Pemantauan Kualitas Air - Panduan Praktis untuk Desain dan Implementasi Studi Kualitas Air Tawar dan Program

Pemantauan
Diedit oleh Jamie Bartram dan Richard Ballance
Diterbitkan atas nama Program Lingkungan Perserikatan Bangsa-Bangsa dan Organisasi Kesehatan Dunia © 1996 UNEP / WHO

ISBN 0419 22320 7 (Hbk) 0419 21730 4 (Pbk)

Bab 10 - ANALISIS MIKROBIOLOGI

Bab ini disiapkan oleh J. Bartram dan S. Pedley

Pembuangan limbah dari saluran pembuangan kota adalah salah satu masalah kualitas air terpenting di seluruh dunia. Ini
sangat penting bagi sumber air minum. Limbah kota mengandung feses manusia dan air yang terkontaminasi limbah ini
mungkin mengandung organisme patogen (penyebab penyakit) dan, akibatnya, dapat berbahaya bagi kesehatan manusia
jika digunakan sebagai air minum atau dalam penyiapan makanan. Kontaminasi feses pada air secara rutin dideteksi
dengan analisis mikrobiologi.

Tidak praktis untuk mencoba isolasi rutin patogen karena mereka terdapat dalam jumlah yang relatif kecil dibandingkan dengan
jenis mikroorganisme lainnya. Selain itu, ada banyak jenis patogen dan masing-masing memerlukan teknik isolasi mikrobiologis
yang unik. Pendekatan yang dilakukan adalah dengan menganalisis organisme indikator yang menghuni usus dalam jumlah
besar dan dibuang melalui feses manusia. Kehadiran organisme indikator ini dalam air merupakan bukti kontaminasi feses
dan, oleh karena itu, terdapat risiko adanya patogen. Jika organisme indikator ada dalam jumlah besar, kontaminasi dianggap
baru dan / atau parah.

Bakteri dalam air pada umumnya tidak hadir secara individual, tetapi sebagai rumpun atau dalam hubungan dengan materi
partikulat. Saat menghitung bakteri dalam air, yang dihitung bukanlah jumlah individu bakteri yang ada, tetapi jumlah gumpalan
bakteri atau partikel dan bakteri yang terkait dengannya. Setiap rumpun atau partikel mungkin memiliki banyak bakteri yang
terkait dengannya.

10.1 Karakteristik organisme indikator

Jumlah coliform

Istilah "total coliform" mengacu pada sekelompok besar bakteri Gram-negatif berbentuk batang yang memiliki beberapa
karakteristik. Kelompok tersebut meliputi koliform termotoleran dan bakteri asal feses, serta beberapa bakteri yang mungkin
diisolasi dari sumber lingkungan. Jadi keberadaan total coliform mungkin atau mungkin tidak menunjukkan kontaminasi feses.
Dalam kasus yang ekstrim, jumlah yang tinggi untuk total kelompok coliform dapat dikaitkan dengan jumlah yang rendah, atau
bahkan nol, untuk koliform termotoleran. Hasil seperti itu belum tentu menunjukkan adanya kontaminasi feses. Ini mungkin
disebabkan oleh masuknya tanah atau bahan organik ke dalam air atau oleh kondisi yang cocok untuk pertumbuhan jenis
coliform lainnya. Di laboratorium, total coliform ditanam di dalam atau di atas media yang mengandung laktosa, pada suhu 35
atau 37 ° C.
Koliform termotoleran (feses)

Istilah “fekal coliform” telah digunakan dalam mikrobiologi air untuk menunjukkan organisme koliform yang tumbuh pada suhu
44 atau 44,5 C dan memfermentasi laktosa untuk menghasilkan asam dan gas. Dalam praktiknya, beberapa organisme dengan
karakteristik ini mungkin bukan berasal dari feses dan oleh karena itu istilah "koliform termotoleran" lebih tepat dan menjadi
lebih umum digunakan. Meski demikian, keberadaan koliform termotoleran hampir selalu mengindikasikan kontaminasi feses.
Biasanya, lebih dari 95 persen koliform termotoleran yang diisolasi dari air adalah organisme usus Escherichia coli, keberadaannya
merupakan bukti pasti adanya kontaminasi feses. Akibatnya, seringkali tidak perlu melakukan pengujian lebih lanjut untuk
mengkonfirmasi keberadaan spesifik E. coli.

Di laboratorium, koliform termotoleran ditanam pada media yang mengandung laktosa, pada suhu 44 atau 44,5 ° C. Mereka
untuk sementara diidentifikasi dengan produksi asam dan gas dari fermentasi laktosa.

Lingkungan yang kaya nutrisi dapat mendorong pertumbuhan atau persistensi beberapa spesies koliform termotoleran
selain E. coli. Kemungkinan ini harus dipertimbangkan ketika, misalnya, diperoleh hasil yang luar biasa tinggi dari air yang
dianggap relatif bersih. Dalam kasus seperti itu, saran dari laboratorium mikrobiologi harus dicari untuk penentuan
indikator yang lebih spesifik, E. coli.

Streptokokus feses

Adanya streptokokus feses merupakan bukti kontaminasi feses. Streptokokus feses cenderung bertahan lebih lama di
lingkungan dibandingkan dengan termotoleran atau koliform total dan sangat tahan terhadap pengeringan. Oleh karena itu,
mungkin untuk mengisolasi streptokokus feses dari air yang mengandung sedikit atau tidak ada koliform termotoleran seperti,
misalnya, ketika sumber kontaminasi jauh baik dalam waktu atau ruang dari titik pengambilan sampel. Streptokokus feses
tumbuh di dalam atau di atas media yang mengandung natrium azida, pada suhu 37-44 ° C. Mereka biasanya dideteksi dengan
reduksi pewarna (umumnya senyawa yang mengandung tetrazolium) atau hidrolisis aesculin. Metode rutin dapat memberikan
"positif palsu" dan tes konfirmasi tambahan mungkin diperlukan.

Tabel 10.1 Perbandingan metode untuk analisis bakteri coliform

Teknik tabung fermentasi ganda Teknik filter membran

Lebih lambat: membutuhkan 48 jam untuk positif Lebih cepat: hasil kuantitatif dalam atau
dugaan positif sekitar 18 jam

Lebih padat karya Tidak terlalu padat karya

Membutuhkan lebih banyak media kultur Membutuhkan lebih sedikit media kultur

Membutuhkan lebih banyak peralatan gelas Membutuhkan lebih sedikit peralatan gelas

Lebih sensitif Kurang sensitif

Hasil yang diperoleh secara tidak langsung dengan pendekatan statistik (presisi Hasil diperoleh langsung dengan jumlah koloni (presisi tinggi)
rendah)

Tidak mudah beradaptasi untuk digunakan di lapangan Mudah diadaptasi untuk digunakan di lapangan

Berlaku untuk semua jenis air Tidak berlaku untuk air keruh

Bahan habis pakai sudah tersedia di sebagian besar negara Biaya bahan habis pakai tinggi di banyak negara

Dapat memberikan pemulihan yang lebih baik untuk organisme yang stres atau
rusak dalam beberapa keadaan
Jumlah pelat heterotrofik

Jumlah lempeng heterotrofik mencakup semua mikro-organisme yang mampu tumbuh di dalam atau pada media agar-agar
padat yang kaya nutrisi. Dua suhu dan waktu inkubasi digunakan: 37 ° C selama 24 jam untuk mendorong pertumbuhan bakteri
asal mamalia, dan 22 ° C selama 72 jam untuk menghitung bakteri yang terutama berasal dari sumber lingkungan. Nilai utama
penghitungan koloni terletak pada perbandingan hasil sampel yang berulang dari sumber yang sama. Jika level meningkat
secara substansial dari nilai normal, mungkin ada alasan untuk khawatir.

10.2 Memilih teknik analisis bakteriologis

Dua teknik biasanya digunakan untuk mendeteksi keberadaan koliform dalam air. Yang pertama disebut teknik "beberapa
tabung fermentasi" atau "angka paling mungkin". Dalam metode ini bagian terukur dari sampel air ditempatkan dalam tabung
reaksi yang berisi media kultur. Tabung tersebut kemudian diinkubasi untuk waktu standar pada suhu standar. Dalam teknik
kedua, volume sampel yang diukur dilewatkan melalui filter halus yang menahan bakteri. Filter kemudian ditempatkan pada
media kultur dan diinkubasi. Ini disebut teknik "filter membran". Fitur dari kedua teknik tersebut dibandingkan pada Tabel 10.1.

10.3 Teknik beberapa tabung fermentasi

Teknik tersebut telah digunakan untuk analisis air minum selama bertahun-tahun dengan hasil yang memuaskan. Ini adalah
satu-satunya prosedur yang dapat digunakan jika sampel air sangat keruh atau jika semi padat seperti sedimen atau lumpur
akan dianalisis. Prosedur yang diikuti merupakan dasar untuk analisis bakteriologis dan tes ini digunakan di banyak negara.

Merupakan kebiasaan untuk melaporkan hasil uji tabung fermentasi ganda untuk coliforms sebagai indeks angka kemungkinan
paling besar (MPN). Ini adalah indeks dari jumlah bakteri coliform yang, lebih mungkin dibandingkan dengan nomor lain, akan
memberikan hasil yang ditunjukkan oleh tes. Ini bukan hitungan jumlah sebenarnya dari bakteri indikator yang ada dalam sampel.

Prinsip

Analisis terpisah biasanya dilakukan pada lima bagian dari masing-masing dari tiga pengenceran serial sampel air. Bagian
individu digunakan untuk menginokulasi tabung media kultur yang kemudian diinkubasi pada suhu standar untuk periode waktu
standar. Keberadaan koliform ditunjukkan oleh kekeruhan dalam media kultur, perubahan pH, dan / atau adanya gas. Indeks
MPN ditentukan dengan membandingkan pola hasil positif (jumlah tabung yang menunjukkan pertumbuhan pada setiap
pengenceran) dengan tabel statistik. Nilai yang ditabulasikan dilaporkan sebagai MPN per 100 ml sampel.

Ada beberapa variasi dari teknik tabung fermentasi ganda. Prosedur yang paling umum adalah memproses lima alikuot air dari
masing-masing tiga pengenceran 10 kali lipat berturut-turut; misalnya, lima alikuot dari sampel itu sendiri, lima dari pengenceran
1/10 dari sampel dan lima dari pengenceran 1/100. Aliquot dapat berupa volume 1 ml, masing-masing ditambahkan ke 10 ml
media kultur kekuatan tunggal, atau volume 10 ml, masing-masing ditambahkan ke 10 ml media kekuatan ganda. Hasil
dibandingkan dengan nilai-nilai seperti yang diberikan pada Tabel 10.5 (lihat nanti).

Penggunaan salah satu varian teknik berikut dapat membantu mengurangi biaya analisis:
• Sejumlah kecil tabung diinkubasi pada setiap pengenceran, misalnya tiga, bukan lima. Tabel yang berbeda kemudian harus
digunakan untuk penentuan MPN (lihat Tabel 10.6 nanti). Beberapa presisi hilang, tetapi menggunakan 9 tabung bukannya 15
menghemat bahan, ruang di inkubator, dan waktu analis.

• Untuk sampel air minum, satu tabung berisi 50 ml sampel dan lima tabung berisi 10 ml sampel diinokulasi dan diinkubasi.
Hasilnya dibandingkan dengan nilai-nilai seperti yang diberikan pada Tabel 10.7 (lihat nanti) untuk mendapatkan MPN.

10.3.1 Media kultur dan air pengenceran yang disangga

Setiap bagian dari pengujian membutuhkan jenis media yang berbeda. Misalnya, saat menghitung coliform, kaldu lauryl
tryptose (laktosa) digunakan di bagian tes pertama (isolasi atau dugaan). Pada bagian kedua (konfirmasi), kaldu hijau laktosa
empedu (BGLB) digunakan untuk mengkonfirmasi total coliform dan E. coli media untuk mengkonfirmasi coliform fekal.
Beberapa karakteristik media ini dan media lain yang sesuai untuk digunakan pada sebagian besar analisis angka
kemungkinan dijelaskan pada Tabel 10.2. Media dapat dibuat dari bahan utama tetapi juga tersedia dalam bentuk sebagai
berikut:

• Serbuk kering, dikemas dalam jumlah besar (200 g atau lebih), untuk ditimbang saat media disiapkan dan dilarutkan dalam
air suling dengan volume yang sesuai, disalurkan ke tabung kultur dan disterilkan sebelum digunakan.

• Serbuk kering, dikemas dalam jumlah yang telah ditimbang sesuai untuk membuat satu kumpulan media, untuk dilarutkan
dalam air suling dengan volume yang sesuai, disalurkan ke tabung kultur dan disterilkan sebelum digunakan.

• Ampul larutan, siap pakai.

Ampul dari media siap pakai adalah bentuk yang paling nyaman tetapi paling mahal dan memiliki masa simpan terpendek.
Paket yang telah ditimbang mudah digunakan dan mengurangi risiko kesalahan dalam menyusun media. Media pasti mahal
harganya jika dikemas dalam jumlah kecil. Namun, mereka bukan komponen utama dari biaya analisis bakteriologis, dan biaya
tambahan dapat diabaikan jika dibandingkan dengan kenyamanan yang lebih besar dan pengurangan pemborosan. Botol
besar berisi media dehidrasi harus ditutup kembali dengan rapat setelah digunakan untuk mencegah pembusukan; ini sangat
penting di lingkungan yang lembab.

Media harus disimpan di tempat yang sejuk, gelap, dan kering. Setelah media disiapkan dengan melarutkan bubuk dalam air
suling, harus didistribusikan ke dalam tabung atau botol kultur dan disterilkan. Kelompok media harus diuji sebelum
digunakan, menggunakan organisme kontrol positif dan negatif yang diketahui. Jika reaksi yang sesuai tidak diamati, media
dan organisme pengontrol harus diselidiki dan pengujian diulang. Media harus segera digunakan tetapi dapat disimpan
selama beberapa hari asalkan tidak berisiko terkontaminasi.

Larutan stok air pengenceran buffer dibuat dengan melarutkan 34,0 g kalium
dihidrogen fosfat, KH 2 PO 4, dalam 500 ml air suling. PH diperiksa dan, jika perlu, diatur ke 7,2 dengan penambahan
sejumlah kecil 1 mol l- Larutan NaOH.
1

Air suling ditambahkan untuk menambah volume akhir menjadi 1 liter. Air yang disangga disimpan dalam botol tertutup rapat
di lemari es.
Untuk menyiapkan botol air pengenceran, 1,25 ml larutan stok ditambahkan ke 1 liter air suling, dicampur dengan baik dan
disalurkan ke dalam botol pengenceran dalam jumlah yang akan memberikan, setelah sterilisasi, 9 atau 90 ml. Botol ditutup
longgar, ditempatkan dalam autoklaf, dan disterilkan selama 20 menit pada 121 ° C. Setelah botol dikeluarkan dari autoclave,
tutupnya harus dikencangkan dan botol disimpan di tempat yang bersih sampai dibutuhkan.

Tabel 10.2 Media kultur untuk analisis angka probabilitas tertinggi (MPN)

Medium Kegunaan Suhu inkubasi Catatan

Media isolasi
Kaldu laktosa Total atau 48 jam pada 35 ± 0,5 ° C atau 37 Siapkan media kekuatan tunggal ± 0,5 ° C untuk
termotoleran total coliform dengan menipiskan kekuatan ganda
coliforms dan 24 jam pada 44 ± 0,25 ° C medium dengan air suling. atau 44,5 ± 0,25 ° C
untuk Setiap tabung atau botol harus
koliform termotoleran mengandung tabung fermentasi terbalik
(Durham)

MacConkey Total atau 48 jam pada 35 ± 0,5 ° C atau 37 ± 0,5 ° C

kaldu termotoleran untuk total coliforms dan 24 jam pada 44 ±
coliforms 0,25 ° C atau 44,5 ± 0,25 ° C untuk

koliform termotoleran

Ditingkatkan Total atau 48 jam pada 35 ± 0,5 ° C atau 37 Tersedia secara komersial dalam ± 0,5 ° C untuk
format termotoleran laktosa total coliform bentuk dehidrasi sebagai Mineral
glutamat coliforms dan 24 jam pada 44 ± 0.25 ° C Modified Glutamate Medium atau 44.5 ± 0.25 ° C
medium untuk
koliform termotoleran

Lauryl tryptose Total atau kaldu 48 jam pada 35 ± 0,5 ° C atau 37 ± 0,5 ° C
(laktosa) termotoleran untuk total coliforms dan 24 jam pada 44 ±
coliforms 0,25 ° C atau 44,5 ± 0,25 ° C untuk

koliform termotoleran

Media konfirmasi
Hijau cemerlang Total atau 44.5 ± 0.25 ° C untuk
empedu laktosa termotoleran koliform termotoleran
kaldu coliforms (gas
produksi)

Media EC Termotoleran 44.5 ± 0.25 ° C untuk Penambahan 1% (m / m) L- atau DL-

coliforms (indole koliform termotoleran triptofan dapat membaik
produksi) kinerja medium

Air tryptone Termotoleran 44.5 ± 0.25 ° C untuk

coliforms (gas + koliform termotoleran
produksi indole)

Lauryl triptose Termotoleran 44.5 ± 0.25 ° C untuk

kaldu manitol coliforms (gas + koliform termotoleran
dengan triptofan produksi indole)

Sumber: Diadaptasi dari ISO, 1990b

10.3.2 Prosedur

Prosedur yang dijelaskan di bawah ini untuk lima tabung di masing-masing dari tiga pengenceran sampel dan memberikan
konfirmasi untuk koliform total dan termotoleran (fekal). Jika lebih sedikit tabung (misalnya tiga dari masing-masing dari tiga
pengenceran sampel atau satu bagian 50-ml dan lima 10-ml) diinokulasi, indeks MPN harus ditentukan dari tabel khusus untuk
kombinasi tabung dan pengenceran yang digunakan.
Aparat

√ Incubator (s) atau penangas air yang mampu mempertahankan suhu antara ± 0,5 ºC dari 35 dan 37 ºC dan dalam ± 0,25 ºC
pada 44 dan 44,5 ºC. Pilihan suhu tergantung pada bakteri indikator dan media.

√ Autoclave untuk mensterilkan peralatan gelas dan media kultur. Ukuran yang dibutuhkan tergantung pada volume pekerjaan
yang akan dilakukan. Kapasitas 100-150 liter akan dibutuhkan untuk laboratorium ukuran sedang yang melaksanakan pekerjaan
secara rutin.

√ Peralatan destilasi, dengan kapasitas penyimpanan minimal 20 liter air suling.

√ Timbangan laboratorium, akurasi ± 0,05 g, dengan sendok penimbangan. Ini dapat diabaikan jika media kultur dan kalium dihidrogen
fosfat tersedia dalam kemasan yang telah ditimbang sebelumnya dengan ukuran yang sesuai.

√ Rak untuk tabung dan botol media kultur siap pakai dan air pengenceran. Ini harus sesuai dengan autoclave.

√ Pipet, dapat digunakan kembali, gelas, kapasitas 10 ml lulus dalam divisi 0,1 ml, dan kapasitas 1 ml lulus dalam divisi 0,01
ml.

√ Tabung reaksi, 20 × 150 mm untuk 10 ml sampel + 10 ml media kultur, dengan tutup selip logam.

√ Botol, dengan tutup longgar, dikalibrasi pada 50 dan 100 ml, untuk 50 ml sampel + 50 ml media kultur.

√ Silinder ukur, plastik atau kaca yang tidak bisa pecah, kapasitas 100, 250, 500 dan 1.000 ml.

√ Rak tabung reaksi untuk menampung tabung dalam inkubator dan selama penyimpanan.

√ Termometer untuk memeriksa kalibrasi inkubator atau penangas air.

√ Kulkas untuk penyimpanan media kultur yang sudah disiapkan.

√ Alat sterilisasi udara panas untuk mensterilkan pipet.

√ Pembakar bunsen atau lampu alkohol.

√ Tabung Durham, 6 × 30 mm.

√ Kaleng pipet untuk mensterilkan pipet.

√ Labu untuk persiapan media kultur.

√ Mencuci botol.

√ Bola lampu pipet.

√ Loop kawat untuk media inokulasi, dan kabel cadangan.

√ Sudip.

√ Wadah untuk pipet bekas.

√ Kuas untuk membersihkan peralatan gelas (beberapa ukuran).

√ Alat pemadam kebakaran dan kotak P3K.

√ Alat lain-lain.

√ Tempat sampah.

Bahan habis pakai

√ Media kultur: misalnya kaldu lauryl tryptose, broth green lactose bile (BGLB) broth, dan E. coli medium.

√ Disinfektan untuk membersihkan permukaan laboratorium dan wadah pembuangan pipet.

√ Detergen untuk membersihkan peralatan dan gelas.

√ Air pengenceran dengan buffer fosfat.

√ Pita autoklaf.

Tabel 10.3 Volume sampel khas dan jumlah tabung untuk beberapa analisis tabung fermentasi

Jenis sampel Volume sampel (ml)

50 10 1 0,1 0,01
Air minum yang diolah 1 5
Air minum yang diolah sebagian 555

Air rekreasi 555

Sumber air yang dilindungi 555

Permukaan air 55 5

Volume 0,1 dan 0,01 ml sampel diperoleh dengan penambahan 1 ml pengenceran 1/10 dan 1/100, masing-masing, sampel
ke 10 ml media kultur kekuatan tunggal.

Prosedur

catatan: Teknik aseptik harus digunakan.

1. Siapkan jumlah tabung media kultur yang dibutuhkan. Volume dan kekuatan (tunggal atau ganda) media dalam tabung akan
bervariasi tergantung pada kepadatan bakteriologis yang diharapkan dalam air dan seri pengenceran yang direncanakan. Untuk
sebagian besar air permukaan, volume medium kekuatan tunggal 10 ml sudah sesuai.

2. Pilih dan siapkan berbagai pengenceran sampel; ini biasanya akan disarankan oleh pengalaman. Pengenceran yang
direkomendasikan untuk digunakan ketika tidak ada pengalaman dengan sampel dari stasiun tersebut diberikan dalam Tabel 10.3.
Untuk menyiapkan seri pengenceran 1/10, campur botol sampel
baik. Pipet 10 ml sampel ke dalam botol pengenceran berisi 90 ml air pengenceran buffer fosfat. Untuk membuat 1/100
pengenceran, campurkan 1/10 botol pengenceran dengan baik dan pipet 10 ml isinya ke dalam botol berisi 90 ml air
pengenceran. Pengenceran selanjutnya dilakukan dengan cara yang sama. Sebagai alternatif, 1 ml sampel dapat ditambahkan
ke botol yang berisi 9 ml air pengenceran.

3. Pipet sampel dengan volume yang sesuai dan sampel diencerkan ke dalam tabung media, seperti yang ditunjukkan pada Gambar
10.1a.

4. Labeli tabung dengan nomor referensi sampel, pengenceran dan volume sampel (atau pengenceran) yang ditambahkan ke
tabung. Kocok perlahan untuk mencampurkan sampel dengan media. Tempatkan rak di inkubator atau penangas air selama 48 jam
pada suhu 35 ± 0,5 ºC atau 37 ± 0,5 ºC.

5. Setelah 18 atau 24 jam, catat tabung mana yang menunjukkan pertumbuhan. Reaksi tercantum dalam Tabel 10.4. Tabung
yang menunjukkan kekeruhan dan produksi gas, atau perubahan warna yang menunjukkan produksi asam (jika media berisi
indikator pH), dianggap positif. Catat jumlah tabung positif pada setiap pengenceran, seperti yang ditunjukkan pada Gambar
10.1b. Kembalikan tabung ke inkubator dan periksa kembali setelah total 48 jam inkubasi. Lanjutkan dengan langkah prosedur
selanjutnya.

6. Siapkan jumlah tabung media kultur konfirmasi yang diperlukan (kaldu BGLB untuk total coliform dan E. coli media untuk fekal
coliform). Menggunakan loop kawat steril, transfer inokula dari tabung positif ke media konfirmasi, seperti yang ditunjukkan pada
Gambar 10.1c. Sterilkan loop di antara transfer yang berurutan dengan memanaskan dalam nyala api sampai merah panas.
Biarkan dingin sebelum digunakan. Jika konfirmasi total dan fekal coliform diperlukan, BGLB dan an E. coli

tabung medium harus diinokulasi dari setiap dugaan positif. Labeli tabung ini dengan hati-hati dengan kode yang sama yang
digunakan dalam uji dugaan dan inkubasi selama 48 jam pada 35 ± 0,5 ° C atau 37 ± 0,5 ° C untuk total coliforms (kaldu
BGLB) atau selama 24 jam pada 44 ± 0,5 ° C untuk feses coliforms ( E. coli medium).

7. Setelah waktu inkubasi yang ditentukan, catat tabung mana yang menunjukkan pertumbuhan dengan produksi gas, dan catat jumlah
positif untuk setiap pengenceran sampel seperti yang ditunjukkan pada Gambar 10.1d.

8. Bandingkan pola hasil positif dengan tabel bilangan yang paling mungkin seperti yang diberikan pada Tabel 10.5, 10.6 dan
10.7.
Gambar 10.1 Langkah-langkah dalam teknik tabung fermentasi ganda

Sebuah. Sampel pipet ke dalam tabung fermentasi

b. Hitung nilai dugaan setelah inkubasi 24 jam

c. Inokulasi tabung fermentasi dengan wire loop untuk uji konfirmasi

 ⇓

d. Hitung hasil tes yang dikonfirmasi setelah inkubasi lengkap

Tabel 10.4 Reaksi mengikuti analisis dengan metode MPN

Medium Reaksi

Total coliform pada 35 atau 37 ° C Koliform termotoleran pada 44 atau

44,5 ° C

Media isolasi
Kaldu laktosa Gas terlihat di bagian terbalik Sama dengan total coliform pada suhu 35 atau 37 ° C
fermentasi (Durham) tabung ditambah
kekeruhan medium

Kaldu MacConkey Gas terlihat di bagian terbalik Sama dengan total coliform pada suhu 35 atau 37 ° C
fermentasi (Durham) tabung ditambah
kekeruhan medium

Format yang ditingkatkan Gas terlihat di bagian terbalik Sama dengan total coliform pada suhu 35 atau 37 ° C
laktosa glutamat fermentasi (Durham) tabung ditambah
medium kekeruhan medium

Lauryl tryptose (lactose) Gas terlihat di kaldu terbalik Sama dengan total coliform pada suhu 35 atau 37 ° C
fermentasi (Durham) tabung ditambah
kekeruhan medium

Media konfirmasi
Laktosa hijau cemerlang Gas terlihat di bagian terbalik Sama dengan total coliform pada suhu 35 atau 37 ° C
kaldu empedu fermentasi (Durham) tabung ditambah
kekeruhan medium

Media EC Gas terlihat di bagian terbalik Sama dengan total coliform pada suhu 35 atau 37 ° C
fermentasi (Durham) tabung ditambah
kekeruhan medium

Air tryptone Tambahkan reagen KOVACS ke tabung; warna merah

menunjukkan adanya indole

Manitol Lauryl triptose Memungkinkan deteksi produksi gas + indol

kaldu dengan triptofan dalam tabung yang sama

Sumber: Diadaptasi dari ISO, 1990b

Tabel 10.5 Indeks MPN dan batas kepercayaan 95 persen untuk berbagai kombinasi hasil positif ketika lima tabung digunakan
per pengenceran (10 ml, 1,0 ml, 0,1 ml bagian sampel)

Kombinasi indeks MPN keyakinan 95% Kombinasi indeks MPN keyakinan 95%
batas batas
positif per 100 ml positif per 100 ml
Atas Bawah Atas Bawah
0-0-0 <2 - - 4-2-0 22 9.0 56

0-0-1 2 1.0 10 4-2-1 26 12 65

0-1-0 2 1.0 10 4-3-0 27 12 67

0-2-0 4 1.0 13 4-3-1 33 15 77
4-4-0 34 16 80
1-0-0 2 1.0 11 5-0-0 23 9.0 86

1-0-1 4 1.0 15 5-0-1 30 10 110

1-1-0 4 1.0 15 5-0-2 40 20 140

1-1-1 6 2.0 18 5-1-0 30 10 120

1-2-0 6 2.0 18 5-1-1 50 20 150

5-1-2 60 30 180
2-0-0 4 1.0 17 5-2-0 50 20 170

2-0-1 7 2.0 20 5-2-1 70 30 210

2-1-0 7 2.0 21 5-2-2 90 40 250

2-1-1 9 3.0 24 5-3-0 80 30 250

2-2-0 9 3.0 25 5-3-1 110 40 300

2-3-0 12 5.0 29 5-3-2 140 60 360

3-0-0 8 3.0 24 5-3-3 170 80 410

3-0-1 11 4.0 29 5-4-0 130 50 390

3-1-0 11 4.0 29 5-4-1 170 70 480

3-1-1 14 6.0 35 5-4-2 220 100 580

3-2-0 14 6.0 35 5-4-3 280 120 690

3-2-1 17 7.0 40 5-4-4 350 160 820

4-0-0 13 5.0 38 5-5-0 240 100 940

4-0-1 17 7.0 45 5-5-1 300 100 1.300

4-1-0 17 7.0 46 5-5-2 500 200 2.000

4-1-1 21 9.0 55 5-5-3 900 300 2.900

4-1-2 26 12.0 63 5-5-4 1.600 600 5.300

5-5-5 > 1.600 - -

Sumber: Setelah APHA, 1992

Tabel 10.6 Indeks MPN untuk berbagai kombinasi hasil positif ketika tiga tabung digunakan per pengenceran (10 ml, 1,0
ml dan 0,1 ml bagian sampel)

Jumlah tabung yang memberikan reaksi positif dari MPN 3 10 ml

masing-masing 3 ml masing-masing 3 0,1 ml

0 0 0 <3
0 0 1 3

0 1 0 3

1 0 0 4
1 0 1 7

1 1 0 7
1 1 1 11

1 2 0 11

2 0 0 9
2 0 1 14

Sumber: Setelah WHO, 1985

Tabel 10.7 Indeks MPN dan batas kepercayaan 95 persen untuk berbagai kombinasi hasil positif untuk satu set sampel 50 ml
dan lima bagian 10 ml

Jumlah tabung Indeks MPN keyakinan 95%

memberikan reaksi positif per 100 ml batas
1 × 50 ml 5 × 10 ml Atas Bawah
0 0 <1

0 1 1 0,5 4
0 2 2 0,5 6

0 3 4 0,5 11

0 4 5 1 13
0 5 7 2 17

1 0 2 0,5 6

1 1 3 0,5 9
1 2 6 1 15

1 3 9 2 21

1 4 16 4 40
1 5 > 18

Sumber: After Department of Health and Social Security, 1982

10.4 Teknik filter membran

Teknik filter membran dapat digunakan untuk menguji sampel dalam jumlah yang relatif besar dan memberikan hasil lebih cepat
daripada teknik tabung fermentasi ganda. Ini awalnya dirancang untuk digunakan di laboratorium tetapi peralatan portabel
sekarang tersedia yang memungkinkan penggunaan teknik tersebut di lapangan. Nama dan alamat beberapa produsen
peralatan portabel diberikan dalam Lampiran 1.
Prinsip

Metode filter membran memberikan penghitungan langsung dari total coliform dan fekal coliform yang ada dalam sampel air
tertentu. Volume air yang diukur disaring, di bawah vakum, melalui membran selulosa asetat dengan diameter pori seragam,
biasanya 0,45 µ m. Bakteri tertahan di permukaan membran yang ditempatkan pada media selektif yang sesuai dalam wadah
steril dan diinkubasi pada suhu yang sesuai. Jika coliform dan / atau fecal coliforms terdapat dalam sampel air, karakteristik
bentuk koloni yang dapat dihitung secara langsung.

Teknik ini tidak cocok untuk perairan alami yang mengandung bahan tersuspensi, lumpur, dan sedimen yang sangat tinggi,
yang semuanya dapat menghalangi filter sebelum volume air yang cukup melewatinya. Jika sampel dalam jumlah kecil
(misalnya, limbah buangan atau air permukaan yang sangat tercemar) akan diuji, sebagian sampel harus diencerkan dalam
pengencer steril untuk memastikan bahwa ada volume yang cukup untuk menyaring seluruh permukaan. dari membran.

Volume yang disarankan untuk disaring untuk air dari sumber yang berbeda tercantum dalam Tabel 10.8. Jika kualitas air
sama sekali tidak diketahui, atau ada keraguan mengenai kemungkinan kepadatan bakteri, disarankan untuk menguji dua
volume atau lebih untuk memastikan bahwa jumlah koloni pada membran akan berada dalam kisaran optimal untuk
penghitungan (mis. 20-80 koloni per membran). Jika volume sampel yang sesuai tidak dapat disaring melalui satu membran,
sampel dapat disaring melalui dua atau lebih dan jumlah koloni pada membran ditambahkan untuk memberikan jumlah total
sampel.

Teknik filtrasi membran dan penghitungan koloni mengasumsikan bahwa setiap bakteri, rumpun bakteri, atau partikel dengan
bakteri yang menempel, akan memunculkan satu koloni yang terlihat. Masing-masing gumpalan atau partikel ini, oleh karena
itu, merupakan satuan pembentuk koloni (cfu) dan hasilnya dinyatakan sebagai satuan pembentuk koloni per satuan volume.
Dalam kasus bakteri koliform termotoleransi, hasil harus dilaporkan sebagai koliform termotoleran [No.] cfu per 100 ml.

Tabel 10.8 Volume sampel khusus untuk analisis filtrasi membran

Jenis sampel Volume sampel (ml)

100 10 1 0.1 0,01 0,001
1 1,2 1,2 1,2

Air minum yang diolah x

Air minum yang diolah sebagian Air x x

rekreasi x x

Sumber air yang dilindungi xx

Permukaan air x x
Air limbah x x x

Pembuangan dari pabrik pengolahan limbah Kolam, x x x

sungai, limpasan air hujan Limbah mentah x x x

x x x
1 Volume kecil harus ditambahkan ke peralatan filtrasi bersama dengan minimal 9 ml pengencer steril untuk memastikan

penyebaran yang memadai di seluruh permukaan membran filter

2 Volume 1,0, 0,1, 0,01 dan 0,001-ml disaring setelah terlebih dahulu menyiapkan pengenceran sampel secara serial.

Untuk menyaring:
1.0 ml sampel, gunakan 10 ml pengenceran 1/10
0,1 ml sampel, gunakan 10 ml pengenceran 1/100
0,01 ml sampel, gunakan 10 ml pengenceran 1 / 1.000
0,001 ml sampel, gunakan 10 ml pengenceran 1 / 10.000
10.4.1 Media kultur dan air pengenceran yang disangga

Komentar umum tentang media di bagian yang ditujukan untuk teknik beberapa tabung fermentasi (bagian 10.3.1) juga relevan
di sini. Media yang dapat digunakan dijelaskan pada Tabel 10.9. Larutan stok air pengenceran buffer disiapkan seperti yang
dijelaskan di bagian
10.3.1 dan disimpan dalam botol tertutup rapat di lemari es.

Untuk menyiapkan botol air pengenceran, 1,25 ml larutan stok ditambahkan ke 1 liter air suling, dicampur dengan baik dan
disalurkan ke dalam botol pengenceran dalam jumlah yang akan memberikan, setelah sterilisasi, 9 ± 0,5 ml. Botol ditutup
longgar, ditempatkan dalam autoklaf dan disterilkan selama 20 menit pada 121 ° C. Setelah botol dikeluarkan dari autoclave,
tutupnya harus dikencangkan dan botol disimpan di tempat yang bersih sampai dibutuhkan.

Pasokan air suling berkualitas baik mungkin tidak tersedia jika peralatan filter membran digunakan di lapangan. Beberapa
alternatifnya adalah:

• Air hujan, yang biasanya rendah padatan terlarut dan, jika disaring melalui alat penyaring membran, harus bebas dari
padatan tersuspensi dan bakteri. Di beberapa daerah, air hujan mungkin bersifat asam, oleh karena itu, pH harus diperiksa
sebelum air digunakan untuk persiapan media kultur.

• Paket deionisasi, yang tersedia dari pemasok komersial dan, jika digunakan sesuai dengan petunjuk pabrik, akan
memasok air dengan kualitas baik. Mereka mungkin mahal dan tidak tersedia di beberapa negara.

• Air untuk aki mobil, yang sering tersedia di stasiun tempat penjualan bahan bakar kendaraan. Namun, kemurniannya mungkin
lebih rendah dari yang diinginkan dan mungkin harus disaring melalui peralatan penyaring membran.

Kualitas air suling harus diperiksa sebelum digunakan. Konduktivitas harus kurang dari 10 µ mhos cm- dan pH harus mendekati
1

10.
Tabel 10.9 Media kultur untuk filtrasi membran

Medium Kegunaan Suhu inkubasi Catatan

Lactose TTC Total atau agar 18-24 jam pada 35 ± 0,5 ° C atau 37 ± Sesuaikan pH sebelum sterilisasi. Filter suplemen
dengan termotoleran 0,5 ° C untuk total TTC untuk mensterilkan. Tergitol
Tergitol 7 coliforms coliforms dan 18-24 jam setelah suplemen disterilkan dengan autoklaf. 44 ± 0.25 ° C
atau 44.5 ± 0.25 Suplemen Tergitol dan TTC hingga ° C untuk thermotolerant
ditambahkan secara aseptik. Piring yang sudah disiapkan
coliforms memiliki maks. umur simpan 10 hari. Simpan dalam gelap.

Laktosa agar Total atau 18-24 jam pada 35 ± 0,5 ° C atau 37 ± Piring yang sudah disiapkan memiliki maks. umur simpan 10
dengan Tergitol 7 termotoleran 0,5 ° C untuk total hari. Simpan piring yang sudah disiapkan pada jam 4
coliforms coliforms dan 18-24 jam pada ° C. 44 ± 0.25 °
C atau 44.5 ± 0.25 ° C untuk thermotolerant

coliforms
Selaput Total atau 18-24 jam pada 35 ± 0,5 ° C atau 37 ± Periksa pH sebelum sterilisasi
penyuburan termotoleran 0,5 ° C untuk total
dengan Teepol coliforms coliforms dan 18-24 jam pada 44 ± 0.25
kaldu ° C atau 44.5 ± 0.25 ° C untuk
thermotolerant
coliforms
Selaput Total atau 18-24 jam pada 35 ± 0,5 ° C atau 37 ± Periksa pH sebelum sterilisasi
termotoleran lauryl sulfat 0,5 ° C untuk total
kaldu coliforms coliforms dan 18-24 jam pada 44 ± 0.25
° C atau 44.5 ± 0.25 ° C untuk
thermotolerant
coliforms
Endo medium Total coliforms 35-37 ° C Fuchsin dasar mungkin karsinogen. Juga membutuhkan
hanya etanol. Jangan autoclave. Media yang disiapkan memiliki
umur simpan 4 hari. Simpan media yang sudah
disiapkan pada suhu 4 ° C di tempat gelap.

LES Endo Jumlah coliform 35-37 ° C Fuchsin dasar mungkin karsinogen. Juga membutuhkan
medium hanya etanol. Jangan autoclave. Media yang disiapkan memiliki
umur simpan 2 minggu. Simpan media yang sudah
disiapkan pada suhu 4 ° C di tempat gelap.

MFC Termotoleran 44 ° C Jangan autoclave. Buang media yang tidak digunakan

coliforms setelah 96 jam. Larutan stok asam rosalat memiliki umur
simpan maksimal 2 minggu. Periksa pH sebelum
sterilisasi. Simpan media yang sudah disiapkan pada
suhu 2-10 ° C.

Sumber: Diadaptasi dari ISO, 1990a

Media kultur dan air pengenceran yang disangga dapat disiapkan di lapangan, tetapi ini membutuhkan pengangkutan semua
peralatan yang diperlukan, yang mungkin termasuk mengukur silinder, gelas kimia, air suling, botol yang dapat diautoklaf, panci
bertekanan besar dan kompor gas atau sumber lain dari panas. Porsi media dehidrasi yang telah ditimbang harus digunakan.
Media harus dicampur dengan air dan dibagikan ke dalam botol, yang masing-masing harus berisi cukup media untuk pekerjaan
satu hari. Botol-botol ini harus disterilkan di dalam panci presto selama 20 menit. Air pengenceran yang disangga harus
disiapkan, dibagikan ke dalam botol dan disterilkan.
catatan: Setiap kali panci presto digunakan, kehati-hatian harus dilakukan untuk memastikan bahwa tekanan telah turun ke
tekanan atmosfer sebelum tutupnya dibuka.

10.4.2 Prosedur

Aparat

√ Inkubator atau penangas air yang mampu mempertahankan suhu hingga ± 0,5 ° C dari 35 dan 37 ° C dan hingga ± 0,25 ° C
pada 44 dan 44,5 ° C. Pilihan suhu tergantung pada bakteri indikator dan medianya.

√ Alat filtrasi membran, lengkap dengan sumber vakum (pompa yang dioperasikan secara elektrik, pompa tangan atau
aspirator) dan labu isap.

√ Autoclave untuk mensterilkan media kultur yang sudah disiapkan. Kompor bertekanan, dipanaskan di atas piring panas atau di atas
pembakar Bunsen, dapat diganti dalam beberapa keadaan.

√ Panci mendidih atau bak (jika peralatan filtrasi akan didesinfeksi dalam air mendidih di antara penggunaan).

√ Timbangan laboratorium, akurat hingga ± 0,05 g, dan dengan sendok penimbangan. Ini dapat diabaikan jika media dan kalium
dihidrogen fosfat tersedia dalam kemasan yang telah ditimbang sebelumnya dengan ukuran yang benar.

√ Rak untuk botol media kultur siap pakai dan air pengenceran. Ini harus sesuai dengan autoclave atau
pressure-cooker.

√ Peralatan penyulingan dengan kapasitas penyimpanan minimal 5 liter air suling.

√ Kulkas untuk penyimpanan media kultur yang sudah disiapkan.

√ Alat sterilisasi udara panas untuk mensterilkan pipet dan cawan Petri kaca atau logam.

√ Termometer untuk memeriksa kalibrasi inkubator atau penangas air.

√ Kaleng pipet untuk mensterilkan pipet.

√ Kotak untuk cawan Petri untuk digunakan dalam pensteril udara panas.

√ Botol yang dapat digunakan kembali untuk media kultur.

√ Silinder ukur, kapasitas 100 ml dan 250 ml.

√ Pipet, gelas, kapasitas 1 ml dan 10 ml yang dapat digunakan kembali.

√ Botol berisi air pengenceran buffer dengan volume 9 ml.

√ Labu untuk persiapan media kultur.

√ Mencuci botol.
√ Forsep berujung tumpul.

√ Bola lampu pipet.

√ Sudip.

√ Wadah untuk pipet bekas.

√ Kuas untuk membersihkan peralatan gelas (beberapa ukuran).

√ Alat pemadam kebakaran dan kotak P3K.

√ Alat lain-lain.

√ Tempat sampah.

Peralatan filtrasi harus didisinfeksi antara analisis sampel yang berurutan dan disterilkan pada interval tertentu. Pilihan metode
akan tergantung pada jenis peralatan, di mana peralatan tersebut digunakan, peralatan yang tersedia dan pertimbangan biaya.
Sterilisasi umumnya dilakukan dengan autoklaf tetapi salah satu metode berikut cocok untuk desinfeksi antara analisis sampel
yang berurutan:

- perendaman komponen dalam air mendidih setidaknya selama 1 menit,

- pembilasan dengan metanol diikuti dengan pembilasan dengan air suling,

- menyala dengan metanol, atau

- paparan gas formaldehida yang dihasilkan dengan membakar metanol tanpa oksigen (umumnya lebih disukai sebagai
teknik lapangan).

Bahan habis pakai

√ Metanol untuk desinfektan alat filtrasi menggunakan gas formaldehida (tidak perlu di laboratorium, tetapi penting jika
analisis dilakukan di lapangan). Metanol sangat penting. Etanol atau alkohol yang dimetilasi tidak dapat diganti.

√ Filter membran, 0,45 µ m ukuran pori dan diameter yang sesuai untuk peralatan filtrasi yang digunakan dan lengkap dengan
bantalan penyerap.

√ Disinfektan untuk membersihkan permukaan laboratorium dan wadah untuk pipet yang dibuang.

√ Media budaya (opsi terdaftar di bagian media).

√ Air pengenceran dengan buffer fosfat.

√ Cawan petri, kaca atau aluminium (dapat digunakan kembali) atau plastik (sekali pakai).

√ Kantong polietilen untuk membungkus cawan Petri jika inkubator kering digunakan.

√ Lensa pembesar (sebagai bantuan untuk menghitung koloni setelah filter diinkubasi).

√ Pensil lilin untuk memberi label pada cawan Petri.

√ Pita autoklaf.

√ Detergen untuk membersihkan peralatan dan gelas.

Gambar 10.2 Langkah-langkah dalam teknik filter membran

Sebuah. Tambahkan bantalan penyerap ke cawan Petri

b. Rendam bantalan dalam media nutrisi

c. Disinfeksi ujung forsep yang ujungnya tumpul dan dinginkan

d. Hapus filter membran dari paket steril

e. Tempatkan filter membran dalam peralatan filtrasi

 ⇓

f. Tambahkan sampel ke peralatan filtrasi

g. Terapkan vakum ke labu isap

h. Hapus filter dengan forsep steril

saya. Tempatkan filter di cawan Petri yang sudah disiapkan

 ⇓

j. Beri label pada cawan Petri

k. Biarkan untuk menyadarkan dan kemudian diinkubasi

l. Hitung koloni setelah inkubasi penuh

Prosedur

1. Tambahkan bantalan penyerap ke cawan Petri steril untuk mengetahui jumlah sampel yang akan diproses. Bantalan steril dapat
ditempatkan di cawan Petri dengan tang steril atau dengan dispenser otomatis seperti yang ditunjukkan pada Gambar 10.2a.

2. Rendam pembalut dengan media nutrisi. Media nutrisi dapat dibagikan dengan pipet steril atau dengan menuangkan secara
hati-hati dari ampul atau botol, seperti yang ditunjukkan pada Gambar 10.2b. Dalam semua kasus, media harus ditambahkan
sedikit berlebihan (misalnya sekitar 2,5 ml). Segera sebelum memproses sampel, tiriskan sebagian besar media yang berlebih,
tetapi selalu pastikan ada sedikit kelebihan untuk mencegah pad mengering selama inkubasi.

catatan: Bantalan penyerap yang direndam dalam media cair dapat diganti dengan media yang dipadatkan dengan agar. Dalam
hal ini, cawan petri harus disiapkan terlebih dahulu dan disimpan di lemari es.

3. Sterilkan ujung forsep yang ujung tumpul ke dalam api dan biarkan dingin (Gambar
10.2c).

4. Hati-hati lepaskan filter membran steril dari kemasannya, pegang hanya pada tepinya seperti yang ditunjukkan pada Gambar 10.2d.
5. Tempatkan filter membran pada peralatan filter seperti yang ditunjukkan pada Gambar 10.2e, dan jepit di tempatnya. Jika
peralatan telah didisinfeksi dengan cara direbus, pastikan telah dingin sebelum memasukkan filter membran.

6. Campur sampel dengan membalik wadahnya beberapa kali. Tuang atau pipet sampel dengan volume yang diinginkan ke dalam
corong filter (lihat Gambar 10.2f). Volume ini biasanya harus dipilih berdasarkan pengalaman sebelumnya, tetapi volume yang
disarankan diberikan dalam Tabel 10.8. Jika volume yang akan disaring kurang dari 10 ml, harus dibuat paling sedikit 10 ml dengan
pengencer steril sehingga sampel akan terdistribusi secara merata ke seluruh filter selama penyaringan. Sebagai alternatif, sampel
dapat diencerkan seperti yang disarankan dalam catatan kaki 2 hingga Tabel 10.8.

7. Berikan ruang hampa ke labu isap dan tarik sampel melalui filter; putuskan hubungan vakum (Gambar 10.2g).

8. Bongkar peralatan filtrasi dan lepas filter membran dengan menggunakan tang steril, hati-hati agar hanya
menyentuh tepi filter (Gbr 10.2h).

9. Buka tutup cawan Petri yang telah disiapkan sebelumnya dan letakkan membran, sisi kisi paling atas, ke bantalan (atau
agar). Turunkan membran, mulai dari satu sisi untuk menghindari gelembung udara terperangkap. Prosedurnya
ditunjukkan pada Gambar 10.2i.

10. Pasang kembali tutup cawan Petri dan tandai dengan nomor sampel atau identifikasi lainnya (lihat Gambar 10.2j). Volume
sampel juga harus dicatat. Gunakan pensil lilin atau pulpen tahan air saat menulis di cawan Petri.

11. Jika membran akan diinkubasi pada suhu 44 atau 44,5 ° C, bakteri di atasnya mungkin memerlukan waktu untuk
menyesuaikan diri dengan media nutrisi. Setelah mengolah sampel dari daerah beriklim sedang, biarkan setiap cawan petri
pada suhu lingkungan selama 2 jam sebelum dimasukkan ke dalam inkubator. Sampel dari daerah beriklim tropis dapat
segera diinkubasi.

12. Simpan cawan petri dalam suasana lembab (misalnya dalam kantong plastik atau dalam wadah kecil dengan alas lembab
di alasnya) dan inkubasi baik dalam inkubator atau dalam tabung yang ditimbang di bak air. Ini memastikan bantalan tidak
mengering selama masa inkubasi.

13. Periode inkubasi dan suhu yang diperlukan untuk setiap media kultur tercantum dalam Tabel 10.9. Karakteristik koloni
total koliform dan koliform termotoleran yang tumbuh pada berbagai media kultur disajikan pada Tabel 10.10.

14. Setelah inkubasi, hitung koloni. Nyatakan hasilnya sebagai jumlah koloni per 100 ml sampel. Jika volume yang lebih kecil
telah digunakan, hasil dihitung dari rumus berikut:

Jumlah koloni per 100 ml = [(Jumlah koloni) / (volume tersaring)] × 100

Koloni yang dihitung pada tahap ini dianggap bakteri coliform (hasil dugaan).
Tabel 10.10 Karakteristik koloni mengikuti analisis dengan metode filtrasi membran
Medium Karakteristik koloni
Total coliform pada 35 atau 37 ° C Koliform termotoleran
pada 44 atau 44,5 ° C

Agar TTC laktosa Pewarnaan kuning, oranye atau merah bata dengan lingkaran cahaya Sama dengan total coliform pada suhu 35
dengan Tergitol 7 tengah kuning pada media di bawah membran atau 37 ° C

Agar laktosa dengan Lingkaran tengah kuning pada medium di bawah membran Sama dengan total coliform pada suhu 35
Tergitol 7 atau 37 ° C

Membran yang diperkaya warna Kuning memanjang sampai ke membran kaldu Teepol Sama dengan total coliform pada suhu 35
atau 37 ° C

Membran lauryl Warna kuning memanjang sampai ke membran Sama dengan total coliform pada suhu 35
kaldu sulfat atau 37 ° C

Endo agar atau kaldu LES Warna merah tua dengan kilau metalik hijau keemasan Warna (tak dapat diterapkan)

Endo agar merah tua dengan kilau metalik hijau keemasan (tidak berlaku) (tak dapat diterapkan)

Media MFC Koloni biru

Sumber: Diadaptasi dari ISO, 1990a

10.4.3 Tes konfirmasi

Untuk pemeriksaan air mentah atau sebagian air yang diolah, hasil dugaan mungkin memadai tetapi, dalam keadaan
tertentu lainnya, penting untuk melakukan uji konfirmasi pada subkultur murni.

Untuk memastikan hasil membran untuk total koliform, setiap koloni (atau sejumlah koloni yang representatif) disubkultur ke
dalam tabung air pepton laktosa dan diinkubasi pada suhu 35 atau 37 ° C selama 48 jam. Produksi gas dalam periode ini
menegaskan adanya total coliform.

Untuk mengkonfirmasi koliform termotoleran dan E. coli pada membran, baik diinkubasi pada suhu 35, 37 atau 44 ° C, setiap
koloni (atau sejumlah koloni yang mewakili) disubkultur ke dalam tabung air pepton laktosa dan tabung air tripton. Tabung
diinkubasi pada suhu 44 ° C selama 24 jam. Pertumbuhan dengan produksi gas dalam air pepton laktosa menegaskan adanya
koliform termotoleran. Konfirmasi dari E. coli membutuhkan penambahan 0,2-0,3 ml reagen Kovac untuk setiap biakan air
triptone. Produksi warna merah menunjukkan sintesis indol dari triptofan dan menegaskan keberadaannya E. coli.

catatan: Penggunaan kaldu manitol lauryl tryptose dengan triptofan memungkinkan produksi gas dan sintesis indol
didemonstrasikan dalam satu tabung.

10.5 Jaminan kualitas

Penjaminan kualitas dibahas secara rinci di Bab 9, yang harus dibaca bersama dengan bagian ini. Pada bagian ini, panduan
diberikan tentang aspek-aspek kendali mutu analitik yang hanya berlaku untuk laboratorium mikrobiologi, khususnya persiapan
dan kendali bahan habis pakai laboratorium (larutan media dan pengenceran, filter dan bantalan membran, peralatan plastik
dan gelas). Pemantauan peralatan laboratorium dibahas secara singkat. Pembaca yang ingin mengembangkan prosedur
kendali mutu yang lebih ketat harus mengacu pada literatur yang sesuai yang dikutip dalam bagian 10.6, seperti Metode
Standar untuk Pemeriksaan Air dan Air Limbah, yang memberikan pedoman rinci untuk pengendalian kualitas mikrobiologi.
10.5.1 Peralatan laboratorium

Bab 9 membahas tentang pemantauan dan pengendalian peralatan laboratorium, pemeliharaan catatan operasional dan
penggunaan instrumen yang dikalibrasi untuk melakukan pengukuran. Prinsip-prinsip yang dibahas di sana juga berlaku untuk
peralatan yang digunakan di laboratorium mikrobiologi. Perhatian khusus harus diberikan pada inkubator, penangas air, lemari
es dan freezer, karena pengoperasian yang benar sangat penting untuk keandalan hasil pengujian. Dianjurkan agar
pengukuran suhu dilakukan dua kali sehari: pertama di pagi hari sebelum peralatan digunakan, dan lagi di akhir hari kerja.

Inkubator, lemari es dan freezer harus dibersihkan setidaknya sebulan sekali. Petunjuk pabrik harus mencakup saran tentang
pembersihan dan mungkin merekomendasikan deterjen dan disinfektan yang sesuai. Pemandian air mungkin perlu lebih
sering dibersihkan untuk mengontrol pertumbuhan bakteri.

10.5.2 Peralatan gelas dan plastik

Beberapa deterjen dan bahan lain yang digunakan untuk membersihkan peralatan gelas laboratorium mungkin
mengandung zat yang dapat menghambat atau merangsang pertumbuhan bakteri. Sampel barang pecah belah harus
diperiksa secara teratur, misalnya sebulan sekali, jika prosedur pencucian dan produk selalu sama. Namun, jika prosedur
berubah, atau produk baru diperkenalkan, pemeriksaan tambahan harus dilakukan. Plastik laboratorium mungkin juga
mengandung residu penghambat dan setiap kelompok plastik baru harus diperiksa.

Prosedur

1. Gunakan strain tipe E. coli atau isolat laboratorium yang dikarakterisasi dengan baik. Kultur organisme semalaman dalam kaldu
nutrisi pada suhu 37 ° C, dan encerkan dalam larutan Ringer seperempat kekuatan hingga konsentrasi 50-200 unit pembentuk koloni
per ml.

2. Cuci dan bilas enam gelas cawan Petri (cawan Petri gelas juga dapat digunakan untuk mensimulasikan gelas yang sudah
dicuci) sesuai dengan praktik laboratorium biasa. Tetapkan ini sebagai grup A.

3. Cuci enam cawan Petri lagi dan bilas 12 kali dengan air kelas reagen berturut-turut. Tetapkan ini sebagai grup B.

4. Cuci enam cawan Petri lagi dengan air pencuci deterjen dan keringkan tanpa pembilasan lebih lanjut. Tetapkan ini sebagai
grup C.

5. Sterilkan cawan petri kelompok A, B dan C dengan prosedur biasa.

6. Untuk menguji peralatan plastik yang telah disterilkan sebelumnya, tunjuk enam cawan Petri plastik sebagai kelompok D.

7. Tambahkan 1 ml E. coli kultur dari langkah 1 ke setiap cawan dan aduk rata dengan 15 ml agar ekstrak ragi cair, didinginkan
hingga 50 ° C (agar nutrisi dapat diterima jika agar ekstrak ragi tidak tersedia).

8. Inkubasi piring pada 37 ° C selama 24 jam. Hitung jumlah koloni pada setiap cawan dan hitung jumlah rata-rata untuk setiap
kelompok.

9. Perbedaan jumlah rata-rata antara kelompok harus kurang dari 15 persen jika tidak ada efek toksik atau penghambatan.
Perbedaan jumlah rata-rata kurang dari 15 persen
antara kelompok A dan B, atau lebih dari 15 persen antara kelompok A dan C menunjukkan bahwa deterjen memiliki sifat
penghambat yang dihilangkan selama pencucian rutin.

10.5.3 Media

Setiap batch media baru harus diuji sterilitasnya dan kemampuannya untuk mendukung pertumbuhan organisme uji dengan
produksi reaksi biokimianya yang khas.

Sterilitas harus diuji dengan menginkubasi volume sampel medium, pada suhu yang sesuai, selama 48 jam dan mengamati
pertumbuhannya.

Kemampuan suatu media untuk mendukung pertumbuhan suatu organisme uji dan untuk membedakan organisme uji dari
organisme lain diuji dengan menginokulasi sampel media dengan organisme kontrol positif dan negatif. Kontrol positif harus
menyertakan strain tipe E. coli atau isolat laboratorium yang dikarakterisasi dengan baik. Kontrol negatif dapat mencakup satu
atau lebih hal berikut ini: Staphylococcus aureus, Pseudomonas sp., Streptococcus faecalis.

Hasil tes kontrol harus dimasukkan ke dalam buku log media. Jika kontrol positif tidak tumbuh atau tidak memberikan
karakteristik pertumbuhan yang benar, kemurnian dan identifikasi kultur uji harus diperiksa dan pengujian diulangi dengan
kultur segar yang dibuat dari sediaan beku. Jika tidak ada masalah dengan kultur uji, media baru harus disiapkan dan catatan
peralatan gelas diperiksa untuk memastikan bahwa tidak ada zat penghambat yang ditemukan selama pemeriksaan kendali
mutu. PH media juga harus diperiksa, karena perubahan pH dapat mempengaruhi karakteristik pertumbuhan suatu
organisme. Setiap kelompok media baru harus diuji bersama dengan media yang sedang digunakan.

10.5.4 Evaluasi reagen, media dan membran

Sebelum batch reagen baru, media, membran dan bantalan membran dilepaskan untuk penggunaan rutin, mereka harus
dibandingkan dengan yang saat ini digunakan. Hanya satu variabel yang harus diubah dengan setiap perbandingan.

Prosedur

1. Kumpulkan setidaknya lima sampel air positif (sampel yang terbukti terkontaminasi). Penggunaan lebih banyak
sampel akan meningkatkan sensitivitas pengujian.

2. Proses sampel menggunakan kelompok bahan uji dan kelompok yang saat ini digunakan.

3. Inkubasi piring (atau tabung).

4. Bandingkan karakteristik pertumbuhan organisme yang mengkontaminasi pada dua kelompok bahan. Catat hasil yang
tidak biasa.

5. Hitung atau hitung jumlah koloni per 100 ml, atau tentukan MPN.

6. Ubah hitungan menjadi logaritma dan masukkan hasil untuk dua kelompok bahan dalam kolom paralel.

7. Hitung selisihnya d antara dua hasil yang diubah untuk setiap sampel (termasuk tanda + atau?).

8. Hitung mean dari perbedaan dan standar deviasi.

9. Lakukan Pelajar t- uji, menggunakan jumlah sampel sebagai n.

10. Gunakan tabel Siswa untuk menentukan nilai kritis t pada tingkat signifikansi 0,05 (uji dua sisi). Beberapa nilai kritis
diberikan di bawah ini.

11. Jika dihitung nilai t melebihi nilai kritis, kedua batch material memberikan hasil yang sangat berbeda.

Jumlah Derajat Nilai kritis t pada

kebebasan sampel (n B 1) signifikansi 0,05
(n) tingkat

5 4 2.78

6 5 2.57
7 6 2.45

8 7 2.37
9 8 2.31

10 9 2.26

Jika pengujian ini menunjukkan adanya masalah dengan bets baru bahan, kondisi dan prosedur pengujian harus ditinjau
dengan cermat dan bets diuji ulang. Batch harus ditolak karena tidak memuaskan hanya jika masalah dikonfirmasi oleh
pengujian kedua ini.

10.5.5 Pengujian presisi

Pengujian presisi penting dilakukan di laboratorium mikrobiologi karena hasil pengujian dapat mengungkap masalah prosedural
dan masalah dengan bahan. Prinsip-prinsip pengujian presisi dibahas secara rinci dalam Bab 9. Hasil yang memuaskan harus
diperoleh dari pengujian presisi sebelum hasil pengujian pemantauan dilaporkan.

Prosedur

1. Pada awal setiap bulan, atau pada waktu yang paling tepat, kumpulkan 15 sampel yang kemungkinan besar akan positif
pada prosedur pertama, dengan serangkaian hasil yang positif.

2. Buat analisis duplikat dari setiap sampel. Analis yang sama harus melakukan pengujian, tetapi semua analis harus
disertakan, berdasarkan putaran.

3. Catat hasil tes duplikat sebagai D 1 dan D 2. Hitung logaritma setiap hasil. Jika salah satu rangkaian hasil duplikat adalah nol,
tambahkan 1 ke kedua nilai sebelum menghitung
logaritma.

4. Hitung selisihnya R antara setiap pasangan duplikat yang diubah, dan nilai rata-rata dari perbedaan ini
.

5. Hitung kriteria presisi sebagai 3.27 R.

6. Setelah itu, analisis 10 persen sampel rutin, atau minimal dua sampel per hari, dalam rangkap dua. Hitung logaritma setiap
hasil dan selisih antara logaritma. Jika perbedaan lebih besar dari kriteria presisi yang dihitung, variabilitas analis berlebihan
dan prosedur analitis harus ditinjau. Laboratorium
manajer harus memutuskan apakah akan merilis hasil pengujian pemantauan berdasarkan kinerja masa lalu dan faktor
mitigasi lainnya.

10.6 Sumber literatur dan bacaan lebih lanjut

APHA 1992 Metode Standar untuk Pemeriksaan Air dan Air Limbah. Edisi ke-18, American Public Health Association
(APHA), American Water Works Association (AWWA) dan Water Pollution Control Federation (WPCF), Washington, DC

Departemen Kesehatan dan Jaminan Sosial 1982 Pemeriksaan Bakteriologi Persediaan Air Minum. Kantor Alat Tulis Her
Majesty's (HMSO), London.

Lingkungan Kanada 1981 Manual Metode Analisis. Cabang Kualitas Air, Environment Canada, Ottawa.

ISO 1984 Deteksi C Kualitas Air dan Pencacahan Streptokokus Feses. Bagian 1: Metode dengan Pengayaan dalam Media
Cair. Standar Internasional ISO 7899-1, Organisasi Internasional untuk Standardisasi, Jenewa.

ISO 1984 Deteksi C Kualitas Air dan Pencacahan Streptokokus Feses. Bagian 2: Metode dengan Filtrasi Membran. Standar
Internasional ISO 7899-2, Organisasi Internasional untuk Standardisasi, Jenewa.

ISO 1988 Kualitas Air C Panduan Umum Penghitungan Mikroorganisme Berdasarkan Kultur.
Standar Internasional ISO 8199, Organisasi Internasional untuk Standardisasi, Jenewa.

ISO 1988 Kualitas Air C Pencacahan Mikroorganisme yang Layak. Hitung Koloni dengan Inokulasi dalam atau
pada Medium Padat. Standar Internasional ISO 6222, Organisasi Internasional untuk Standardisasi, Jenewa.

ISO 1990a Deteksi C Kualitas Air dan Pencacahan Organisme Koliform, Organisme Koliform Termotoleran, dan Presumptif
Escherichia coli. Bagian 1: Metode Filtrasi Membran. Standar Internasional ISO 9308-1, Organisasi Internasional untuk
Standardisasi, Jenewa.

ISO 1990b Deteksi C Kualitas Air dan Pencacahan Organisme Koliform, Organisme Koliform Termotoleran, dan Presumptif Escherichia
coli. Bagian 2: Metode Beberapa Tube (Angka Kemungkinan Terbanyak). Standar Internasional ISO 9308-2, Organisasi
Internasional untuk Standardisasi, Jenewa.

Mara, D. dan Cairncross, A. 1989 Panduan untuk Penggunaan Air Limbah dan Tinja yang Aman dalam Pertanian dan
Budidaya. Organisasi Kesehatan Dunia, Jenewa.

WHO 1985 Pedoman Kualitas Air Minum. Jilid 3: Kontrol Air Minum di Persediaan Komunitas Kecil. Organisasi Kesehatan
Dunia, Jenewa.

WHO 1989 Pedoman Kesehatan untuk Penggunaan Air Limbah dalam Pertanian dan Budidaya. Laporan dari Kelompok
Ilmiah WHO. Seri Laporan Teknis WHO, No. 778, Organisasi Kesehatan Dunia, Jenewa.