9222 TEKNIK FILTER MEMBRAN UNTUK ANGGOTA KELOMPOK COLIFORM*

9222 A. Pendahuluan
Teknik filter membran (MF) dapat direproduksi, dapat digunakan untuk menguji volume sampel
yang relatif besar, dan biasanya menghasilkan hasil numerik lebih cepat daripada prosedur
fermentasi tabung ganda. Ini berguna dalam memantau air minum dan berbagai perairan alami.
Namun, teknik MF memiliki keterbatasan, terutama saat menguji air dengan kekeruhan tinggi
atau bakteri noncoliform (latar belakang) dalam jumlah besar. Jika terjadi gangguan bakteri
heterotrofik, misalnya, hasil sampel mungkin perlu dibatalkan dan sampel baru dikumpulkan.
Jika laboratorium belum pernah menggunakan teknik MF sebelumnya, analis harus melakukan uji
paralel dengan metode laboratorium saat ini untuk menunjukkan penerapan dan
keterbandingan. Banyak studi kinerja coliform telah dilaporkan dalam literatur; tingkat hasil
positif palsu dan negatif dapat berbeda di antara berbagai media koliform, sehingga pengguna
harus hati-hati memilih media dan prosedur yang paling sesuai dengan kebutuhan mereka
1. Terminologi Dalam teknik MF, kelompok coliform didefinisikan sebagai bakteri anaerob
fakultatif, Gram-negatif, tidak membentuk spora, berbentuk batang yang mengembangkan koloni
dengan ciri khas pada media tertentu. Ketika biakan bakteri coliform yang dimurnikan diuji,
mereka menghasilkan sitokrom oksidase negatif dan reaksi uji B-galaktosidase positif. Rincian
karakteristik coliform ini diberikan di bawah ini untuk prosedur total coliform MF standar (9222B)
(a di bawah) dan untuk dua prosedur untuk mendeteksi total coliform dan E. coli secara
bersamaan (92223 dan K) adalah b dan c di bawah).
A. Media agar tipe endo (Endo agar LES atau Endo broth MF): Dalam prosedur ini, bakteri
koliform didefinisikan sebagai bakteri yang mengembangkan koloni merah dengan kemilau
metalik (hijau keemasan) dalam waktu 24 jam pada suhu 35°C pada tipe Endo media yang
mengandung laktosa. Beberapa anggota kelompok koliform total juga menghasilkan koloni
berwarna merah tua, mukoid, atau berinti tanpa kilau logam; ketika diverifikasi, ini
diklasifikasikan sebagai koloni coliform atipikal. Umumnya, koloni merah muda (non-mukoid),
biru, putih, atau tidak berwarna yang kurang berkilau pada media Endo dianggap nonkoliform
dalam teknik ini.
B. Dual-chromogen m-ColiBlue24 medium: Media filter membran diferensial ini secara
bersamaan mendeteksi dan menghitung total coliform (TC) dan Escherichia coli (E. coli) dalam
sampel air dalam 24 jam berdasarkan aktivitas enzim spesifiknya. Bakteri coliform (selain E. coli)
didefinisikan sebagai bakteri yang menghasilkan koloni berwarna merah dalam waktu 24 jam
pada suhu 35°C pada media ini, yang mengandung laktosa dan pewarna nonselektif [2,3,5-
triphenyltetrazolium chloride (TTC). )]. E. coli dibedakan dari bakteri coliform lainnya dengan
koloni biru hingga ungu dari aksi
Enzim 8-glukuronidase pada 5-bromo-4-kloro-3-indolyl-8-D-glukoronida (BCIG), juga terdapat
dalam medium. C. Fluorogen/chromogen MI medium: Membedakan ini mem- media filter bran
secara bersamaan mendeteksi dan menghitung total coliform (TC) dan Escherichia coli (E. coli)
dalam sampel air dalam 24 jam berdasarkan aktivitas enzim spesifiknya. Media tersebut meliputi
dua substrat enzim-fluorogen 4-methylumbelliferyl-B-D-galactopyranoside (MUGal) dan
chromogen indoxyl-B-D-glucuronide (IBDG) untuk mendeteksi enzim B-galactosidase dan B-
glucuronidase yang diproduksi oleh TC dan E. coli , masing-masing. Dalam prosedur ini, bakteri
koliform didefinisikan sebagai bakteri yang menghasilkan koloni fluoresen dalam waktu 24 jam
saat terpapar sinar ultraviolet (UV) gelombang panjang (365-366 nm) pada suhu 35°C, sedangkan
koloni E. coli tampak berwarna biru pada medium ini.
2. Aplikasi Teknik MF dapat digunakan untuk menguji air minum, permukaan, tanah, kolam
renang, dan laut. Jangan menggunakannya untuk menguji efluen pengolahan air limbah primer
kecuali sampel diencerkan, karena tingkat kekeruhan yang tinggi dapat menyumbat filter
membran sebelum sampel yang cukup disaring. Limbah yang diklorinasi harus memiliki jumlah
dan kekeruhan yang rendah. Selain itu, jangan gunakan teknik MF untuk menguji air limbah yang
mengandung logam beracun tingkat tinggi atau senyawa organik beracun (misalnya fenol) karena
filter dapat mengkonsentrasikan zat tersebut, sehingga menghambat pertumbuhan koliform.
Untuk sampel non-air limbah, tingkat kekeruhan yang tinggi dapat menyumbat filter dan
konsentrasi bakteri heterotrofik yang tinggi dapat mengganggu pertumbuhan koliform pada filter,
kemungkinan memerlukan penggunaan beberapa filter per sampel dan/atau berbagai
pengenceran sampel. Untuk mendeteksi stres total coliform dalam air minum yang diolah dan
limbah pengolahan air limbah sekunder atau tersier yang diklorinasi, gunakan metode yang
dirancang untuk pemulihan organisme yang stres (lihat Bagian 9212B.1). Teknik MF yang
dimodifikasi untuk koliform termotoleran dalam air limbah terklorinasi (Bagian 9212) dapat
digunakan jika pengujian paralel selama 3 bulan dengan teknik fermentasi tabung ganda
menunjukkan perbandingan untuk setiap jenis sampel spesifik lokasi
Volume standar yang akan disaring adalah 100 mL. untuk sampel air minum; ini dapat
didistribusikan di antara banyak membran, jika perlu. Namun, untuk tujuan pemantauan khusus
(misalnya, memecahkan masalah kualitas air atau mengidentifikasi penerobosan koliform dalam
konsentrasi rendah dari penghalang perlakuan), mungkin diinginkan untuk menguji sampel 1-L.
Jika partikulat mencegah satu filter memproses sampel 1-L, bagilah sampel menjadi empat
bagian berukuran 250 ml untuk analisis. Jumlahkan jumlah koliform pada setiap membran untuk
melaporkan jumlah koliform per liter. Sampel selain air minum harus dianalisis menggunakan
beberapa tingkat pengenceran.Pengenceran yang direkomendasikan untuk pengukuran koliform
total disajikan pada Tabel 9222:1 dan untuk coliform motoleran dan E. coli pada Tabel 9222-IV.
Perbandingan statistik dari hasil yang diperoleh dengan metode multiple-tube dan teknik MF
menunjukkan bahwa MF lebih presisi.

9-82. Pemeriksaan mikrobiologi

9222 B. PROSEDUR FILTER MEMBRAN TOTAL COLIFROM STANDAR MENGGUNAKAN MEDIA ENDO
Metode ini dapat digunakan untuk mengukur total koliform dalam air minum, tidak dapat
diminum, dan air lainnya dengan menggunakan media jenis Endo. Koloni tipikal yang ditanam
pada media tipe Endo dapat dipartisi lebih lanjut untuk membedakan coliform termotoleran
(tinja) dan E.coli menggunakan metode partisi pada 9222G, H, dan I. Metode ini mungkin tidak
sesuai untuk sampel dengan partikel tinggi yang dapat menyumbat filter atau sampel dengan
proporsi total coliform yang tinggi relatif terhadap E.coli. Untuk pengukuran total coliform dan
E.coli secara simultan menggunakan filtrasi membran, lihat Metode 9222J dan K.

1. Alat Laboratorium Untuk analisis MF, gunakan peralatan gelas dan peralatan lain yang
disusun bahan bebas dari agen yang dapat mempengaruhi pertumbuhan bakteri. A. Botol
sampel: Lihat Bagian 9030B.19. B. Botol pengenceran: Lihat Bagian 9030B.13. C. Pipet dan
silinder ukur: Lihat Bagian 9030B.9. Sebelum
sterilisasi, tutup bukaan silinder ukur dengan longgar foil logam atau pengganti kertas
pembungkus berat yang sesuai. Segera- Setiap kali setelah sterilisasi, tutup rapat untuk
mencegah kontaminasi. D. Wadah untuk media biakan: Gunakan labu kaca borosilikat yang
bersih. Labu dengan berbagai ukuran atau bentuk dapat digunakan, tetapi labu Erlenmeyer
dengan tutup logam, penutup foil logam, atau tutup ulir menyediakan pencampuran media yang
memadai di dalamnya dan nyaman untuk penyimpanan
e. Cawan biakan: Gunakan gelas borosilikat steril atau cawan Petri plastik sekali pakai yang
sudah disterilkan, 15 x 60 mm, 9 x 50 mm, atau ukuran lain yang sesuai. Bungkus cawan biakan
gelas yang bersih dalam jumlah yang nyaman dalam foil logam jika disterilkan melalui panas
kering, atau kertas pembungkus tebal yang sesuai saat diautoklaf. Inkubasi kaca dengan tutup
longgar dan cawan biakan plastik sekali pakai dalam wadah tertutup rapat untuk mencegah
penguapan kelembapan dengan hasil pengeringan
media dan untuk menjaga lingkungan yang lembab untuk optimal perkembangan koloni. Piring
plastik sekali pakai yang disterilkan dengan penutup rapat yang memenuhi spesifikasi di atas
tersedia secara komersial dan digunakan secara luas. Reseal membuka paket persediaan sekali
pakai untuk penyimpanan, F. Unit filtrasi: Rakitan penahan filter (terbuat dari kaca, plastik yang
dapat diautoklaf, porselen, baja tahan karat, atau plastik sekali pakai) terdiri dari corong tanpa
sambungan yang diikat ke alas berhadapan dengan perangkat pengunci atau gaya magnet.
Desainnya harus memungkinkan filter membran dipegang dengan aman di pelat pos wadah
tanpa kerusakan mekanis dan memungkinkan semua cairan mengalir melalui membran selama
filtrasi. Buang corong plastik dengan goresan dalam pada permukaan bagian dalam atau corong
kaca dengan permukaan terkelupas. Ganti layar yang rusak pada unit stainless steel
Bungkus rakitan (secara keseluruhan atau bagian terpisah) dengan kertas pembungkus tebal atau
aluminium foil, atau tempatkan dalam kantong clave komersial; mensterilkan melalui autoklaf;
dan simpan sampai digunakan. Unit lapangan dapat dibersihkan dengan mencelupkan atau
menyemprot dengan alkohol dan kemudian menyalakan atau merendamnya dalam air mendidih
selama 2 menit. Gunakan air reagen untuk menghindari endapan air sadah (lihat Bagian
9020B.4d untuk spesifikasi kualitas air tingkat reagen). Setelah merendam unit dalam air
mendidih, dinginkan hingga suhu kamar sebelum digunakan kembali. Jangan menyalakan
komponen plastik. Unit lapangan yang steril dan sekali pakai juga dapat digunakan.
Untuk filtrasi, pasang wadah penahan filter pada labu filter 1-L dengan lengan samping atau
perangkat lain yang sesuai (manifold untuk menampung tiga hingga enam unit filter) sehingga
perbedaan tekanan (34 hingga 51 kPa) dapat diberikan pada membran penyaring. Sambungkan
labu ke saluran vakum, pompa vakum elektrik, pompa filter yang beroperasi pada tekanan air,
aspirator tangan, atau cara lain untuk mengamankan perbedaan tekanan (138 hingga 207 kPa).
Hubungkan labu kira-kira

9-83
TEKNIK MEMBRANE FILTER (22ndard Total Color Membrane Fier Procedure menggunakan Endo
Media dengan
kapasitas yang sama antara tabung penyaring dan sumber vakum air pembawa atas
Filter membran: Gunakan filter membran dengan nilai diameter pori untuk mempertahankan
bakteri coliform sepenuhnya (biasanya 0,45 m) (untuk spesifikasi tambahan, lihat Bagian
90208.50). Gunakan hanya membran filter yang telah ditemukan melalui pengujian kontrol
kualitas (QC) yang memadai dan sertifikasi pabrikan untuk menunjukkan hal-hal berikut:
 retensi penuh dari organisme yang akan dibudidayakan,
 stabilitas dalam penggunaan,
 bebas dari ekstrak bahan kimia yang dapat menghambat pertumbuhan dan perkembangan
bakteri,
 kecepatan filtrasi yang memuaskan (dalam 5 menit).
 tidak ada pengaruh yang s ignifikan pada pH media (di atas 0,2 unit). Dan
 tidak ada peningkatan jumlah koloni konfluen atau penyebar dibandingkan dengan filter
membran kontrol
Gunakan membran bertanda kisi agar pertumbuhan bakteri tidak terhambat atau terstimulasi
sepanjang garis kisi saat membran dengan bakteri yang terperangkap diinkubasi pada media yang
sesuai. Sebaiknya gunakan stok filter membran baru dan, jika perlu kelembaban ekstrim.
Dapatkan pasokan tidak lebih dari satu tahun di setiap saat
Lebih disukai menggunakan filter membran pra-sterilisasi yang telah disertifikasi oleh pabriknya
bahwa teknik sterilisasinya tidak menyebabkan toksisitas atau mengubah sifat kimia atau fisik
membran. Jika membran disterilkan di laboratorium, autoklaf selama 10 menit pada suhu 121-
124°C dan kemudian biarkan uap keluar dengan cepat untuk meminimalkan kondensasi pada
filter. H. Bantalan penyerap: Gunakan cakram dari kertas saring atau bahan lain yang telah
disertifikasi oleh produsen, dengan kualitas tinggi dan bebas dari sulfit atau bahan beracun
lainnya pada konsentrasi yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri. Gunakan bantalan
berdiameter sekitar 48 mm dan cukup tebal untuk menyerap 1,8 hingga 2,2 mL media. Beberapa
bantalan mungkin memerlukan 3,0 mL media. Sterilkan bantalan dalam amplop kraft yang dapat
ditutup kembali, atau secara terpisah dalam wadah lain yang sesuai selama 15 menit dalam
autoklaf (siklus kering). Bantalan kering sehingga bebas dari kelembapan yang terlihat sebelum
digunakan. Lihat prosedur sterilisasi membran-filter dalam ¶ g di atas. Saya. Forceps: Gunakan
forceps tumpul halus, tanpa kerutan di sisi dalam ujungnya. Sterilkan sebelum digunakan dengan
mencelupkan ke dalam 95% etil atau alkohol metil absolut dan nyalakan. J. Inkubator: Gunakan
inkubator untuk memberikan suhu 35 0,5°C. Untuk menghindari pengeringan yang berlebihan,
pertahankan lingkungan yang lembap untuk pelat selama inkubasi dengan menggunakan
inkubator yang dilembabkan (antara 60 dan 90% kelembapan relatif) atau menempatkan pelat
dalam wadah tertutup dengan penutup yang rapat (atau kantong tertutup). Pelat tidak boleh
kehilangan lebih dari 15% berat agar selama inkubasi. k. Mikroskop dan sumber cahaya: Untuk
menentukan jumlah koloni pada filter membran, gunakan perbesaran 10 hingga 15X dan sumber
cahaya neon putih dingin yang disesuaikan untuk memberikan kemilau maksimum. Secara
optimal, gunakan mikroskop binokular bidang lebar. Jangan gunakan mikroskop dengan
iluminator yang mengkonsentrasikan cahaya dari sumber pijar saat melihat koloni koliform pada
media tipe Endo.

2. Bahan dan Media Kultur Karena hasil pengujian harus seragam, gunakan media komersial
yang didehidrasi; jangan pernah menyiapkan media dari bahan dasar saat media dehidrasi yang
sesuai tersedia. Ikuti petunjuk produsen untuk rehidrasi. Simpan persediaan media dehidrasi
yang telah dibuka di dalam desikator (jika perlu). Media cair komersial (ampula steril, dll.) dapat
digunakan jika diketahui memberikan hasil yang setara. Lihat Bagian 9020B.5j. Uji setiap lot
media baru untuk memastikan kinerjanya memuaskan (lihat Bagian 9020B.5j). Penggunaan bagan
kendali sangat membantu untuk mengidentifikasi tren dan memastikan konsistensi jangka
panjang dalam kinerja media. Dengan setiap lot baru media tipe Endo, verifikasi minimal 10%
koloni coliform (diperoleh dari sampel alami atau sampel dengan tambahan yang diketahui)
untuk ditetapkan pemulihan komparatif lot. Sebelum digunakan, uji kinerja setiap batch media
MF yang disiapkan di laboratorium dengan kontrol biakan positif dan negatif. Jika media yang
disiapkan secara komersial tidak tersedia, siapkan dari masing-masing komponen seperti yang
dijelaskan dalam ¶s a dan b di bawah ini.
A. Endo agar LES (formula Lawrence Experimental Station- tion):
1.2 g Ekstrak ragi 3.7 8 Casitone atau trypticase. 3,7g Thiopeptone atau tioton 75 8 triptosa.. 9,4%
Laktosa.. 3,3 8 1,0% Dipotasium hidrogen fosfat (K₂HPO4) Kalium dihidrogen fosfat (KH,PO). 3,7g
Natrium klorida (NaCl). Natrium desoksikolat 0,1 8 0,05 g Natrium lauril sulfat. 1,6g Natrium sulfit
(Na,SO).. 0,8% fuchsin dasar.. 15.0g Agar... Air tingkat reagen. 1 L PERHATIAN: Dasar fuchsin
adalah karsinogen dan mutagen yang dicurigai. Hindari kontak kulit, konsumsi, dan paparan
selaput lendir. Ikuti instruksi produsen dan lembar data keselamatan (SDS). Rehidrasi produk
sesuai petunjuk produsen atau masing-masing komponen dalam I L air yang mengandung 20 mL
etanol 95%. Jangan gunakan etanol terdenaturasi, yang mengurangi pertumbuhan latar belakang
dan ukuran koloni koliform. Didihkan hingga hampir mendidih untuk melarutkan agar, segera
angkat dari api, dan dinginkan hingga antara 45 dan 50°C. Jangan mensterilkan dengan autoklaf.
pH akhir harus 7,2±0,2. Endapan adalah normal pada media tipe Endo. Tuangkan dalam jumlah 5
hingga 7 mL ke bagian bawah cawan Petri kaca 60 mm atau jumlah 4 hingga 6 mL ke bagian
bawah cawan Petri plastik 50 mm dan biarkan mengeras. Jika piringan dengan ukuran lain
digunakan, sesuaikan jumlahnya untuk memberikan kedalaman setara 4 hingga 5 mm. Jangan
memaparkan piring yang dituangkan ke sinar matahari langsung; dinginkan dalam gelap,
sebaiknya dalam kantong plastik tertutup atau wadah lain untuk mengurangi hilangnya
kelembapan. Buang media yang tidak digunakan setelah 2 minggu [atau lebih cepat jika ada bukti
kehilangan kelembaban, kontaminasi media, kerusakan media (penggelapan media), atau
pembentukan kemilau permukaan].

9-84

B. media m-Endo:* Caps A Lock Tryptosa atau polypeptone Thiopeptone atau thiotone.. 10.0
5.0 G Casitone atau trypticase. 5.0 Ekstrak ragi. Menggeser 1.5 G Laktosa 12.5 g g Natrium klorida
(NaCl).. 5.0 Dipotassium hidrogen fosfat (K₂HPO4) Kalium dihidrogen fosfat (KH₂PO₁). 4.375g
1,375 g 0,05 g natrium lauril sulfat.. Ctrl Natrium desoksikolat 0,10g Natrium sulfit (Na2SO3)
Dasar fuchsin 2,10g 1,05g Agar (opsional). 15.0 Air tingkat reagen. 1 L PERHATIAN: Dasar fuchsin
adalah karsinogen dan mutagen yang dicurigai. Hindari kontak kulit, konsumsi, atau paparan
selaput lendir. Ikuti petunjuk produsen dan SDS. 1) Sediaan agar-rehidrasi produk dalam 1 L air
yang mengandung 20 mL etanol 95%. Jangan gunakan etanol terdenaturasi, yang mengurangi
pertumbuhan latar belakang dan ukuran koloni koliform. Jangan mensterilkan dengan autoklaf.
Panaskan hingga hampir mendidih untuk melarutkan agar, segera angkat dari api, dan dinginkan
hingga antara 45 dan 50°C. Tuangkan 5 hingga 7 mL ke dalam gelas steril 60 mm atau 4 hingga 6
mL ke dalam cawan Petri plastik 50 mm. Jika piring dengan ukuran lain digunakan, sesuaikan
jumlahnya untuk memberikan kedalaman yang setara. pH akhir harus 7,2 ± 0,2. Endapan adalah
normal pada media tipe Endo. Dinginkan media jadi dalam gelap, dan buang yang tidak
digunakan agar setelah 2 minggu [atau lebih cepat jika ada bukti kelembaban kehilangan,
kontaminasi sedang, kerusakan sedang (penggelapan medium), atau formasi kemilau
permukaan]. 2) Persiapan Kaldu - Siapkan seperti di atas, hilangkan agar. Keluarkan media cair
(setidaknya 2,0 mL per piring) ke bantalan penyerap steril (lihat 9222B.1h) dan hati-hati buang
kelebihan media dengan menuang piring. Kaldu mungkin memiliki endapan tetapi ini tidak
mengganggu kinerja sedang jika pembalut disertifikasi bebas dari sulfit atau bahan beracun
lainnya pada konsentrasi yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri. Kaldu yang didinginkan
dalam sekrup- botol atau termos yang tertutup dapat disimpan hingga 96 jam. C. Air bilasan
pengenceran buffer: Lihat Bagian 9050C.1. 3. Sampel Kumpulkan sampel seperti yang diarahkan
pada Bagian 9060A. 4. Prosedur A. Pemilihan ukuran sampel: Ukuran sampel akan diatur oleh
kepadatan bakteri yang diharapkan, tingkat kekeruhan dan, jika berlaku, persyaratan peraturan.
(Lihat Tabel 9222:1 untuk volume sampel yang disarankan.) Volume sampel yang ideal akan
menghasilkan 20 hingga 80 koloni koliform total dan ≤200 koloni dari semua jenis (koloni latar
tipikal, atipikal, dan nonkoliform) pada permukaan filter membran (Tabel 9222:11). Analisis air
minum dengan menyaring 100 mL atau

ulangan dari volume sampel yang lebih kecil (mis., duplikat bagian 50 mL atau empat ulangan dari
bagian 25 ml). Analisis air lain dengan menyaring tiga volume yang berbeda (diencerkan atau
tidak diencerkan), bergantung pada kepadatan bakteri yang diharapkan. (Lihat Bagian 9215B.2
untuk penyiapan pengenceran.) Saat menyaring <10 mL sampel (diencerkan atau tidak
diencerkan), tambahkan kira-kira 10 mL air buffer buffered dilution ke dalam corong dan
kemudian tambahkan sampel diikuti dengan pengenceran 25 hingga 50 mL lainnya air sebelum
penyaringan atau pipet volume sampel ke dalam air pengenceran steril dan kemudian saring
seluruh isi botol pengenceran. Peningkatan volume air ini membantu membubarkan suspensi
bakteri secara merata di seluruh permukaan penyaringan yang efektif. B. Unit filtrasi steril dan
kontrol kualitas: Gunakan unit filtrasi steril di awal setiap rangkaian filtrasi sebagai tindakan
pencegahan minimum untuk menghindari kontaminasi yang tidak disengaja. Serangkaian filtrasi
terputus ketika selang waktu 30 menit atau lebih lama berlalu antara filtrasi sampel. Setelah
interupsi tersebut, perlakukan filtrasi sampel lebih lanjut sebagai seri filtrasi baru dan sterilkan
semua penahan filter membran yang digunakan. (Lihat 9222B. Jika untuk prosedur sterilisasi dan
Bagian 9020B.4/ dan m untuk panduan keselamatan dan pembersihan UV.) C. Filtrasi sampel:
Dengan menggunakan forceps steril, tempatkan filter membran steril (sisi kisi menghadap ke
atas) di atas pelat dasar yang berpori. Tempatkan unit corong yang cocok dengan hati-hati di atas
alas (kunci di tempatnya, jika ada). Campur sampel atau pengenceran sampel secara menyeluruh
dengan mengocok kuat-kuat (misalnya, 25 kali naik turun dalam busur 1 kaki dalam 7 detik) untuk
memecah gumpalan bakteri, yang sangat penting untuk metode kuantitatif mikroba. Jika botol
sampel tidak memiliki ruang kepala yang cukup untuk pencampuran yang memadai, tuangkan
sampel ke dalam bejana steril yang lebih besar untuk mencampurnya dengan tepat. Saring
sampel di bawah vakum parsial (tekanan yang biasa digunakan: 81 kPa, 24 in. Hg, atau vakum
79%). Dengan filter masih terpasang, bilas permukaan bagian dalam corong menyaring tiga
bagian 20- hingga 30 mL pengenceran buffer steril air dari botol peras (atau perangkat lain yang
sesuai). Ini memuaskan hanya jika botol pencet dan isinya tidak terkontaminasi selama
penggunaan. Jangan menggunakan kembali botol air pengenceran yang terisi sebagian.
Pembilasan di antara sampel mencegah kontaminasi sisa. Saat pembilasan akhir dan penyaringan
selesai, gunakan teknik aseptik unik untuk melepaskan vakum, membuka kunci dan melepas
corong, segera hati-hati lepaskan filter membran dengan forsep steril, dan gulung filter ke media
yang dipilih untuk menghindari udara yang terperangkap. Salah penempatan filter langsung
terlihat jelas karena tambalan tidak ternoda

membran menunjukkan udara yang terperangkap. Jika tambalan seperti itu muncul, pasang
kembali filter dengan hati-hati pada permukaan agar. Tempatkan hanya satu filter membran per
piringan. Balik cawan, dan inkubasi pada suhu 35 ± 0,5°C selama 22 hingga 24 jam untuk m-Endo
LES atau m-Endo MF. Secara opsional, untuk membersihkan corong di antara sampel setelah
pelepasan filter, paparkan semua permukaan rakitan yang telah dibersihkan dan disterilkan
sebelumnya ke radiasi UV selama 2 menit sebelum menggunakan kembali unit untuk filtrasi
berturut-turut. Jika menggunakan kaldu, tempatkan bantalan steril secara aseptis di cawan
biakan, jenuh dengan setidaknya 2,0 hingga 3,0 mL media (tergantung pada produsen bantalan),
dan hati-hati buang kelebihan media dengan menuangnya perlahan dari piring ke dalam handuk
terry sekali pakai atau kosongkan piring. Tempatkan filter sampel langsung pada bantalan,
balikkan cawan, dan inkubasi seperti yang ditentukan di atas. Jika digunakan wadah dengan tutup
longgar, tempatkan di ruang lembab (atau inkubator yang dilembabkan). Diferensiasi beberapa
koloni dapat hilang jika biakan diinkubasi >24 jam. Untuk sampel air yang tidak dapat diminum,
corong harus dibilas atau disanitasi dengan UV setelah penghilangan filter atau setelah setiap
sampel (seperti dijelaskan di atas) karena tingginya jumlah bakteri coliform dan flora latar
belakang yang ada dalam sampel ini. D. Sampel QC: Periksa sterilitas dan kontaminasi coliform di
awal dan akhir setiap rangkaian filtrasi, masing-masing, dengan menyaring 20 hingga 30 mL air
pengencer atau bilas melalui filter (satu corong per batch sterilisasi). Jika kontrol menunjukkan
kontaminasi, tolak semua data dari sampel yang terpengaruh dan minta sampel baru. Selain itu,
untuk memeriksa kemungkinan kontaminasi silang atau air bilasan yang terkontaminasi,
masukkan sampel air bilasan steril (100 mL) setelah penyaringan 10 sampel. Inkubasi sampel QC
ini di bawah kondisi yang sama dengan sampel yang dianalisis. e. Teknik pengayaan alternatif:
Gunakan teknik ini hanya dengan media m-Endo LES. Tempatkan bantalan penyerap steril di
tutup cawan biakan steril, dan pipet setidaknya 2,0 mL kaldu lauril triptosa (disiapkan sesuai
petunjuk pada Bagian 9221B.3a) ke bantalan jenuh. Keluarkan cairan berlebih dengan hati-hati
dari bantalan penyerap dengan pelat decanting. Tempatkan filter secara aseptis-melalui mana
sampel telah dilewatkan-pada pad. Inkubasi filter, tanpa cawan pembalik, selama 1,5 hingga 2
jam pada suhu 35 ± 0,5°C dalam atmosfer dengan kelembapan relatif minimal 60%. Keluarkan
biakan pengayaan dari inkubator, angkat filter dari bantalan pengayaan, dan gulingkan ke
permukaan agar m-Endo LES, yang telah dibiarkan mencapai suhu kamar. Penempatan filter yang
salah langsung terlihat jelas karena tambalan membran yang tidak ternoda menunjukkan udara
yang terperangkap. Jika tambalan seperti itu muncul, pasang kembali filter dengan hati-hati pada
permukaan agar. Jika media kaldu digunakan, siapkan biakan akhir dengan membuang biakan
pengayaan dari inkubator dan pisahkan bagian cawan. Tempatkan pembalut steril baru

di dasar piring, jenuh dengan setidaknya 2,0 mL media m-Endo, dan dengan hati-hati buang
kelebihan cairan dari bantalan penyerap dengan piring tuang. Pindahkan filter, dengan tindakan
pencegahan yang sama seperti di atas, ke bantalan baru. Buang bantalan pengayaan bekas.
Dengan media agar atau kaldu dan menggunakan prosedur dua langkah ini, balik cawan dan
inkubasi selama 22 ± 2 jam pada suhu 35 ± 0,5°C. Lanjutkan ke ¶f di bawah ini. F. Penghitungan:
Untuk menghitung unit pembentuk koloni (CFU) pada filter membran Endotype, gunakan
mikroskop binocular wide-field dissecting daya rendah (10 hingga 15x perbesaran) atau
perangkat optik lainnya, dengan sumber cahaya neon putih dingin yang diarahkan untuk
memberikan tampilan kemilau yang optimal. Sudut cahaya pada koloni mempengaruhi
pendeteksian kemilau untuk koloni coliform yang tumbuh pada lempeng m-Endo. Menggoyang
dan memutar pelat Petri memantulkan cahaya pada sudut yang berbeda dan membantu
mendeteksi kemilau pada koloni. Koloni koliform yang khas pada media tipe Endo berwarna
merah jambu hingga merah tua dengan kemilau permukaan metalik. Hitung koloni koliform
tipikal dan atipikal segera setelah inkubasi. Area kemilau dapat bervariasi dalam ukuran dari
kepala peniti kecil hingga menutupi seluruh permukaan koloni. Koloni koliform atipikal dapat
berwarna merah tua, mukoid, atau berinti tanpa kemilau. Umumnya koloni berwarna merah
muda, biru, putih, atau tidak berwarna yang kurang berkilau dianggap nonkoliform. Jumlah koloni
noncoliform yang tinggi (>200 CFU) dapat mengganggu perkembangan maksimum coliform.
Mendinginkan biakan dengan koloni nonkoliform berdensitas tinggi (setelah inkubasi) selama 0,5
hingga 1 jam sebelum penghitungan dapat membantu membedakan kemilau. Sampel air yang
didesinfeksi atau limbah air limbah mungkin termasuk organisme yang tertekan yang tumbuh
relatif lambat dan menghasilkan kemilau maksimum dalam 22 hingga 24 jam. e 8. Verifikasi
Coliform: Kadang-kadang pada media tipe Endo, organisme noncoliform dapat menghasilkan
koloni kemilau yang khas, dan koloni atipikal (koloni berwarna merah muda, merah tua, atau
berinti tanpa kemilau) dapat berupa koliform; dengan demikian verifikasi semua jenis koloni
tipikal dan atipikal direkomendasikan. Verifikasi semua koloni pada media Endo dengan
mengusap seluruh membran atau mengambil setidaknya lima koloni tipikal dan lima koloni
atipikal dari biakan filter membran tertentu. (Lihat Bagian 9020B.9.) Berdasarkan kebutuhan dan
jenis sampel, laboratorium dapat menerapkan tindakan QC yang lebih ketat (misalnya, untuk
sampel yang tidak dapat diminum, verifikasi setidaknya satu koloni dari setiap jenis koloni tipikal
atau atipikal dari kultur filter membran tertentu, atau verifikasi 10% sampel positif). Sesuaikan
hitungan berdasarkan hasil verifikasi. Tes verifikasi tercantum di bawah ini. T 1) Fermentasi
laktosa - Transfer pertumbuhan dari setiap koloni, atau usap seluruh membran dengan kapas
steril (untuk hasil ada-tidaknya) dan tempatkan dalam kaldu lauril triptosa berkekuatan tunggal;
inkubasi kaldu pada 35 ± 0,5 ° C hingga 48 jam. Gas yang terbentuk dalam kaldu triptosa lauril
dan dikonfirmasi dalam kaldu laktosa hijau cemerlang dalam waktu 48 jam memverifikasi koloni
sebagai coliform. (Lihat Bagian 9221B.3 dan 4 untuk persiapan media.) Inokulasi simultan dari
kedua media dapat diterima (jika menggunakan loop, jarum, atau tongkat kayu steril yang sama,
inokulasi kaldu triptosa lauril terlebih dahulu). Termasuk inokulasi kaldu EC yang diinkubasi pada
suhu 44,5 ± 0,2°C selama 24 ± 2 jam akan memberikan informasi keberadaan coliform
termotoleran. Termasuk inokulasi EC-MUG yang diinkubasi pada suhu 44,5±0,2°C selama 24 jam
akan memberikan informasi keberadaan E. coli. Urutan inokulasi harus selalu dari yang paling
sedikit sampai yang paling menghambat (1) EC atau EC-MUG, 2) kaldu lauril triptosa, 3) kaldu
laktosa hijau cemerlang]. (Lihat 9222G dan H untuk prosedur partisi MF.)

2) Verifikasi coliform alternatif - Terapkan prosedur verifikasi coliform alternatif ini ke koloni
terisolasi pada media filter membran Endo. Jika kultur campuran dicurigai atau jika pemisahan
koloni <2 mm, goreskan pertumbuhan ke media m-Endo atau agar MacConkey untuk memastikan
kemurnian kultur atau serahkan pertumbuhan campuran ke metode tabung fermentasi. a) Uji
cepat – Verifikasi cepat koloni menggunakan reaksi uji untuk sitokrom oksidase (CO) dan B-
galaktosidase. Reaksi Coliform adalah CO negatif dan B-galaktosidase positif dalam 4 jam inkubasi
kultur tabung atau prosedur uji mikro (spot). b) Sistem multi-tes komersial- Verifikasi dan/atau
identifikasi bakteri coliform dengan memilih koloni yang terisolasi dengan baik, gores untuk
isolasi, dan inokulasi koloni murni ke dalam sistem identifikasi multi-tes untuk Enterobacteriaceae
yang mencakup fermentasi laktosa dan/ atau reaksi uji B-galaktosidase dan CO.

5. Perhitungan Kepadatan Coliform Pilih membran dengan jumlah koloni yang dapat diterima
(Tabel 9222:II) dan ≤200 unit pembentuk koloni (CFU) dari semua jenis per membran, dengan
persamaan berikut

Untuk sampel air minum, jika tidak ditemukan koloni koliform total, laporkan koloni koliform total
yang dihitung sebagai "<1 CFU/100 mL" atau laporkan "total bakteri koliform yang tidak ada per
100 mL sampel". Untuk sampel air yang tidak dapat diminum, jika bagian 10,0-, 0,1-, dan 0,01-mL
diperiksa dan semua hitungan adalah 0, maka hitung jumlah koliform per 100 mL yang akan
dilaporkan jika terdapat 1 CFU pada filter yang mewakili volume filtrasi terbesar. Misalnya,
laporkan <10 CFU/100 mL untuk volume sampel 10 mL tanpa koloni coliform, yaitu,

Untuk jumlah coliform terverifikasi, sesuaikan jumlah awal berdasarkan persentase verifikasi
positif (baik tipikal maupun atipikal) dan laporkan sebagai berikut:
A. Air minum: Dalam Total Coliform Rule-nya, U.S. Environmental Protection Agency (EPA)
hanya mensyaratkan catatan ada atau tidaknya total coliform dalam 100 mL sampel air minum,
namun, informasi kuantitatif dapat menunjukkan besarnya peristiwa kontaminasi dan/atau
progres remediasi, terutama saat membandingkan hasil sampel dari lokasi yang berbeda (mis.,
sampel berulang). Informasi kuantitatif hanya menyediakan sebuah.

estimasi kasar populasi coliform aktual pada waktu pengumpulan karena distribusi yang tidak
seragam dalam matriks. Dalam air minum yang baik, umumnya akan terjadi coliform minimal.
Oleh karena itu, hitung semua koloni coliform (tanpa menghiraukan batas bawah 20 yang dikutip
di atas) dan gunakan rumus yang diberikan di atas mendapatkan kerapatan koliform. Jika
pertumbuhan konfluen terjadi—menutupi seluruh area filtrasi membran atau sebagian darinya
dengan koloni yang tidak terpisah—laporkan hasilnya sebagai "pertumbuhan konfluen dengan
(atau tanpa) koliform." Jika jumlah total koloni bakteri- coliform ditambah non-coliform- adalah
>200 per membran atau jika koloni tidak cukup jelas untuk dihitung secara akurat, maka laporkan
hasilnya sebagai "terlalu banyak untuk dihitung" (TNTC) atau "konfluen". Untuk sampel air
minum yang menggunakan media jenis Endo, keberadaan koliform dalam biakan tersebut dapat
dipastikan (lihat 9222B.4g). Sebagai alternatif, sikat seluruh permukaan filter dengan loop steril,
tongkat aplikator, atau kapas dan inokulasikan pertumbuhan ini ke dalam 1) tabung lauril triptosa
berkekuatan tunggal dan 2) tabung kaldu empedu laktosa hijau cemerlang. Jika tabung kaldu
empedu berwarna hijau cemerlang menghasilkan gas dalam waktu 48 jam pada suhu 35 ± 0,5°C,
terdapat coliform. Untuk mematuhi Aturan Total Coliform EPA, laporkan pertumbuhan konfluen
atau TNTC dengan setidaknya satu koloni coliform yang terdeteksi (verifikasi hanya diperlukan
dengan media tipe Endo) sebagai "sampel positif coliform total". Laporkan pertumbuhan
konfluen atau TNTC tanpa koliform yang terdeteksi sebagai "tidak valid". Untuk sampel yang tidak
valid, mintalah sampel baru dari lokasi yang sama dalam waktu 24 jam. Pilih volume yang lebih
tepat untuk disaring per membran (perlu diingat bahwa standar porsi air minum adalah 100 mL,
sesuai aturan). Jadi, alih-alih menyaring 100 mL melalui satu membran, filter bagian 50 mL
melalui dua membran, bagian 25 mL melalui empat membran terpisah, dll. untuk mengurangi
interferensi karena terlalu padat. Jika ada membran yang mengandung koloni coliform total yang
terverifikasi, laporkan seluruh sampel sebagai "total coliform positif". Jika penentuan densitas
diinginkan, jumlahkan jumlah coliform yang diamati pada semua membran dan laporkan sebagai
"[angka] per 100 mL." (Alternatifnya, pilih metode coliform lain yang tidak terlalu rentan
terhadap gangguan bakteri heterotrofik.) B. Perairan lain: Seperti sampel air minum, jika tidak
ada filter yang memiliki jumlah koliform dalam kisaran ideal, jumlahkan jumlah koliform pada
semua filter dan laporkan sebagai "[angka] per 100 mL." Sebagai contoh, jika duplikat bagian 50-
mL diperiksa dan kedua membran masing-masing memiliki lima dan tiga koloni koliform, maka
laporkan jumlah koliform total sebagai 8 CFU per 100 mL:
Atau, jika porsi 50-, 25-, dan 10-mL diperiksa dan jumlahnya masing-masing adalah 15, 6, dan <1
koloni coliform, kemudian hitung berdasarkan nilai yang paling dapat diterima dan laporkan
jumlah coliform total dengan pernyataan kualifikasi sebagai "diperkirakan 30 CFU/100 mL":

Di sisi lain, jika porsi 10-, 1,0-, dan 0,1 mL diperiksa dengan jumlah 40, 9, dan <1 koloni coliform,