untuk menutup tabung Durham setidaknya
setengah hingga dua pertiga setelah sterilisasi.
Atau, abaikan tabung Durham dan tambahkan
0,01 g/L bromocresol ungu untuk lauryl tryptose
broth (LTB) (untuk menentukan asam produksi,
indikator hasil positif di bagian ini dari tes
coliform). Tutup tabung dengan tutup logam atau
plastik tahan panas.
Menyiapkan sesuai dengan tabel 9221:I,
membuat lauryl tryptose broth berkonsentrasi
cukup yang menambah 100-, 20-, atau 10-mL
porsi sampel ke media tidak akan mengurangi
bahan konsentrasi di bawah media standar.
Autoclave media pada 121°C selama 12 hingga
15 menit. Pastikan bahwa tabung Durham, jika
digunakan, bebas dari gelembung udara. pH
media harus 6.8 ± 0.2 setelah sterilisasi.
b. Prosedur:
a. Atur tabung fermentasi dalam barisan
masing-masing lima atau sepuluh tabng
dalam rak tabung reaksi. Jumlah baris
dan volume sampel dipilih tergantung
pada kualitas dan karakter air yang akan
diperiksa. Untuk air minum, 100 mL
harus diuji. Gunakan lima porsi 20 mL,
sepuluh porsi 10 mL, atau satu porsi 100
mL (satu botol tunggal). Untuk air yang
tidak dapat diminum, gunakan lima
tabung per pengenceran (dari 10, 1, 0.1
mL, dll.).
Saat membuat pengenceran dan
mengukur volume sampel yang
diencerkan, ikuti tindakan pencegahan
yang diberikan dalam bagian 9215B.2.
Gunakan gambar 9215:1 sebagai
panduan untuk menyiapkan
pengenceran. Kocok sampel dan
encerkan dengan tenaga yang cukup
selama 5 s (sekitar 25 kali). Inokulasi
setiap tabung dalam satu set lima dengan
mereplikasi volume sampel dalam
meningkatkan pengenceran desimal, jika
jumlah sampel desimal digunakan.
Campur bagian uji dalam media dengan
agitasi lembut.
b. Inkubasi dengan segera tabung yang
diinokulasi, kultur kontrol apapun,
dan/atau sterilitas kosong pada 35 ±
0.5°C. Setelah 24 ± 2 jam, goyangkan
tiap tabung atau botol dengan lembut dan
periksa adanya pertumbuhan, gas,
dan/atau reaksi asam (warna kekuningan)
dan, jika tidak ada gas atau reaksi asam
yang terbukti, inkubasi ulang dan periksa
ulang setelah 48 ± 3 jam. Catat ada atau
tidaknya pertumbuhan, gas, dan/atau
produksi asam. Jika bagian dalam tabung
tak terlihat, pertumbuhan dengan
keasaman (warna kuning) menandakan
reaksi presumptive-positive.
c. Interpretasi: deteksi reaksi asam (warna
kuning) dan/atau gas dalam tabung atau
botol dalam 48 ± 3 jam merupakan reaksi
presumptive-positive. Masukkan tabung
atau botol dengan reaksi presumptive-
positive menuju ke fase konfirmasi
(9221B.4).
Tidak adanya reaksi asam
dan/atau pembentukan gas setelah 48 ± 3
jam inkubasi merupakan tes negative.
Masukkan sampel air minum yang
menunjukkan pertumbuhan tanpa reaksi
positif gas atau asam menuju ke fase
konfirmasi (9221B.4).
4. Fase Konfirmasi
a. Media Kultur: gunakan tabung
fermentasi BGLB broth untuk fase
konfirmasi, ikuti pedoman QC yang
dikutip dalam 9221B.2
Brilliant green lactose bile broth:
Peptone ....................................................................... 10.0 g
Lactose ....................................................................... 10.0 g
Oxgall ......................................................................... 20.0 g
Brilliant green..........................................................0.0133 g
Reagent-grade water........................................................ 1 L
Tambahkan bahan kering ke air, campur
dengan saksama, dan panaskan agar terlarut.
Sebelum sterilisasi, keluarkan media ke dalam
tabung fermentasi dengan tabung Durham,
pastikan volume media cukup untuk menutupi
tabung durham setidaknya setengah hingga dua
pertiga setelah sterilisasi. Tutup tabung dengan
logam atau plastik tahan panas. Autoclave media
pada suhu 121°C selama 12 hingga 15 menit.
Pastikan tabung durham bebas dari gelembung
udara. pH media seharusnya berkisar pada 7.2 ±
0.2 setelah sterilisasi.
b. Prosedur: Inkubasi dengan segera semua
tabung atau botol presumptive (dugaan)
yang menunjukkan pertumbuhan, jumlah
gas, atau reaksi asam dalam 24 ± 2 jam
inkubasi ke fase konfirmasi. Jika tabung
atau botol presumptive tambahan
menunjukkan fermentasi aktif atau reaksi
asam pada akhir periode inkubasi 48 ± 3
jam, segera masukkan hasil ini menuju
ke fase konfirmasi. Untuk
mengkonfirmasi koloni coliform dugaan
yang tumbuh pada media padat
menggunakan media fermentasi, lihat
bagian 9222B.4g.
Kocok perlahan atau putar
tabung atau botol presumptive yang
menunjukkan gas atau pertumbuhan
asam untuk mensuspensi kembali
organisme. Dengan sterile loop
berdiameter 3.0 hingga 3.5 mm,
pindahkan satu atau lebih loop penuh
kultur ke tabung fermentasi yang
mengandung BGLB broth. Atau,
masukkan setidaknya aplikator kayu
steril 2.5 cm ke dalam kultur, segera
angkat, dan masukkan aplikator ke dasar
tabung fermentasi yang berisi BGLB
broth. Lepaskan dan buang aplikator.
Ulangi untuk tabung presumptive-
positive yang lainnya. Analis dapat
secara simultan memasukkan BGLB
broth untuk total koliform dan EC broth
untuk termotolerant (fecal) koliform
(lihat 9221e) atau EC-MUG broth untuk
Escherichia coli (lihat 9221f). Namun,
jika menggunakan loop yang sama atau
tongkat aplikator kayu untuk
memasukkan kultur ke lebih dari satu
media, inokulasi yang paling ditunda
media (BGLB broth) untuk bagian
terakhir.
Segera inkubasi tabung BGLB
broth yang diinokulasi pada suhu 35 ±
0.5°C. Setiap jumlah gas yang terbentuk
dalam tabung durham dari tabung
fermentasi BGLB broth dalam rentang
waktu 48 ± 3 jam merupakan fase
terkonfirmasi positif. Untuk
memperkirakan kepadatan koliform,
hitung nilai MPN dari jumlah positif
tabung BGLB seperti yang dijelaskan
dalam 9221C.
c. Prosedur alternatif: Gunakan prosedur
alternatif ini hanya untuk yang tercemar
air atau air limbah yang diketahui
menghasilkan hasil positif secara
konsisten.
Jika semua tabung dugaan positif
dalam dua atau lebih pengenceran
berurutan dalam waktu 24 jam, maka
hanya masukkan ke fase konfirmasi yang
tabung pengenceran tertinggi (inokulum
sampel terkecil) di yang semua tabung
positif, bersama dengan tabung positif
dalam rentetan pengenceran tertinggi.
Masukkan ke fase konfirmasi semua
tabung yang mana gas atau pertumbuhan
asam yang terproduksi dalam 24 hingga
48 jam.
5. Fase Akhir/Komplit
Tes akhir seperti yang dijelaskan disini
tidak diperlukan untuk analisis kesesuaian
sampel air minum. Untuk sampel air yang
tidak dapat diminum yang dikumpulkan
berdasarkan Undang-Undang Air Bersih,
persyaratan bahwa 10% dari semua tabung
total-koliform-positif harus menjalani
pengujian lengkap secara musiman tidak
diperlukan lagi. Pengujian yang telah selesai
disertakan disini sebagai rekomendasi QC
dan untuk digunakan saat hasil pengujian
tidak menentu. Sebagaimana pengujian
tambahan untuk koliform termotoleran
(fecal) dan/atau E.coli diperlukan untuk tes
koliform positif, pengujian lebih lanjut
menggunakan EC dan/atau EC-MUG broth