HASIL DAN PEMBAHASAN

Haka Asada

1113102000074

Badriyatun Nimah

1113102000075

Plasmid dan Cloning

pGEM-T ( plasmid DNA) diisolasi dari kultur
TOP10 dan 10l dari plasmid murni,
dianalisa (elektroforesis) pada gel agarosa
1% bersama dengan penanda (marker).
Di jalur M, penanda molekuler (marker)
yang diperoleh dari Fermentasi digunakan
untuk penentuan berat plasmid. Sementara
di Lane 2 dan 3 menunjukkan plasmid
murni dari TOP10 E. coli strain dimuat untuk
memeriksa kemurnian.
Berat molekul plasmid adalah sekitar 4,5 KB;
plasmid yang dibandingkan relatif murni.

Plasmid dan Cloning

Amplifikasi cDNA (dengan PCR) dilakukan dengan
menggunakan spesifik maju dan mundur primer
(specific forward and reverse primers)
cDNA teramplifikasi dengan ukuran 1425 bp
kemudian dimasukkan ke dalam pYES2 / CT
vektor menggunakan enzim restriksi, EcoRI dan
XhoI.
10l dari setiap 50l reaksi dielektroforesis pada
gel agarosa 1,2% kemudian diwarnai dengan
ethidium bromide.
Pada Lane 1, dimuat size marker (jenjang 1kb,
Fermentas) dan jalur yang tersisa menunjukkan
produk PCR dengan range 1425bp diperoleh
dengan menggunakan P1 / P2 primer set.

Digestion of pYES2/CT with

restriction enzymes
Untuk mendigesti DNA, meggunakan enzim restriksi,
EcoRI dan XhoI.
Biasanya, analinis proses digesti (analitycal digest)
dilakukan dalam volume total 20 ml yang
mengandung 5g DNA plasmid.
Untuk subcloning biasanya dilakukan dalam volume
50l yang mengandung DNA plasmid 25l.
5l aliquot dari campuran reaksi diambil setiap jam
sampai proses pendigestian selesai sehingga dapat
divisualisasikan setelah elektroforesis gel agarosa.
10l dari yang tidak terdigesti (undigest) dan double
digest dimuat untuk memeriksa pola digesti bersama
dengan penanda DNA(marker DNA) untuk
menentukan berat molekulnya.

Protein Purification and Analysis

Anti-trombin dimurnikan dari supernatan kultur
(ditumbuhkan dan diinduksi dalam medium NB-URA def)
dengan kromatografi afinitas menggunakan Nickel-Column.
Gambar 4 menunjukkan analisis SDS-PAGE dari fraksi load
(load), fraksi wash (wash) dan fraksi terelusi (eluted fractio)
menggunakan antibodi. Namun, seperti yang ditunjukkan
pada jalur FT dari Gambar 4, protein serupa juga terdeteksi
di fraksi yang terdapat produk dari sistem host, pita pita
ini tidak terdeteksi oleh antibodi dalam Western Blot.
Gel menunjukkan fraksi wash (wash fraction) (lane W1, W2 &
W3) juga berisi beberapa pita yang sama. Kedua fraksi
terelusi (lane E1 & E2) menunjukkan satu pita dengan
mobilitas yang sama sebagai standar yang diperoleh dari
NIBS, UK.

Western blot
Untuk menilai hubungan imunologis antara
rekombinan anti trombin murni, bahan yang
dielusi dari kolom afinitas dimasukkan ke dalam
SDS-PAGE dan di-blot-kan ke membran
nitroselulosa.
Pita protein 58kDa sangat bereaksi dengan
antibodi ini, menunjukkan bahwa protein
murni tersebut adalah anti-trombin.
Representatif Western blot menunjukkan
reaktivitas dari anti-trombin murni (dari dua
ekstrak yang berbeda) dengan Anti-Anti Thrombin
antibody (Abcam, ab126598) di 1/1000
pengenceran dan Anti-kelinci antibodi-HRP
Kambing (Abcam, ab6721) pada 1 / 5000
pengenceran ditunjukkan pada Gambar 5.