KROMATOGRAFI

(FAD 2621)

Pustaka :
Sherman, J., Bernard, F., 1996, Hand book of Thin-Layer
Chromatography, Second ed., Marcel Dekker INC, New York.
Grob, R.L., 1977, Modern Practice of Gas Chromatography, John Wiley
& Sons INC, New York.
Gritter, R.J., Bobbitt, J.M., Schwarting, A. E., 1985, Introduction to
Chromatography, Holden-Day INC, Oakland, USA.
Clarke, E.G.C., 1971, Isolation and Identification Of Drugs, in
pharmaceuticals, body fluid and post-mortem material, The
Pharmaceutical Press, London.
Kromatografi diturunkan dari bahasa Greek
Chromato = Warna
Grafe = Tulisan

Sejarah :
Runge, F.F. (1834-1843) melakukan spot test campuran zat
warna dari ekstrak tumbuh-tumbuhan pada pita kain dan atau
kertas.

Goppel Sroeder, F (1868) menganalisis zat warna, hidrokarbon,

alkohol-alkohol, beer, milk pada minuman dan air minum
menggunakan kertas.
Schobeinc menggunakan pita kertas untuk memeriksa cairan.
Day D.T. (1897-1903) menggunakan kolom yang diisi serbuk tanah
untuk pemisahan.

Mikhail Tswett (1906-1907) telah berhasil memisahkan pigment

kloroplast dengan fase diam CaCO3 dan petroleum eter sebagai fase
gerak.

Wilson, J.N. (1940) mempelajari tentang teori pada kromatografi kertas.

Martin, A.J.P. dan Synge, R.L.M.(1941) mengajukan pertama kali model

yang menjelaskan efesiensi kolom dan mengembangkan kromatografi
cair dan berhasil mendapatkan hadiah Nobel tahun 1952.

Van Deemter, J.J dkk yang mengembangkan teori kecepatan dengan

menyederhanakan hasil kerja Lapidus dan Ammundson pada fungsi
distribusi Gauss.

Dengan perkembangannya Nama kromatografi tidak sesuai lagi

Dasar Pemisahan :
Perbedaan kecepatan migrasi komponen (senyawa-senyawa)
yang dibawa oleh gerak dan ditahan secara selektif oleh fase
diam.

Tujuan Kromatografi :
Pemisahan senyawa-senyawa dengan waktu yang tidak
terlalu lama.
Penggolongan kromatografi
Atas dasar mekanisme pemisahan :
1.      kromatografi serapan (adsorption chromatography)
2.      kromatografi partisi (partition chromatography)
3.      kromatografi eksklusi (exclusion chromatography)
4.   kromatografi penukar ion (ion exchange chromatography)
5.      kromatografi afinitas (affinity chromatography)

Atas dasar (wujud) fase gerak:

1.      kromatografi gas (fase geraknya adalah gas)
2.      kromatografi cairan (fase geraknya adalah zat cair)
Atas dasar bentuk fase diam:
1.Kromatografi planar
a. kromatografi lapis tipis
b. kromatografi kertas
c. kromatotron
2.Kromatografi kolom
a. kolom terbuka
b. kromatografi gas,
c. kromatografi cair kinerja tinggi
 Atas dasar cara mengalirkan fase gerak
1.      vacuum column chromatography
2.      flash column chromatography
3.      gravity column chromatography
4.      high pressure liquid chromatography

Penamaan pada umumnya didasarkan keadaan fase gerak dan fase

diamnya, misalnya :
GLC = gas liquid chromatography (KGC)
GSC = gas solid chromatography (KGP)
LLC = liquid liquid chromatography (KCC)
LSC = liquid solid chromatography (KCP)
Mekanisme Pemisahan
Pengertian :
1. Unsur elektronegatif
2. Ikatan kovalen
3. Momen dipol  Ikatan Hidrogen
4. Polar & non polar
5. Ekstraksi pelarut
6. Koeffisien Distribusi = Koeffisien partisi
Kd = D
7. Counter Current Craig Extraction
(pemisahan secara partisi)
Molekul polar dan non-polar ?

Unsur elektronegatif ?

Ikatan kovalen ?

H H H H
H H
c c c
O H H
c c c H

H
H H H
H H H
 Pelarut organik yang sering digunakan sebagai fase gerak
(deret eluotropik)
non polar Parafin cair
Petroleum eter
Sikloheksana
Karbon tetraklorida
Benzena
Toluena
Kloroform
Dietileter
Etilasetat
Aseton
n-propanol
etanol
asetonitril
methanol
polar air

 
Fase diam

Silika
Silika gel tanpa pengikat (silika gel H dan N)
Silika gel dengan pengikat (silika gel G)
Silica gel dengan pengikat dan zat berfluoresensi (GF)
Slika gel untuk kolom kromatografi (preparatif)

OH OH OH OH
O O O O
Si Si Si Si O
O O O O

Alumina OH OH OH
O O O O
Al Al Al
selulosa
Mekanisme pemisahan secara adsorbsi

Kompetisi terjadinya ikatan hidrogen

H
H C O
H
H H
H C O O
H H H H
O
OH OH OH OH
O O O O O O O
Si Si Si Si Si Si
O O O O
Mekanisme secara partisi

[ HB ] fase atas
Kd = ----------
[ HB ] fase bawah

Misalkan :

Kd = 1
 500

500

250 250

250
250

125 250
125

250 125
125

62.5 187.5 187.5 62.5

62.5 187.5 187.5

62.5

31.25 125 187.5 125 31.25

31.25 125 187.5 125

31.25

Fraksi Total 0,0625 0,250 0,375 0,250 0,0625

Kurva
1. Penggojogan ke sekian kali
2. Terpisahnya senyawa-senyawa yang
mempunyai Kd berbeda
Mekanisme Pemisahan Secara Exklusi (Exclusion Chromatography)

Prinsip : Pemisahan komponen oleh gel didasarkan ukuran besar atau kecil
molekul-molekul komponen.

Molekul-molekul (larut), komponen kecil masuk ke dalam jaringan polimer

(gel), sehingga gerakan dihambat. Sedangkan molekul besar tak dapat memasuki
jaringan polimer dan akan keluar kolom lebih cepat dibawa fase gerak.

Fase diam (dalam kolom)

- Gel non ionik, berpori banyak dan sama rata ukuran bentuk.
- misalnya : Sephadex
- Dibedakan dua gel : 1. Gel Filtrasi adalah polimer sukrosa atau
dextran yang membengkak dalam air.
2. Gel Permeasi adalah polimer membengkak di
dalam pelarut organik.
Mekanisme Pemisahan Secara Penukar Ion (Ion Exchange)
- Setelah dikembangkan resina polistiren (1940)
- Pemisahan unsur tanah jarang
- Senyawa-senyawa pada Biokimia.

Dasar Pemisahan :
Perbedaan kekuatan interaksi ion terlarut dengan resina

Senyawa terlarut (linarut) yang berinteraksi lemah akan

keluar lebih cepat, dan sebaliknya senyawa yang berinteraksi
kuat akan ditahan kolom lebih lama, maka akan keluar
kemudian.
 X- + R+ Y - Y- + R+ X -

X+ + R - Y+ Y+ + R - X+

ion fase gerak

Bag. ion resin
Senyawa sampel

Fase Diam : resin buatan organik atau anorganik

Contoh : Polistirena kation
Polistirena anion
Polidextran  pemisahan protein

Fase Gerak :
Contoh : air + anion
air + Kation (KH2PO4 NaH2PO4 ) pH 4
Pemisahan Secara Afinitas (Affinity Chromatography)

Prinsip : Interaksi yang sangat spesifik antara solute dengan

molekul yang terikat secara kovalen (immobilized) pada
fase diam.

Contoh : Molekul antibody terikat secara kovalen dengan fase diam. Jika
campuran berisi 1000 protein dilewatkan kolom, hanya satu protein
bereaksi dengan antibody yang terikat pada kolom.
Setelah pencucian semua solute (1000-1) protein keluar dari kolom.
Protein yang diinginkan dilepaskan dari antibody dengan perubahan:
pH fase gerak atau kekuatan mengionkan fase gerak.
Contoh : Mol coplanar mempunyai ggs Cis-diol dapat dipisahkan dari
campuran komplek (nukleotida) dengan cara melewatkan pada kolom
dengan asam fenil boronat terikat

AFFI GEL 601 yang dijual dipasaran adalah bentuk dari Biogel P-6 yang
mengikat asam fenil boronat yang dapat mengikat coplanar Cis-diol.
O
Bio Gel P-6-C-N-C-C-N-C-C-C-C-N-
H

HO OH Nukleotida yg tak ada ggs cis diol

akan keluar.
Sedangkan Nukleotida dg ggs cis
diol
Akan ditahan. Setelah dielusi buffer
sitrat Nukleotida cis diol akan keluar.
 KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS (KLT)
Thin Layer Chromatography (TLC)

Banyak digunakan karena :

-sederhana, mudah difahami secara teknik
-waktu analisis relatif pendek, dpt diulangi setiap saat
-ekonomis
Mekanisme pemisahan : - adsorpsi
- partisi
Fase diam (Stationary phase = sorbent = adsorbent = penjerap)
: Silika gel
: Alumina
: Selulosa
Silika gel :
- silika gel G  sbg pengikat digunakan gypsum
- silika gel S  sbg pengikat digunakan pati
- silika gel GF 254  ditambah gypsum dan senyawa
berpendar pada UV  254 nm
- silika gel H, Silika gel N [ tanpa pengikat ]
- silika gel tanpa pengikat ttp dengan seny.berpendar
- silika gel untuk keperluan preparatif

Alumina :
- alumina asam (pH 4), netral (pH 7), basa (pH 9).
- Pemberian kode seperti silika gel G.H.P.F.

Selulosa :
- serat 2-20 , serat asli (MN 300), mikrokristal (Avicel) utk
senyawa polar. Dengan atau tanpa senyawa fluorescence.
Pengertian Luminescence (berpendar)
Dibedakan : Fluorescence ( 10-8 detik)  seny organik
Phosphorescence ( > 10-8 detik ) seny anorganik
Indikator fluorescens organik  code F366, UV366
Contoh: - fluorescein dan garamnya
- rhodamin B dan rhodamin 6G
- morin, dll.

Indikator fosforesens anorganik

kode F254, UV254Zn cadmium sulfida
biru-seny timah strontium, kuning- uranil asetat, hijau kuning –
manggan zn silikat
kode F254s alkali tanah wolframat
Fase gerak
-Interaksi polaritas (ik hidrogen dan konsep like dissolves like)
-Deret eluotropik
-Perkiraan polaritas campuran pelarut:
p’cam = a.p’a + b.p’b + c.p’c + ……
= fraksi volum
p’= angka kepolaran (Rohrschneider dan Snyder)
Pelarut dengan harga P’ (Introduction to modern liq.chrom.)

Pelarut P’

Heksana 0,1
1-klorobutana 1,0
Isopropil eter 2,4
Metilen klorida 3,1
Tetrahidrofuran 4,0
Kloroform 4,1
Etanol 4,3
Etil asetat 4,4
aseton 5,1
Metanol 5,1
Asetonitril 5,8
Etilena glikol 6,9
DMSO 7,2
Air 10,2
Pembuatan Pelat (lempeng) silika gel
`
+ 30 gram silika gel + air (sejumlah tertentu) diaduk homogen,
tak lebih 4 menit dimasukkan alat perata Stahl-Desaga atur
ketebalan (0,25-2,0 mm). Diratakan diatas 6 lembaran kaca
(20x20 cm). Keringkan di udara, kmd dimasukkan oven 100-
120oC selama 60 menit. Sejukkan dan simpan dlm eksikator.

Untuk keperluan preparatif dibuat sendiri

Untuk keperluan analitik & preparatif  ada dipasaran
diatas lembaran kaca, plastik ataupun aluminium.
bermacam ukuran 20 x 20 cm, 10 x 20 cm dll.
 Perbandingan fase diam dan cairan pembuatan pelat
Perbandingan
Fase diam Jenis cairan Fase diam:cairan
( g : ml )
1. Silika gel G/GF Air 30 : 60-65
2. Silika gel H Air 30 : 80-90
3. Alumina G Air 30 : 40
4. Alumina H Air 30 : 80-90
5. Kiselgur Air 30 : 60-65
6. Serbuk selulosa MN 300 Air 1:5
7. Serbuk poliamid Kloroform : 1: 9
metanol=2:3
Penyiapan dan Penotolan Sampel
- Pelarut sampel yang sesuai
- 1-20 l yang mengandung 50-100g  3-6mm
- Alat penotol : kapiler gelas, microsyringe
- overloaded  Rf berubah dan bercak tidak simetri

Pengembangan (elusi)
- Bejana diisi fase gerak hingga kedalaman 0,5 cm  jenuh
- Totolan (sdh kering) pada plate, dimasukkan bejana
- Totolan jangan tercelup fase gerak
- Batas yang dicapai gerak ditandai dg pensil lemah
- Didokumentasi profil kromatogramnya (Rf).
Macam Cara Pengembangan :
Pengembangan berulang
Pengembangan dua dimensi  Pemisahan senyawa flavone ‘Harbone’
Pengembangan sirkular  kromatotron

Pengamatan / mendeteksi / visualisasi bercak.

Secara langsung
Dengan perlakuan :
destruksi  Pereaksi semprot, uap I2  75% tidak rusak
non-destruksi  UV lamp
 Macam pereaksi warna (semprot) dan penggunaannya

Pereaksi Jenis Senyawa Warna

1. Anilina ftalat Gula mereduksi Berbagai warna

2. Anisaldehida dalam H2SO4, etanol, Karbohidrat Biru
dan bbro tetes asam asetat
3. Stibium klorida dlm CHCl3 Steroid, lipid alifatik Berbagai warna
4. 2,4-dinitrofenilhidrazin dlm HCl Aldehida, keton Kuning  merah
5. Dragendorff Alkaloida, Jingga
basa organik
6. Besi (III) klorida Fenol Berbagai warna
7. Ninhidrin Asam amino Biru
8. DAB Sulfa Kuning-oranye

* Introduction of chromatography “ Roy J. Gritteeer et al

Untuk keperluan mencari sistim KLT selain mencoba-coba, ada
bbrp literatur yg dpt membantu. Mis. buku :
E.G.C.Clarke, Judith Berle, MSc. (1974) :Isolation and
Identification of drugs, The Pharmaceutical Press, London.
: - ada 22 sistem KLT  kode T1 sd T22.
- Tiap sistem  camp fase gerak tertentu untuk mengelusi gol obat tertentu
fase diam : silika gel dengan ukuran 20 x 20 cm.
Diberikan nilai Rfnya.
: -Untuk sistem Kromatografi kertas  kode P1 dan seterusnya

No Sistem Golongan Senyawa Obat

1. T1 Basa Nitrogen (alkaloid)
2. T2 Antihistamin & klordiazepoksida
3. T3 Anti histamin
4 T4 dst
10 T10 Barbiturat Fase gerak :
aseton 1bg
CHCl3 9 bg
Pengembangan : 10-17 cm
Visualisasi :
KMnO4  warna kuning, coklat, purple.
Pereaksi Zwikkers  warna Pink atau hijau
11 T11 Barbiturat -
12 T12 Barbiturat -Fase gerak : lart. Ammoniak pekat 5, Benzen 75,
dan dioksan.
22 T22 Golongan Sampel dilartkan dlm aseton.
sulfa Fase gerak : CHCl3 1, Etanol 1, Heptana 1 dan air
1,5%
Kesetimbangan : 3 jam
Visualisasi : diazotasi dengan N-1
naftiletilendiamin (spray).
KLT digunakan untuk analisis :
1. Kualitatif
2. Kuantitatif
Analisis Kualitatif
-Adanya senyawa pembanding

jarak yg ditempuh senyawa sampel

Rf :
Jarak yg ditempuh fase gerak

jarak yg ditempuh senyawa sampel

Rr :
jarak yg ditempuh senyawa pembanding

HRf : 100 x Rf