat—Larutkan 12 g NaC7H5O2
dalam air reagen secukupnya untuk membuat 100 mL.
Sterilkan dengan autoklaf atau dengan menyaring
melalui filter membran ukuran pori 0,22 µm. Buang
setelah 6 bulan.
3) Sikloheksimid*—Opsional, tambahkan sikloheksimid ke
media pengawet m-Endo. Ini dapat digunakan untuk
sampel yang sebelumnya telah menunjukkan
pertumbuhan berlebih oleh jamur, termasuk ragi. Siapkan
dengan menambahkan secara aseptis 50 mg
cycloheximide/ 100 mL ke media pengawet m-Endo.
Simpan larutan cycloheximide di lemari es, dan buang
setelah 6 bulan. CAUTION: Cycloheximide adalah iritasi
kulit yang kuat. Ikuti petunjuk produsen dan SDS
untuk penanganan dan penyimpanan bahan kimia ini
dengan benar.
b. metode m-ST:
media penahan m-ST:
Natrium fosfat, monobasa (NaH2PO4· H2O) . . . . . . 0,1 g
Dipotassium hidrogen fosfat (K2HPO4) . . . . . . . . . . 3,0 g
Sulfanilamida . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1,5g
Etanol (95%). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .10mL
Tris (hidroksimetil) aminometana. . . . . . . . . . . . . . . . . 3,0 g
air tingkat reagen. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1 L
Larutkan bahan dengan rehidrasi dalam air. Sterilkan

dengan autoklaf pada suhu 121–124°C selama 15 menit. pH
akhir harus 8,6 ±
* Actidione®, diproduksi oleh Upjohn Company, Kalamazoo, MI, atau yang

setara.
TEKNIK FILTER MEMBRAN (9222)/Prosedur Filter Membran Coliform Termotoleran (Fekal)
0,2. Buang sedikitnya 2,0 hingga 3,0 mL (tergantung pada b. Transfer dan inkubasi:Di laboratorium, pindahkan filter
produsen bantalan) ke cawan biakan plastik bertutup rapat yang dari media penampung yang akan dikirim ke cawan Petri steril
berisi bantalan penyerap, dan dengan hati-hati keluarkan kedua yang berisi media m-Endo atau Endo LES dan inkubasi
kelebihan cairan dari bantalan dengan menuang piring. Simpan pada suhu 35 ± 0,5°C selama 20 hingga 22 jam.
piring di lemari es untuk digunakan dalam waktu 96 jam.
3. Prosedur 4. Estimasi Kepadatan Coliform
a. Pengawetan dan pengiriman sampel:Tempatkan bantalan Lanjutkan seperti yang dijelaskan dalam 9222B.5. Catat
penyerap di dasar cawan Petri steril dan jenuh dengan media waktu pengumpulan, penyaringan, dan pemeriksaan
penahan coliform terpilih (lihat 9222C.2). Lepaskan filter laboratorium, dan hitung waktu yang telah berlalu. Laporkan
membran dari unit filtrasi dengan forsep steril dan gulung, waktu yang berlalu dengan hasil koliform.
dengan sisi kisi menghadap ke atas, ke permukaan pad jenuh
sedang. Lindungi membran dari kehilangan kelembapan dengan 5. Bibliografi
menutup rapat cawan Petri plastik. Segel piring yang longgar
dengan selotip yang sesuai† untuk mencegah dehidrasi GELDREICH, EE, PW KABEL, HL JETER& HF CLARK. 1955.A
tes filter membran inkubasi tertunda untuk bakteri coliform dalam
membran selama transit. Tempatkan cawan biakan yang berisi
air. Amer. J.Pub. Kesehatan 45:1462.
membran dalam wadah pengiriman yang sesuai dan kirim ke PANEZAI, AK, TJ MACKLIN& HG COLES. 1965. Coli-aerogen dan
laboratorium untuk penyelesaian pengujian. Sampel dapat Escherichia colimengandalkan sampel air melalui membran yang
ditahan tanpa pertumbuhan yang terlihat selama maksimal 72 diangkut. Proses Soc. Perawatan Air. Ujian. 14:179.
jam pada suhu sekitar pada media penahan/pengawet. BREZENSKI, FT & JA WANTAR. 1969. Penggunaan uji filter membran
Pertumbuhan yang terlihat kadang-kadang dimulai pada media inkubasi tertunda untuk menentukan bakteri koliform dalam air
transportasi ketika suhu tinggi ditemui selama transit. laut. Res air. 3:583.
CINDUK AYAM, M. & PJ HICKEY. 1986. Penghapusan pertumbuhan
berlebih dalam uji filter membran inkubasi tertunda untuk koliform
† Parafilm, Sigma-Aldrich Co. LLC, atau setara. total dengan media penahan M-ST. Aplikasi Mengepung.
Mikrobiol. 52:778.
9222 D. Prosedur Filter Membran Coliform Termoleran (Fekal).
Kepadatan bakteri coliform termotoleran (sebelumnya tinja) d. Wadah untuk media kultur:Lihat 9222B.1d.
dapat ditentukan dengan prosedur multi-tabung atau teknik MF.
(Lihat Bagian 9225 untuk diferensiasi Escherichia coli.)
Prosedur MF coliform termotoleran menggunakan media
laktosa yang diperkaya dan suhu inkubasi 44,5 ±
0,2°C untuk selektivitas. Karena suhu inkubasi sangat kritis,
menenggelamkan biakan MF kedap air (kantong plastik) dalam
penangas air untuk inkubasi pada suhu tinggi atau menggunakan
heat-sink padat yang sesuai atau inkubator lain yang
didokumentasikan untuk menahan suhu pada 44,5°C ± 0,2°C di
seluruh ruangan selama periode 24 jam. Jenis inkubator terbaik
adalah a
penangas air bersirkulasi yang tertutup atap pelana. Secara
umum, metode ini dapat diterapkan pada kondisi yang sama
dengan prosedur koliform termotoleran tabung ganda (lihat
Bagian 9221E).
Ada keterbatasan interpretasi hasil coliform termotoleran dari
air panas (misalnya, daerah tropis) dan sampel limbah pabrik
pulp dan kertas di mana Klebsiella termotoleran telah
mendominasi dan tidak menunjukkan sumber saluran
pembuangan. Seperti semua hasil coliform, survei sanitasi harus
dilakukan untuk mengidentifikasi sumber yang paling masuk
akal dan interpretasi risiko kesehatan masyarakat.

c. Pipet dan silinder ukur:Lihat Bagian 9030B.9.
e. Hidangan budaya:Cawan plastik yang rapat (lihat
9222B.1e) lebih disukai bila cawan kultur MF akan direndam
dalam penangas air selama inkubasi. Tempatkan piring biakan
coliform termotoleran dalam kantong plastik (keluarkan udara
sebanyak mungkin) atau tutup masing-masing piring dengan
selotip tahan air (freezer) untuk mencegah kebocoran selama
perendaman.
f. Unit filtrasi:Lihat 9222B.1f.
g. Filter membran:Lihat 9222B.1g.
h. Bantalan penyerap:Lihat 9222B.1j.
i. Tang:Lihat 9222B.1i.
j. Mandi air atau inkubator:Spesifisitas uji coliform
termotoleran berhubungan langsung dengan suhu inkubasi.
Untuk memenuhi kebutuhan kontrol suhu yang lebih besar,
gunakan penangas air yang tertutup atap pelana, inkubator
heat sink, atau inkubator yang dirancang dan dibangun dengan
benar yang dapat mempertahankan suhu.
toleransi ±0,2°C. Sebagian besar penangas air bersirkulasi
yang dilengkapi dengan atap pelana untuk mengurangi air dan
kehilangan panas dapat mempertahankan suhu 44,5 ± 0,2°C.
Namun, inkubasi udara statis dapat menjadi masalah pada
beberapa jenis inkubator karena potensi panasnya
pelapisan di dalam bilik, perpindahan panas yang lebih lambat
dari udara ke media, dan pemulihan suhu yang lambat setiap
kali inkubator dibuka selama operasi sehari-hari.
2. Bahan dan Media Kultur
media mFC:Kebutuhan akan keseragaman menentukan

penggunaan media dehidrasi. Jangan pernah menyiapkan
media dari bahan-bahan dasar jika tersedia media dehidrasi
yang sesuai. Ikuti petunjuk produsen untuk rehidrasi. Media
cair komersial
(ampula steril, dll.) dapat digunakan jika diketahui memberikan tempatkan bantalan penyerap steril di setiap cawan biakan dan
hasil yang setara. Lihat Bagian 9020 untuk spesifikasi QC. Jika setidak-tidaknya pipet
media yang disiapkan secara komersial tidak tersedia, siapkan 2,0 mL media mFC (disiapkan sesuai petunjuk di atas) hingga
dari masing-masing komponen seperti dijelaskan di bawah ini. jenuh
media mFC:
* Pereaksi asam rosolat akan terurai jika disterilkan dengan autoklaf. Dinginkan
Triptosa ataubiosate10.0........................................................ G larutan stok dalam gelap dan buang setelah 2 minggu, atau lebih cepat jika
warnanya berubah dari merah tua menjadi coklat berlumpur.
Proteosa pepton No.3 ataupolipepton5.0.................................. G
Ragiekstrak3.0......................................................................... G
Laktosa12.5............................................................................ G
Garam empedu No. 3 atau garam empeducampuran1.5........... G
Anilinbiru0.1............................................................................ G
Agar(opsional)15.0................................................................ G
Air tingkat reagen. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 L
Rehidrasi produk atau masing-masing komponen dalam 1 L

air yang mengandung 10 mL asam rosolat 1% dalam NaOH
0,2N.* Panaskan hingga hampir mendidih, segera angkat, dan
dinginkan hingga <50°C. Jangan mensterilkan dengan autoklaf.
Jika menggunakan agar-agar, bagikan 4- sampai 6-mL jumlah
ke piring Petri 9- × 50-mm (kira-kira 4 sampai 5 mm
dalam) dan biarkan mengeras. pH akhir harus 7,4 ± 0,2.
Mendinginkan
media jadi (sebaiknya dalam kantong plastik tertutup atau
lainnya
wadah untuk mengurangi hilangnya kelembapan) dan buang
kaldu yang tidak digunakan setelah 96 jam atau agar-agar yang
tidak digunakan setelah 2 minggu. CATATAN: Untuk sampel
dari sumber yang diketahui memiliki pertumbuhan latar
belakang minimal (misalnya, air minum), penambahan asam
rosolat 1% dapat dihilangkan dari media mFC, tetapi harus
digunakan untuk semua sumber yang tidak diketahui, air hujan,
dan air sekitar. sumber.
Sebelum digunakan, uji kinerja setiap batch media MF yang
disiapkan di laboratorium dengan kultur kontrol positif dan
negatif (Lihat Tabel 9020:VI). Periksa kontaminasi coliform
pada awal dan akhir setiap seri filtrasi dengan menyaring 20
hingga 30 mL pengenceran atau air bilasan melalui filter. Jika
kontrol menunjukkan kontaminasi, tolak semua data dari sampel
yang terpengaruh dan minta sampel baru. Uji setiap lot media
baru untuk memastikan kinerjanya memuaskan (lihat Bagian
9020B.5j). Penggunaan bagan kendali sangat membantu untuk
mengidentifikasi tren dan memastikan konsistensi jangka
panjang dalam kinerja media.
3. Prosedur
a. Pilih ukuran sampel:Pilih volume contoh air yang akan

diperiksa sesuai dengan keterangan pada Tabel 9222:IV.
Gunakan volume sampel yang akan menghasilkan jumlah antara
20 dan 60 koloni coliform termotoleran per membran.
Ketika kepadatan bakteri sampel tidak diketahui, saring
beberapa volume atau pengenceran untuk mendapatkan pelat
yang dapat dihitung. Perkirakan volume dan/atau pengenceran
yang diharapkan menghasilkan membran yang dapat dihitung,
dan pilih dua kuantitas tambahan yang masing-masing mewakili
sepersepuluh dan sepuluh kali (atau sepertiga dan tiga kali)
volume ini.
b. Sampel penyaring:Ikuti prosedur dan tindakan pencegahan
yang sama yang diberikan dalam 9222B.4c.
c. Siapkan hidangan budaya:Menggunakan teknik aseptik,
TMAMPU9222:IV. SDISARANKANSCUKUPVOLUM menghasilkan jumlah MF dalam kisaran yang diinginkan 20
UNTUKMEMBRANFILTERTHERMOTOLERANCOLIFORM sampai 60 koloni coliform termotoleran. Kisaran kepadatan
ATAUe.COLITEst
koloni ini lebih terbatas daripada kisaran total coliform 20
Volume (X) Yang Akan Difilter hingga 80 karena ukuran koloni yang lebih besar pada media
ml mFC. Hitung kepadatan coliform termotoleran seperti yang
diarahkan pada 9222B.5. Catat kepadatan coliform termotoleran
AirSumber100 50 10 1 0,1 0,01 0,001 0,0001
sebagai CFU per 100 mL.
MinumairX
Danau, waduk X X
Sumur, mata air X X
Asupan pasokan air X X X
Air mandi alami X X X
Pabrik pengolahan X X X
limbah
Kolam pertanian, sungai X X X
Limpasan air hujan X X X
Limbah kota mentah X X X
Limpasan feedlot X X X
Lumpur limbah X XX
bantalan. Keluarkan dengan hati-hati kelebihan cairan dari

cawan biakan dengan menuang piring. Setelah filtrasi,
tempatkan filter sampel secara aseptik pada bantalan yang
diresapi medium [lihat 9222B.2b2)].
Sebagai substitusi substrat untuk bantalan penyerap jenuh
nutrisi, tambahkan agar 1,5% ke dalam kaldu mFC [lihat
9222B.2b1)].
d. Menetaskan:Tempatkan piring yang sudah disiapkan
dalam kantong plastik tahan air, keluarkan udara sebanyak
mungkin, tutup, balikkan, dan rendam cawan Petri dalam bak
air; inkubasi selama 24 ± 2 jam pada suhu 44,5 ± 0,2°C.
Jangkar piring di bawah permukaan air; jika perangkat
jangkar (misalnya cincin "O", batu bata, atau botol air) juga
akan terendam, pastikan
mereka dihangatkan sebelum penggunaan sampel, cukup kecil
untuk mempertahankan persyaratan suhu kritis, dan tidak
mengganggu inkubasi sampel. Tempatkan semua biakan yang
sudah disiapkan di bak air dalam waktu 30 menit setelah
penyaringan. Sebagai alternatif, gunakan heat sink padat yang
tepat dan akurat atau inkubator yang setara. Jangan
menenggelamkan pelat dalam wadah plastik bersisi keras
tahan air; ruang udara ekstra tidak memungkinkan pelat
mencapai suhu selama berjam-jam.
e. Perhitungan:Koloni yang dihasilkan oleh bakteri coliform
termotoleranteria pada media mFC adalah berbagai nuansa
biru. Koloni koliform non-termolleran berwarna abu-abu
hingga krem. Biasanya, beberapa koloni koliform non-
termotoleran akan diamati pada media mFC karena
peningkatan suhu dan penambahan rosolic.
reagen garam asam memilih melawan mereka. Hitung koloni
dengan mikroskop binokular berdaya rendah (perbesaran 10
hingga 15x) atau perangkat optik lainnya, jika diperlukan.
f. Verifikasi:Verifikasi pada frekuensi yang ditentukan oleh
laboratorium. Verifikasi koloni biru tipikal dan koloni abu-
abu hingga hijau atipikal (lihat Bagian 9020B.10) untuk
analisis koliform termotoleran. Inokulasi simultan ke dalam
lauril triptosa berkekuatan tunggal dan kaldu EC (atau kaldu
EC-MUG) yang masing-masing diinkubasi pada suhu 35 dan
44,5°C, dapat diterima selama verifikasi.
4. Perhitungan Densitas Coliform Termoleran
a. Umum:Hitung kepadatan dari jumlah sampel yang
TEKNIK FILTER MEMBRAN (9222)/Tertunda-Inkubasi Prosedur Coliform Termoleran (Feses)
b. Sampel sedimen dan biosolid:Untuk padatan total (basis 5. Referensi

berat kering), lihat Bagian 2540G. Hitung coliform termotoleran
per gram berat kering untuk analisis biosolid sebagai berikut: 1. USELINGKUNGANPROTEKSIAGENSI. 1993. Standar Penggunaan atau
Pembuangan Lumpur Limbah: Aturan Akhir. 40 CFR Bagian 503;
Coliform termotoleran, CFU/g berat kering Diberi makan. Reg. 58:9248.
koloni dihitung 6. Daftar Pustaka

=
(pengenceran dipilih) × (%
padatan kering) GELDREICH, EE, HF CLARK, CBHUFF& LC BEst. 1965. Tinja-
media organisme coliform untuk teknik filter membran.
di mana pengenceran dan % padatan kering dinyatakan dalam J.Amer. Asosiasi Pekerjaan Air. 57:208.
bentuk desimal. ROSE, RE, EE GELDREICH& W.LITSKY. 1975. Peningkatan membran
Contoh 1: Analis mengamati 22 koloni pada pelat metode filter untuk analisis koliform tinja. Aplikasi Mikrobiol.
pengenceran 1:10 000 biosolid dengan 4% padatan kering. 29:532.
22 LDI DALAM, SD 1976. Metode filter membran untuk pemulihan fecal
= 5,5 × 106 CFU/g berat coliform dalam limbah limbah terklorinasi. Aplikasi Mengepung.
(0,0001) kering Mikrobiol. 32:547.
(0,04)
Jika tidak ada filter yang memiliki jumlah koliform PRESWOOD, WG & DK STONG. 1978. Modifikasi media MFC dengan
termotoleran yang berada dalam kisaran ideal (20 hingga 60), menghilangkan asam rosolat. Aplikasi Mengepung. Mikrobiol.
totalkan jumlah koliform termotoleran pada semua filter yang 36:90.
dapat dihitung, dan laporkan sebagai koliform termotoleran per GHIJAU, BL, W.LITSKY& KJ SLADEK. 1980. Evaluasi metode filter
membran untuk pencacahan coliform feses dari perairan laut.
gram berat kering: Mar.Lingkungan. Res. 67:267.
Contoh 2: Analis mengamati 18 koloni pada pelat SARTORY, DP 1980. Filtrasi membran penentuan coliform tinja dengan
pengenceran 1:10.000 dan 2 koloni pada pelat pengenceran media MFC yang tidak dimodifikasi dan dimodifikasi. Air SA
1:100.000 dari sampel biosolid dengan 4% padatan kering. 6:113.
GRAB, WOK, CA HILNER& P.COUBROUGH. 1981. Evaluasi
(18+ 2) media MFC, MacConkey, dan Teepol standar dan termodifikasi
= 4,5 × 106 untuk penghitungan filter membran fecal coliform dalam air.
(0,0001+ 0,00001) (0,04) Aplikasi Mengepung. Mikrobiol. 42:192.
RYCHERT, RC & GR STEPHENSON. 1981. Escherichia coli atipikal di
Untuk menghitung rata-rata geometris sampel, ubah densitas sungai. Aplikasi Mengepung. Mikrobiol. 41:1276.
coliform termotoleran dari setiap sampel menjadi nilai log10. PAGEL, JE, AAQURESHI, DM YOUNG& LTVLASSOFF. 1982. Kom-
Tentukan rata-rata geometrik untuk jumlah sampel yang parison dari empat metode filter membran untuk pencacahan fecal
diberikan† dengan merata-ratakan nilai log10 kepadatan coliform. Aplikasi Mengepung. Mikrobiol. 43:787.
coliform termotoleran dan mengambil antilog dari nilai tersebut. MENGGUNAKANLINGKUNGANPROTEKSIAGENSI. 1992. Peraturan dan
Teknologi Lingkungan. Pengendalian Patogen dan Daya Tarik
Vektor di Lumpur Limbah; EPA-626/R-92-013. Washington DC
† Biasanya tujuh jika mengumpulkan untuk Aturan Pengurangan Patogen EPA,
40 CFR Bagian 503.1
9222 E. Prosedur Koliform Termotoleran (Fekal) Inkubasi Tertunda
Prosedur penundaan inkubasi ini serupa dengan prosedur total laboratorium. Menyelesaikan
coliform penundaan inkubasi (9222C). Gunakan tes ini hanya
ketika tes coliform termotoleran langsung standar tidak dapat
dilakukan (misalnya, jika inkubator lapangan yang sesuai tidak
tersedia atau keadaan menunjukkan bahwa layanan laboratorium
khusus disarankan untuk memeriksa, mengkonfirmasi, atau
menspesiasi koloni yang dicurigai).
Hasil yang diperoleh dengan metode tertunda ini telah
konsisten dengan hasil dari uji MF coliform termotoleran (fekal)
standar di bawah berbagai kondisi penggunaan laboratorium dan
lapangan. Namun, tentukan penerapan uji untuk sumber air
tertentu dengan membandingkannya dengan uji MF standar,
terutama untuk air asin, air limbah yang diklorinasi, dan air
yang mengandung zat beracun.
Untuk melakukan uji penundaan inkubasi, saring sampel di
lapangan segera setelah pengambilan, tempatkan saringan pada
media penahan m-ST (lihat 9222C.2b), dan kirim ke
uji thermotoleran coliform dengan mentransfer filter ke media
mFC, inkubasi pada suhu 44,5°C selama 24 ± 2 jam, dan
menghitung koloni coliform termotoleran.
Media m-ST membuat organisme coliform termotoleran
tetap hidup tetapi mencegah pertumbuhan yang terlihat
selama transit. Filter membran dapat ditahan hingga 3 hari
pada media penahan m-ST dengan sedikit efek pada jumlah
coliform termotoleran.
a. Hidangan budaya:Lihat 9222B.1e.

b. Unit filtrasi lapangan:Lihat 9222B.1f.
c. Bantalan penyerap:Lihat 9222B.1j.
d. Tang:Lihat 9222B.1i.
2. Bahan dan Media Transportasi
a. media m-ST:Persiapkan seperti yang dijelaskan dalam

9222C.2b.
b. media mFC:Persiapkan seperti yang dijelaskan dalam
9222D.2.
TEKNIK FILTER MEMBRAN (9222)/KlebsiellaProsedur Filter Membran
3. Prosedur
koloni berwarna abu-abu hingga krem. Hitung koloni dengan
mikroskop binocular wide-field dissecting pada pembesaran 10
a. Transportasi filter membran:Menggunakan teknik aseptik, sampai 15x.
tempatkan bantalan penyerap dalam cawan Petri plastik dengan e. Verifikasi:Verifikasi koloni pada frekuensi yang ditetapkan
penutup yang rapat dan jenuh dengan media penahan m-ST. oleh laboratorium. Verifikasi koloni biru tipikal dan koloni
Setelah menyaring sampel, lepaskan filter membran dari unit atipikal (abu-abu hingga hijau) seperti yang dijelaskan pada
filtrasi dan letakkan di atas bantalan jenuh sedang. Gunakan Bagian 9020B.10 untuk analisis coliform termotoleran.
hanya piring yang tertutup rapat untuk mencegah hilangnya
kelembapan tetapi hindari kelebihan cairan di piring. Tempatkan
piring kultur yang berisi filter dalam wadah pengiriman yang 4. Estimasi Densitas Coliform Termoleran
sesuai dan kirim ke laboratorium. Membran dapat ditahan pada
media transpor pada suhu sekitar selama maksimal 72 jam Hitung seperti yang diarahkan pada 9222D.3e dan hitung
dengan sedikit efek pada jumlah coliform termotoleran. densitas koliform termotoleran seperti dijelaskan pada 9222D.4.
b. Transfer:Di laboratorium, secara aseptis keluarkan Catat waktu pengumpulan, penyaringan, dan pemeriksaan
membran dari media penahan dan letakkan di cawan lain yang laboratorium, serta hitung dan laporkan waktu yang berlalu.
berisi media mFC.
c. Inkubasi:Setelah memindahkan filter ke media mFC, 5. Bibliografi
tempatkan cawan berpenutup rapat dalam kantong plastik tahan
air, balikkan, dan rendam dalam penangas air pada suhu 44,5 ± CINDUK AYAM, M. & PJ HICKEY. 1983. Modifikasi prosedur inkubasi
0,2°C selama 24 ± 2 jam, atau gunakan heat-sink padat atau tertunda untuk deteksi koliform tinja dalam air. Aplikasi
inkubator yang setara. Mengepung. Mikrobiol. 46:889.
d. Perhitungan:Koloni yang dihasilkan oleh bakteri coliform
termotoleran berwarna biru. Coliform non-termotoleran
9222 F.KlebsiellaProsedur Filter Membran
Klebsiellabakteri termasuk dalam famili Enterobacteriaceae 2. Bahan dan Media Kultur

dan termasuk dalam kelompok total coliform. Klebsiella spp.
diekskresikan dalam tinja banyak manusia dan hewan yang a. mFCIC agar:Media ini mungkin tidak tersedia dalam
sehat, dan mudah terdeteksi di perairan yang tercemar limbah. bentuk dehidrasi dan mungkin memerlukan persiapan dari bahan
Sekitar 60 sampai 80% dari semua Klebsiella dari feses dan dari dasar:
spesimen klinis positif dalam uji coliform termotoleran dan
Klebsiella pneumoniae. Triptosa ataubiosate10.0........................................................ G
Klebsiellabakteri juga tersebar luas di alam, terjadi di tanah, air, Proteosa pepton No.3 ataupolipepton5.0.................................. G
biji-bijian, tumbuh-tumbuhan, dll. Pulp kayu, pabrik kertas, pabrik Ragiekstrak3.0......................................................................... G
finishing tekstil, dan operasi pengolahan tebu mengandung sejumlah
Inositol10.0............................................................................ G
besar Klebsiella spp. dalam limbahnya (104 hingga 106 per 100 mL),
Garam empedu No. 3 atau garam empeducampuran1.5........... G
dan Klebsiella spp. adalahseringkali coliform dominan dalam
Anilinbiru0.1............................................................................ G
limbah tersebut.
Agar15.0................................................................................. G
Kuantisasi cepat dapat dicapai dalam prosedur MF dengan
memodifikasi basis agar mFC melalui substitusi inositol untuk
laktosa dan menambahkan karbenisilin atau dengan Panaskan media hingga mendidih, dan tambahkan 10 mL
menggunakan agar mKleb. Metode ini mengurangi kebutuhan asam rosolat 1%* yang dilarutkan dalam NaOH 0,2 N.
untuk pengujian biokimia strain murni. Verifikasi awal dari Dinginkan hingga <45°C, dan tambahkan 50 mg carbenicillin.†
Buang secara aseptik dalam jumlah 4 hingga 6 mL ke dalam
koloni yang berdiferensiasi direkomendasikan. cawan Petri plastik 9- × 50 mm (perkiraan kedalaman 4 hingga
5 mm). Dinginkan sampai dibutuhkan. Buang media agar yang
tidak terpakai
1. Peralatan Laboratorium setelah 2 minggu. Jangan mensterilkan dengan autoklaf. pH
akhir harus 7,4 ± 0,2.
a. Botol sampel:Lihat Bagian 9030B.19. b. mKleb agar:
b. Botol pengenceran:Lihat Bagian 9030B.13. fenol merahagar31.0............................................................... G
c. Pipet dan silinder ukur:Lihat 9222B.1c. Adonitol5.0.............................................................................. G
d. Wadah untuk media kultur:Lihat 9222B.1d. Anilinbiru0.1............................................................................ G
e. Hidangan budaya:Lihat 9222B.1e. Natrium laurilsulfat0.1............................................................. G
f. Unit filtrasi:Lihat 9222B.1f. Air tingkat reagen. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 L
g. Filter membran:Lihat 9222B.1g.
h. Bantalan penyerap:Lihat 9222B.1j.
i. Tang:Lihat 9222B.1i. * Pereaksi asam rosolat akan terurai jika disterilkan dengan autoklaf. Dinginkan
larutan stok dalam gelap dan buang setelah 2 minggu, atau lebih cepat jika
j. Inkubator:Lihat 9222B.1j. warnanya berubah dari merah tua menjadi coklat berlumpur.
† Tersedia dari Geopen, Roerig-Pfizer, Inc., New York, NY.
TEKNIK FILTER MEMBRAN (9222)/Mempartisi Coliform Termoleran dari MF Total Coliform Menggunakan EC Broth
ornitin dekarboksilase (negatif), dan urease (positif). Strain

Sterilkan dengan autoklaf selama 15 menit pada suhu 121– Klebsiella yang indole-positif, mencairkan pektin, dan
124°C. Setelah autoklaf, dinginkan hingga 50°C dalam menunjukkan respons koliform termotoleran negatif
penangas air; tambahkan 20 mL etil alkohol 95% (tidak kemungkinan besar berasal dari nonfekal.
didenaturasi) dan 0,05 g karbenisilin/L steril-filter. Kocok
secara menyeluruh dan buang secara aseptik ke dalam 9-×
4. Bibliografi
Pelat biakan plastik 50 mm. PH akhir harus 7,4 ± 0,2.
Media yang didinginkan dapat disimpan selama 20 hari pada
suhu 4 hingga 8°C. DUNCAN, DW & KAMI RAZELL. 1972. Biotipe Klebsiella di antara
coliform yang diisolasi dari lingkungan hutan dan hasil pertanian.
Aplikasi Mikrobiol. 24:933.
3. Prosedur STRAMER, SL 1976. Identifikasi dugaan Klebsiella pneumoniae pada
media M-FC. Bisa. J. Mikrobiol. 22:1774.
a. Pemilihan ukuran sampel dan filtrasi:Lihat 9222B.4 untuk BAGLEY, ST & RJ SEIDLER. 1977. Signifikansi fecal coliform-positif
pemilihan ukuran sampel dan prosedur filtrasi. Pilih volume Klebsiella. Aplikasi Mengepung. Mikrobiol. 33:1141.
sampel yang akan menghasilkan jumlah antara 20 dan 60 koloni KNITTEL, MD, RJSEIDLER, C.EOLEH& LM CABE. 1977. Kolonisasi
Klebsiella per membran. Tempatkan filter membran pada lingkungan botani oleh isolat Klebsiella yang berasal dari patogen.
permukaan agar; inkubasi selama 24 ± 2 jam pada suhu 35 ± Aplikasi Mengepung. Mikrobiol. 34:557.
0,5°C. Koloni Klebsiella aktif eDMONSON, SEBAGAI, EM CBaiklah, APD WILCOCK& R.SHINEBAUM. 1980.A
agar mFCIC berwarna biru atau abu-abu kebiruan. Sebagian perbandingan sifat Klebsiella diisolasi dari sumber yang berbeda.
besar koloni atipikal adalah J.Med. Mikrobiol. (Inggris) 13:541.
coklat atau kecoklatan. Kejadian positif palsu sesekali SMIT, RB 1981. Evaluasi Kritis Media untuk Identifikasi Selektif dan
disebabkan oleh spesies Enterobacter. Koloni Klebsiella pada Penghitungan Klebsiella. Skripsi MS, Jurusan Teknik Sipil &
agar mKleb berwarna biru tua hingga biru abu-abu; koloni lain Lingkungan, Univ. Cincinnati, Ohio.
paling sering berwarna merah muda atau terkadang kuning NIEMELA, SI & P.VAATANEN. 1982. Kelangsungan hidup Klebsiella
pneumoniae di air danau yang dibuang oleh pabrik kertas. Aplikasi
pucat. Menghitung koloni dengan pembesaran teropong berdaya
Mengepung. Mikrobiol. 44:264.
rendah (10 hingga 15×) teropong GELDREICH, EE & EW RES. 1987. Kemunculan, signifikansi, dan deteksi
mikroskop atau alat optik lainnya.
Klebsiella dalam sistem air. J.Amer. Asosiasi Pekerjaan Air. 79:74.
b. Verifikasi:Verifikasi koloni Klebsiella dari kumpulan DUNCAN, IBR 1988. Klebsiella ditularkan melalui air dan penyakit
sampel pertama dari perairan sekitar dan limbah, dan saat manusia. Penilaian Toksisitas. 3:581.
Klebsiella dicurigai dalam sistem distribusi pasokan air.
Verifikasi minimal lima koloni tipikal dengan mentransfer
pertumbuhan dari koloni atau biakan murni ke sistem uji multi
komersial untuk spesiasi Gram-negatif. Tes kunci untuk
Klebsiella adalah sitrat (positif), motilitas (negatif), lisin
dekarboksilase (positif),
9222 G. Mempartisi Coliform Termoleran dari MF Total Coliform Menggunakan EC Broth
Dalam sampel air minum, penentuan coliform termotoleran dengan menggunakan jarum steril. Lihat 9222B.4g untuk prosedur
dapat dilakukan dari filter MF total-coliform-positif dalam verifikasi total coliform.
waktu 24 jam. Teknik ini mungkin berlaku untuk perairan lain
jika diperlukan.
Lihat 9222B.1a–j.
Kaldu EC:Lihat Bagian 9221E.1a.
3. Prosedur
a. Pemilihan ukuran sampel dan prosedur filtrasi:Lihat

9222B.4.
b. Verifikasi coliform total:Verifikasi total coliform sebelum
menggunakan metode partisi coliform termotoleran. Usap
pertumbuhan permukaan pada filter total-coliform-positif atau, jika
dihitungdiinginkan, pindahkan sebagian kecil dari setiap koloni
target pada filter ke media verifikasi total coliform yang sesuai
c. Metode partisi untuk penentuan coliform
termotoleran:Dengan menggunakan teknik aseptik, pindahkan
koloni total-coliform-positif dari filter membran ke tabung
yang berisi media EC dengan salah satu metode berikut:
• keluarkan membran yang mengandung koloni coliform
total dari substrat dengan tang steril dan dengan hati-hati
menggulung dan masukkan membran ke dalam tabung
media EC (jangan tabung vortex untuk menghindari
masuknya gelembung udara ke botol terbalik,
• usap seluruh permukaan membran filter dengan kapas
steril dan pindahkan inokulum ke media EC (jangan
biarkan kapas di dalam media), atau
• jika kuantifikasi diinginkan, inokulasi koloni total
coliform-positif individu ke dalam tabung EC terpisah.
Inokulasi simultan uji verifikasi total-coliform dan kaldu
EC dapat diterima (urutan inokulasi harus selalu kaldu
EC terlebih dahulu baru kemudian media penghambat
lainnya).
Inkubasi tabung dalam inkubator penangas air 44,5 ± 0,2°C
dalam waktu 30 menit setelah inokulasi. Pertahankan
kedalaman air yang cukup di
inkubator untuk membenamkan tabung ke tingkat media yang
lebih tinggi. Produksi gas dalam biakan EC broth (9221E.1a)
dalam ≤24 jam dianggap sebagai respons positif untuk bakteri
coliform termotoleran.
TEKNIK FILTER MEMBRAN (9222)/PartisiE.colidari MF Total Coliform menggunakan Kaldu EC-MUG
4. Bibliografi
Mmakan, A. & M.SHAFER. 1992. Penentuan kuantitatif Escherichia coli
dari coliform dan fecal coliform dalam air laut. Mikrobios 71:27.
Mmakan, A.& M.SHAFER. 1989. Diferensiasi membran filtrasi E. coli dari SARTORY, D. & L.HAWARD. 1992. Suatu media pendeteksi beta-
coliform dalam pemeriksaan air. J.Appl. Bakteri. 67:343.
glukuronidase untuk pencacahan filtrasi membran simultan
MENGGUNAKANLINGKUNGANPROTEKSIAGENSI. 1989. Air Minum;
Escherichia coli dan koliform dari air minum. Lett. Aplikasi
Peraturan Air Minum Primer Nasional; Total Coliform (Termasuk
Mikrobiol. 15:273.
Fecal Coliform dan E. coli); Aturan Akhir. 40 CFR Bagian 141 dan
142; Diberi makan. Reg. 54:27544. MENGGUNAKANLINGKUNGANPROTEKSIAGENSI. 2013. Regulasi Air
MENGGUNAKANLINGKUNGANPROTEKSIAGENSI. 1991. Peraturan Air Minum Primer Nasional; Revisi Peraturan Total Coliform; Aturan
Minum Primer Nasional; Teknik Analisis; Bakteri Coliform. 40 Akhir. 40 CFR Bagian 141 dan 142; Reg Fed. 78:10270.
CFR Bagian 141; Diberi makan. Reg. 56:636.
9222 H. Mempartisi E. coli dari MF Total Coliform menggunakan Kaldu EC-MUG
Escherichia coliadalah anggota kelompok bakteri koliform media EC-MUG,

termotoleran; kehadirannya merupakan indikasi kontaminasi
tinja. Kuantisasi cepat dan verifikasi untuk E. coli dapat dicapai
untuk sampel MF total-coliform- atau termotoleran-coliform-
positif dengan menggunakan media yang mengandung 4-
methylumbelliferyl-β-D-glucuronide (MUG). Dalam metode ini,
E. coli didefinisikan sebagai setiap coliform yang menghasilkan
enzim β-D-glukuronidase dan menghidrolisis substrat MUG
untuk menghasilkan fluoresensi biru.
Saat memeriksa sampel air minum, gunakan salah satu dari
dua metode partisi untuk menentukan keberadaan E. coli dari
sampel MF total-coliform-positif pada media tipe Endo: agar
nutrisi yang mengandung MUG (9222I) atau EC yang
mengandung MUG. Saat memeriksa air limbah dan sampel air
yang tidak dapat diminum lainnya, gunakan salah satu metode
partisi untuk menentukan keberadaan E. coli dari sampel MF
termotoleran (fecal)-coliform-positif pada media mFC.
a. Melihat9222B.1a– k.
b. lampu ultraviolet,gelombang panjang (365–366 nm), 6 W.
Lihat Bagian 9030B.23.
Kaldu EC dengan MUG (EC-MUG):Lihat Bagian 9221F.1.
3. Prosedur

9222B.4.
b. Verifikasi coliform total:Verifikasi total coliform sebelum
menggunakan metode partisi E. coli. Usap pertumbuhan
permukaan pada filter total-coliform-positif atau, jika
kuantifikasi diinginkan, pindahkan sebagian kecil dari setiap
koloni target pada filter ke media verifikasi total coliform yang
sesuai dengan menggunakan jarum steril. Lihat 9222B.4g untuk
prosedur verifikasi total coliform.
c. Metode partisi untukPenentuan E. coli: Gunakan teknik
aseptik untuk memindahkan koloni total coliform-positif pada
filter membran ke tabung yang berisi media EC-MUG dengan
salah satu metode berikut:
• keluarkan membran yang mengandung koloni coliform total
dari substrat dengan tang steril dan dengan hati-hati
menggulung dan memasukkan membran ke dalam tabung
• swab seluruh permukaan membrane filter dengan cotton
bud steril dan pindahkan inokulum ke media EC-MUG
(jangan tinggalkan cotton bud di media EC-MUG), atau
• jika kuantifikasi diinginkan, inokulasikan masing-masing
koloni total coliform-positif ke dalam tabung EC-MUG
yang terpisah.
Inkubasi media EC-MUG pada suhu 44,5 ± 0,2°C selama
24 ± 2 jam. Tempatkan semua tabung EC-MUG dalam
inkubator penangas air dalam waktu 30 menit setelahnya
inokulasi. Pertahankan kedalaman air yang cukup dalam
inkubator untuk membenamkan tabung ke tingkat media yang
lebih tinggi.
Amati tabung EC-MUG menggunakan sumber sinar UV
dengan panjang gelombang panjang (365–366 nm), lebih
disukai yang mengandung bola lampu 6-W. PERHATIAN:
Lampu UV tidak boleh dilihat secara langsung. Sebaiknya
lihat tabung dalam kotak penglihatan atau pegang sinar UV
beberapa inci di depan tabung (misalnya, 3 sampai 4 inci),
menghadap jauh dari penampil. Selain itu, menggunakan
lampu UV yang dilengkapi dengan filter khusus untuk
menghilangkan sebagian besar interferensi cahaya tampak
diinginkan dan akan memfasilitasi penentuan fluoresensi.
Adanya fluoresensi biru terang di dalam tabung merupakan
respon positif bagi E. coli. Catat ada tidaknya fluoresensi.
Untuk sampel air yang tidak dapat diminum, metode partisi
ini dapat digunakan untuk menentukan
E.colidari prosedur MF coliform termotoleran menggunakan
media mFC untuk isolasi awal sebelum dipindahkan ke media
EC-MUG. Prosedurnya sama dengan di atas, kecuali untuk
proses verifikasi total coliform.
Kontrol positif yang terdiri dari kultur E. coli (MUG-positif)
yang diketahui, kontrol negatif yang terdiri dari kultur
Klebsiella pneumoniae (MUG-negatif) yang termotoleran, dan
media yang tidak diinokulasikontrol mungkin diperlukan untuk
menginterpretasikan hasil sampel dan menghindari kesalahan
identifikasi autofluoresensi kuning-biru media yang lemah
sebagai respons positif. (Lihat Bagian 9221F.)
4. Bibliografi
Mmakan, A. & M.SHAFER. 1989. Diferensiasi filtrasi membran

E.colidari coliform dalam pemeriksaan air. J.Appl. Bakteriol.
67:343.
Peraturan Air Minum Primer Nasional; Total Coliform
(Termasuk Fecal Coliform dan E. coli); Aturan Akhir. 40 CFR
Bagian 141 dan 142; Diberi makan. Reg. 54:27544.
MENGGUNAKANLINGKUNGANPROTEKSIAGENSI. 1991. Peraturan Air
Minum Primer Nasional; Teknik Analisis; Bakteri Coliform. 40
TEKNIK FILTER MEMBRAN (9222)/PartisiE.colidari MF Total Coliforms menggunakan NA-MUG Agar
SARTORY, D. & L.HAWARD. 1992. Media pendeteksi beta-glukuronidase

Escherichia colidan coliform dari air minum. Lett. Aplikasi
untuk pencacahan filtrasi membran simultan
Mikrobiol. 15:273.
9222 I. Partisi E. coli dari MF Total Coliforms menggunakan NA-MUG Agar
Escherichia coliadalah anggota kelompok bakteri koliform pada filter ke

termotoleran; kehadirannya merupakan indikasi kontaminasi
tinja. Kuantisasi cepat dan verifikasi untuk E. coli dapat dicapai
untuk sampel MF total-coliform- atau termotoleran-coliform-
positif dengan menggunakan media yang mengandung 4-
methylumbelliferyl-β-D-glucuronide (MUG). Dalam metode ini,
E. coli didefinisikan sebagai setiap coliform yang menghasilkan
enzim β-glukuronidase dan menghidrolisis substrat MUG untuk
menghasilkan fluoresensi biru.
Saat memeriksa sampel air minum, gunakan salah satu dari
dua metode partisi untuk menentukan keberadaan E. coli dari
sampel MF total-coliform-positif pada media tipe Endo;
gunakan agar nutrisi yang mengandung MUG atau kaldu EC
yang mengandung MUG (9222H). Saat memeriksa air limbah
dan sampel air yang tidak dapat diminum lainnya, gunakan
salah satu metode partisi untuk menentukan keberadaan E. coli
dari sampel MF termotoleran (fecal)-coliform-positif pada
media mFC.
a. Hidangan budaya:Lihat 9222B.1e.

b. Unit filtrasi:Lihat 9222B.1f.
c. Tang:Lihat 9222B.1i.
d. Inkubator:Lihat 9222B.1j.
e. lampu ultraviolet,gelombang panjang (365–366 nm), 6 W:
Lihat Bagian 9030B.23.
f. Mikroskop dan sumber cahaya:Lihat 9222B.1k.
Agar nutrisi dengan MUG (NA-MUG):

Pepton5.0................................................................................. G
Daging sapiekstrak3.0.............................................................. G
Agar15.0................................................................................ G
4-metilumbelliferil-β-D-glukoronida0.1................................... G
Tambahkan bahan dehidrasi ke air tingkat reagen, aduk rata,

dan panaskan hingga larut. Sterilkan dengan autoklaf selama 15
menit pada suhu 121–124°C. Buang jumlah 4- hingga 6-mL
secara aseptik ke dalam piring kultur plastik berukuran 50 mm
(perkiraan kedalaman 4 hingga 5 mm)
dan biarkan memadat. pH akhir harus 6,8 ± 0,2. Media yang
didinginkan dapat disimpan selama 2 minggu.
3. Prosedur

9222B.4.
b. Verifikasi coliform total:Untuk sampel air minum yang
menggunakan media tipe Endo, prosedur verifikasi total
coliform dapat dilakukan sebelum atau sesudah metode partisi.
Usap pertumbuhan permukaan pada filter atau, jika kuantifikasi
diinginkan, pindahkan sebagian kecil dari setiap koloni target
media verifikasi total coliform yang sesuai menggunakan
jarum steril. Alternatifnya, setelah mentransfer filter ke media
NA-MUG, menginkubasinya, dan membaca hasilnya pada
media ini, baik mentransfer koloni individual, pertumbuhan
permukaan swab pada filter, atau menempatkan seluruh filter
ke dalam media verifikasi coliform total yang sesuai. (Lihat
9222B.4g untuk prosedur verifikasi total coliform.)
c. Metode partisi untuk penentuan E. coli:Pindahkan filter
membran secara aseptik dengan setidaknya satu koloni positif
coliform ke pelat NA-MUG. Jika kuantifikasi diinginkan,
tandai setiap koloni kemilau (misalnya, gunakan pena ujung
halus untuk menandai lokasi koloni kemilau pada tutup dan
orientasi filter/tutup) dan pindahkan tutup ke pelat NA-MUG,
atau gunakan jarum steril untuk membuat lubang. filter
membran di sebelah koloni kemilau setelah mentransfer
membran ke media NA-MUG. Segera inkubasi NA-MUG
setelah transfer pada 35 ± 0,5 ° C selama 4 jam.
Amati setiap koloni (di piring NA-MUG) menggunakan a
panjang gelombang panjang (365-366-nm) sumber sinar UV,
lebih disukai mengandung bohlam 6-W. PERHATIAN:
Lampu UV tidak boleh dilihat secara langsung. Sebaiknya
lihat pelat dalam kotak penglihatan atau pegang sinar UV
beberapa inci di atas pelat (misalnya, 3 hingga 4 inci),
menghadap jauh dari penampil. Kehadiran fluoresensi biru
cerah di pinggiran (tepi luar) dari koloni, atau diamati dari
belakang piring merupakan respon positif untuk
E.coli. Catat ada tidaknya fluoresensi, atau jika kuantifikasi
diinginkan, hitung dan catat jumlah koloni target. Untuk
sampel air yang tidak dapat diminum, metode partisi ini dapat
digunakan untuk menentukan E. coli dari prosedur MF
coliform termotoleran menggunakan media mFC untuk isolasi
awal sebelum dipindahkan ke media NA-MUG. Prosedurnya
sama dengan di atas, kecuali untuk proses verifikasi total
coliform.
4. Bibliografi
Mmakan, A. & M.SHAFER. 1989. Diferensiasi filtrasi membran

E.colidari coliform dalam pemeriksaan air. J.Appl. Bakteriol.
67:343.
Peraturan Air Minum Primer Nasional; Total Coliform
(Termasuk Fecal Coliform dan E. coli); Aturan Akhir. 40 CFR
Bagian 141 dan 142; Diberi makan. Reg. 54:27544.
MENGGUNAKANLINGKUNGANPROTEKSIAGENSI. 1991. Peraturan Air
Minum Primer Nasional; Teknik Analisis; Bakteri Coliform. 40
SARTORY, D. & L.HAWARD. 1992. Media pendeteksi beta-
glukuronidase untuk penghitungan filtrasi membran simultan
Escherichia coli dan koliform dari air minum. Lett. Aplikasi
Mikrobiol. 15:273.
SHADIX, LC, SAYA DUNNIGAN& EW RES. 1993. Deteksi Pelarian
richia colioleh agar nutrisi ditambah 4-methylumbelliferyl-β- D-
metode filter membran glucuronide (MUG). Bisa. J. Mikrobiol.
39:1066.
TEKNIK MEMBRANE FILTER (9222)/Deteksi Simultan Total Coliform danE.colidengan Prosedur Filter Membran Ganda-Kromogen
9222 J. Deteksi Simultan Total Coliform dan E. coli dengan Prosedur Filter Membran Dual-
Chromogen
PERHATIAN: Natrium azida sangat beracun dan
mutagenik. Ikuti petunjuk produsen dan SDS untuk
Untuk analisis MF, gunakan peralatan gelas dan peralatan lain penyimpanan dan penanganan yang tepat dari media ini.
yang terbuat dari bahan yang bebas dari bahan yang dapat Campur kaldu dengan lembut dengan membalik ampul dua
mempengaruhi pertumbuhan bakteri. atau tiga kali sebelum mengeluarkan. Tuang media cair (kira-
a. Botol sampel:Lihat Bagian 9030B.19. kira 2 mL per piring) secara merata ke atas bantalan penyerap
b. Botol pengenceran:Lihat Bagian 9030B.13. steril dan tutup cawan Petri. pH akhir harus 7,0 ± 0,2.
c. Pipet, wadah sampel, dan silinder ukur:Lihat Bagian
9030B.9. 3. Prosedur
d. Hidangan budaya:Lihat 9222B.1e.
e. Unit filtrasi:Lihat 9222B.1f. a. Pemilihan ukuran sampel:Lihat 9222B.4a.
f. Filter membran:Lihat 9222B.1g. b. Unit filtrasi steril:Lihat 9222B.4b.
g. Bantalan penyerap:Lihat 9222B.1j. c. Filtrasi sampel:Lihat 9222B.4c, dengan pengecualian
h. Tang:Lihat 9222B.1i. berikut: inkubasi pelat kaldu m-ColiBlue24® pada suhu 35 ±
0,5°C selama 24 jam.
i. Inkubator:Lihat 9222B.1j.
d. Perhitungan:Untuk menghitung koloni pada filter
membran, gunakan mikroskop binokular berdaya rendah
(perbesaran 10 hingga 15x) atau perangkat optik lainnya dengan
2. Bahan dan Media Kultur sumber cahaya neon putih dingin yang diarahkan untuk
memberikan tampilan optimal.
Beli media ini dari vendor komersial; itu tidak bisa dibuat dari Hitung semua koloni merah dan biru hingga ungu di bawah
bahan dasar. Lihat Bagian 9020B.5j untuk spesifikasi QC cahaya normal/ambien dan catat sebagai hasil total coliform.
media. Hitung hanya koloni biru sampai ungu dan catat sebagai hasil E.
Sebelum digunakan, uji setiap lot dengan kultur kontrol coli. Koloni bening atau putih dianggap koloni non-coliform.
positif dan negatif (Lihat Tabel 9020:VI). Periksa kontaminasi Jumlah non-coliform yang tinggi dapat mengganggu
coliform pada awal dan akhir setiap rangkaian filtrasi dengan perkembangan koloni coliform.
menyaring 20 hingga 30 mL pengenceran atau air bilasan e. Verifikasi coliform:Untuk air minum, verifikasi total
melalui filter. Jika kontrol menunjukkan kontaminasi, tolak koloni coliform tidak diperlukan untuk media ini. Untuk air
semua data dari sampel yang terpengaruh dan minta sampel selain air minum, verifikasi dengan frekuensi yang ditetapkan
baru. Uji setiap lot media baru untuk memastikan kinerjanya oleh laboratorium (lihat Bagian 9020B.10). Berdasarkan
memuaskan (lihat Bagian 9020B.5j). Penggunaan bagan kendali kebutuhan dan jenis sampel, laboratorium dapat memasukkan
sangat membantu untuk mengidentifikasi tren dan memastikan tindakan QC yang lebih ketat (misalnya, verifikasi setidaknya
konsistensi jangka panjang dalam kinerja media. satu koloni dari setiap jenis koloni tipikal atau atipikal dari
m-ColiBlue24® Kaldu* kultur filter membran tertentu, verifikasi 10% sampel positif)
(lihat Bagian 9020B.10). Sesuaikan hitungan berdasarkan hasil
L-Metionin. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .0,1g verifikasi. Tes verifikasi tercantum dalam 9222B.4g.
Metilenbiru0.016.................................................................. G
kasiton. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .8.0g 4. Perhitungan Kepadatan Coliform
Ekstrak ragi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .0,5g
Laktosa. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .0,6g Lihat 9222B.5. Hitung nilai akhir menggunakan rumus:
Natrium klorida (NaCl). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3,0 g
Dipotassium hidrogen fosfat (K2HPO4) . . . . . . . . . . 1,75 g
jumlah koloni biru-ungu
Kalium dihidrogen fosfat (KH2PO4). . . . . . . . . . . 1,25 g Trifenil E.coli/100 mL =
tetrazolium klorida. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,07 g Natrium volume sampel yang disaring (mL) × 100
piruvat. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1,0 g
jumlah koloni merah dan biru sampai ungu
Eritromisin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3,0g
Octyphenol etoxylate† . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,5 g
Magnesium sulfat (MgSO4) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .0,3 TC/100 mL = × 100
volume sampel yang disaring(ml)
G5-bromo-4-kloro-3-indolyl-β-D-glukoronat
5. Bibliografi
asam (eksklusif)........................................................
Natrium azida . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,02 g
garam Cyclohexylammonium. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .0,2g † Triton X-114, atau setara.
Air tingkat reagen. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1L
* m-Coliblue24®, Perusahaan HACH, Loveland, CO; Perusahaan EMD

Millipore Sigma, Billerica, MA; atau setara.
GMENGOCEH, MA 1997. Sebuah media filtrasi membran baru untuk
deteksi simultan dan pencacahan Escherichia coli dan total
coliform. Aplikasi Mengepung. Mikrobiol. 63:3526.
MENGGUNAKANLINGKUNGANPROTEKSIAGENSI. 1999. Regulasi Air
Minum Primer dan Sekunder Nasional: Metode Analisis untuk
Kontaminan Kimia dan Mikrobiologi dan Revisi Persyaratan
Sertifikasi Perpustakaan Aturan Akhir. 40 CFR Bagian 141 dan
143; Diberi makan. Reg. 64(230):67449.
TEKNIK FILTER MEMBRAN (9222)/Prosedur Filter Membran Fluorogen/Kromogen
FRANCY, DS & RA DARNER. 2000. Perbandingan metode untuk

HAILSTADT, J., JJ SCHAUER, J.STANDRIDGE& S.KLENDER. 2007.A
menentukan konsentrasi Escherichia coli dalam air rekreasi. Res
perbandingan total coliform/E yang disetujui USEPA. tes koli.
air. 34:2770.
J. Air dan Kesehatan05:267.
9222 K. Deteksi Simultan Total Coliform dan E. coli dengan Prosedur Filter Membran
Fluorogen/Kromogen
1. Peralatan Laboratorium (konsentrasi akhir 100 µg/mL) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,1 G
Untuk analisis MF, gunakan peralatan gelas dan peralatan lain

yang terbuat dari bahan yang bebas dari bahan yang dapat
mempengaruhi pertumbuhan bakteri.
c. Pipet, wadah sampel, dan silinder ukur:Lihat Bagian
9030B.9.
d. Hidangan budaya:Lihat 9222B.1e.
e. Unit filtrasi:Lihat 9222B.1f.
f. Filter membran:Lihat 9222B.1g.
g. Bantalan penyerap:Lihat 9222B.1j.
h. Tang:Lihat 9222B.1i.
i. Inkubator:Lihat 9222B.1j.
Gunakan media dehidrasi komersial bila memungkinkan

untuk keseragaman antara batch; jangan pernah menyiapkan
media dari bahan dasar ketika media dehidrasi yang sesuai
tersedia.
Ikuti petunjuk produsen untuk rehidrasi.Simpan persediaan
media dehidrasi yang telah dibuka di dalam desikator (jika
perlu). Media cair komersial (ampula steril, dll.) dapat
digunakan jika diketahui memberikan hasil yang setara. Lihat
Bagian 9020B.5j untuk spesifikasi QC media.
Sebelum digunakan, uji setiap lot dengan kultur kontrol
positif dan negatif (Lihat Tabel 9020:VI). Periksa kontaminasi
coliform pada awal dan akhir setiap rangkaian filtrasi dengan
menyaring 20 hingga 30 mL pengenceran atau air bilasan
melalui filter. Jika kontrol menunjukkan kontaminasi, tolak
semua data dari sampel yang terpengaruh dan minta sampel
baru. Uji setiap lot media baru untuk memastikan kinerjanya
memuaskan (lihat Bagian 9020B.5j). Penggunaan bagan kendali
sangat membantu untuk mengidentifikasi tren dan memastikan
konsistensi jangka panjang dalam kinerja media. Jika media
yang disiapkan secara komersial tidak tersedia, siapkan seperti
yang dijelaskan dalam ¶sa– c di bawah ini.
a. larutan Cefsulodin,1 mg/1 mL: Tambahkan 0,02 g
cefsulodin ke dalam 20 mL air suling tingkat reagen, sterilkan
menggunakan filter jarum suntik 0,22 µm, dan simpan dalam
tabung steril pada suhu 4°C sampai diperlukan. Persiapkan
larutan segar setiap kali media MI dibuat. Jangan simpan bagian
yang tidak terpakai.
b. MI agar:*
Proteosa pepton No.3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5,0 g
Ekstrak ragi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3,0g
β-D-Laktosa. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1,0 g
4-Metilumbelliferil-β-D-galactopyranoside (MUGal)
Indoxyl-β-D-glukoronida (IBDG) 3. Prosedur
(konsentrasi akhir 320 µg/mL)0,32.................................... G
NaCl . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7,5 gram a. Pemilihan ukuran sampel:Lihat 9222B.4a.
K2HPO4 .................................................... .... 3,3g b. Unit filtrasi steril:Lihat 9222B.4b.
KH2PO4 .................................................... .... 1,0g c. Filtrasi sampel:Lihat 9222B.4c.
Natrium lauril sulfat. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,2 g d. Perhitungan:Untuk menghitung koloni pada filter
Natrium desoksikolat. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,1 g membran, gunakan mikroskop binokular berdaya rendah
Agar . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15.0g (perbesaran 10 hingga 15x) atau perangkat optik lainnya dengan
Air suling tingkat reagen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1L sumber cahaya neon putih dingin yang diarahkan untuk
memberikan tampilan optimal. Hitung semua koloni biru pada
Media diautoklaf selama 15 menit pada 121–124°C, dan setiap pelat MI di bawah normal/ambien
tambahkan 5 mL larutan cefsulodin yang baru disiapkan (¶ a ringan dan catat sebagai hasil E. coli. Hasil positif yang terjadi
di atas)(5 µg/mL konsentrasi akhir) per liter media agar pada
temper. pH akhir harus 6,95 ± 0,2. Pipet media ke dalam <24 jam valid, tetapi hasil tidak dapat dicatat
cawan Petri 9- × 50-mm (5 mL/piring). Simpan piring pada sebagai negatif hingga masa inkubasi 24 jam
suhu 4°C hingga 2 minggu.
c. MI kaldu:† Gunakan bahan yang sama dengan agar MI, selesai. Paparkan setiap pelat MI ke
tetapi hilangkan agar. Persiapkan dan sterilkan, dan sinar UV gelombang panjang (366 nm), dan hitung semua
tambahkan cefsulodin dengan metode yang dijelaskan untuk koloni fluoresen [E. coli fluoresen biru/hijau, TC fluoresen
MI agar. Bergantian, kaldu bisa disterilkan dengan filter. pH biru/putih selain E. coli, dan biru/hijau dengan tepi fluoresen
akhir harus 7,1 ± 0,2. Tempatkan bantalan penyerap dalam (juga E. coli)] sampai mendapatkan hitungan TC. Catat datanya.
cawan Petri 9- × 50-mm dan jenuh dengan 2,0 hingga 3,0 mL Jika ditemukan koloni berwarna biru dan tidak berfluoresensi
kaldu MI pada cawan yang sama, tambahkan totalnya ke hitungan TC.
mengandung 5 µg/mL konsentrasi akhir cefsulodin. Simpan Hitung nilai akhir menggunakan rumus berikut:
piring di lemari es, dan buang setelah 96 jam. Tuang kaldu
berlebih sebelum menggunakan piring. jumlah koloni biru
E.coli/100 mL =
volume sampel yang disaring (mL) × 100
* Pelat BBLTM MI disiapkan (No. 214986), atausetara.† Dehidrasi DifcoTM MI Broth (No. 214882), atau setara.
jumlah koloni fluoresen 5. Daftar Pustaka

+ jumlah koloni biru, non-fluorescent (jika ×
TC/100 mL =
ada)volume sampel yang disaring(ml)
100 BRENNER, KP, CC RANKIN, YR ROYBAL, GN STELMA, JR., PV
e. Verifikasi coliform:Untuk air minum, verifikasi total koloni SCARPINO& AP DUFOUR. 1993. Media baru untuk deteksi simultan
coliform tidak diperlukan. Untuk air selain air minum, verifikasi total coliform dan Escherichia coli dalam air. Aplikasi Mengepung.
dengan frekuensi yang ditetapkan oleh laboratorium (lihat Bagian Mikrobiol. 59:3534.
9020B.10). Laboratorium dapat memasukkan langkah-langkah QC BRENNER, KP, CC RANKIN, N.SIVAGANESAN& PV SCARPINO. 1996.
yang lebih ketat (misalnya, memverifikasi setidaknya satu koloni Perbandingan pemulihan Escherichia coli dan total coliform dari
dari setiap jenis koloni tipikal atau atipikal dari biakan filter air minum dengan metode agar MI dan
membran tertentu, memverifikasi 10% sampel positif) berdasarkan Metode filter membran yang disetujui Badan Perlindungan
Lingkungan AS. Aplikasi Mikrobiol Lingkungan. 62:204.
kebutuhan dan jenis sampel (lihat Bagian 9020B.10). Sesuaikan
MENGGUNAKANLINGKUNGANPROTEKSIAGENSI. 2002. Metode 1604:
hitungan berdasarkan hasil verifikasi. Tes verifikasi tercantum dalam
Total Coliform dan Escherichia coli dalam Air dengan Filtrasi
9222B.4g. Membran Menggunakan Teknik Deteksi Simultan (Media MI);
4. Perhitungan Kepadatan Coliform EPA 821-R-02-024. Mati. Air, Washington, DC
Lihat 9222B.5.

9221-9222 Apha

Diunggah oleh

Informasi Dokumen

Judul Asli

Hak Cipta

Format Tersedia

Bagikan dokumen Ini

Bagikan atau Tanam Dokumen

Opsi Berbagi

Apakah menurut Anda dokumen ini bermanfaat?

Apakah konten ini tidak pantas?

Hak Cipta:

Format Tersedia

9221-9222 Apha

Diunggah oleh

Hak Cipta:

Format Tersedia

Diterjemahkan dari bahasa Inggris ke bahasa Indonesia - www.onlinedoctranslator.

9221MULTIPLE-TUBE TEKNIK FERMENTASI UNTUK ANGGOTA COLIFORM

1. Air Minum-Kualitas Air

Saat menganalisis minumair untuk menentukan apakah

2. Kualitas Air Selain Air Minum

Saat menganalisis air yang tidak dapat diminum,

Teknik fermentasi beberapa tabung berlaku untuk analisis

9221 B. Teknik Fermentasi Koliform Total Standar

1. Sampel triptosa. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20,0g

Semua fase teknik fermentasi (9221B–G) memerlukan

Gunakan kaldu lauril triptosa dalam fase uji beberapa tabung

Dipotasium hidrogen fosfat (K2HPO4)2.75........................... G

Tambahkan bahan kering ke dalam air, aduk rata, dan

2) Segera inkubasikan tabung atau botol yang telah

Tambahkan bahan ke dalam air, aduk rata, dan panaskan

Tambahkan bahan ke dalam air, aduk rata, dan panaskan

HUCKER, GJ & HJ CONN. 1927. Studi Lanjutan Metode Pewarnaan

eVANS, TM, CEWAARVICK, RJ SEIDLER& MWLeCLEBIH HEVALLIER.

9221 C. Pendugaan Kepadatan Bakteri

1. Ketepatan Uji Fermentasi Tabung Berganda

TMAMPU9221:IV. MPN INDEX DAN95% CKEPERCAYAANLIMIT UNTUKVARIOUSCOMBINASI DARIPPOSITIFRHASILWINDUK AYAMFAKUTUBESAULANGASSED

TMAMPU9221:V. eCONTOH UNTUKCHOICE OFTHREECOMBINASI DARIPPOSITIF DARIFAKUDILUSI

MPN/100 mL (kurang lebih) = 100 × P/(N × T)1/2

9221 D. Tes Coliform Kehadiran-Ketidakhadiran (P-A).

Tes ada-tidaknya (P-A) untuk kelompok coliform adalah

Jika disterilkan melalui filtrasi, media P–A berkekuatan 6x

CLARK, JA & LTVLASSOFF. 1973. Hubungan antara bakteri indikator

9221 E. Prosedur Koliform Termotoleran (Fekal).

1. Tes Coliform Termotoleran (EC Medium)

Tes coliform termotoleran menggunakan media EC berlaku

Tambahkan bahan kering ke dalam air, aduk rata, dan

2. Tes Coliform Direct Thermotolerant (Fecal) (A-1 Medium)

a. Media A-1:Media ini dapat digunakan untuk secara

* Triton X-100, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, atau setara.

9221 F.Escherichia coliProsedur Menggunakan Substrat Fluorogenik

1. Escherichia coliTes (Media EC-MUG)

Penggunaan media EC-MUG untuk mendeteksi E. coli dapat

9221 G. LainnyaEscherichia coliProsedur

Gunakan prosedur GAD untuk menguji E. coli dalam total

Polietilen glikol oktilfenil eter* . . . . . . . . . . . 3,0 mL air tingkat

Teknik filter membran (MF) dapat direproduksi, dapat

Dalam teknik MF, kelompok coliform didefinisikan sebagai

Teknik MF dapat digunakan untuk menguji air minum,

Untuk analisis MF, gunakan peralatan gelas dan peralatan lain

PERHATIAN: Dasar fuchsin adalah karsinogen dan

b. media m-Endo:* TMAMPU9222:I. SDISARANKANSCUKUPVOLUM

Thiopeptone atau tioton. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .5.0g VOLUME(X)THAIBeFTERPILIH

Kumpulkan sampel seperti yang diarahkan pada Bagian

a. Pemilihan ukuran sampel:Ukuran sampel akan diatur oleh

ulangan dari volume sampel yang lebih kecil (misalnya,

2) Verifikasi coliform alternatif—Terapkan prosedur

a. Air minum:Dalam Aturan Coliform Totalnya, Badan [(5+ 3)× 100]

Di sisi lain, jika porsi 10-, 1,0-, dan 0,1 mL diperiksa

Batas Keyakinan 95%. 80 × 100

(78+ 21)× 100

Jika bagian 1,0-, 0,3-, dan 0,01-mL diperiksa dengan jumlah

deteksi total coliform dan Escherichia coli dalam air. Aplikasi

9222 C. Prosedur Koliform Total Inkubasi Tertunda

a. Hidangan budaya:Gunakan cawan Petri plastik sekali

2. Bahan dan Media Transportasi

Larutkan bahan dengan rehidrasi dalam air. Sterilkan

* Actidione®, diproduksi oleh Upjohn Company, Kalamazoo, MI, atau yang

9222 D. Prosedur Filter Membran Coliform Termoleran (Fekal).