KROMATOGRAFI KOLOM

DWIARSO RUBIYANTO
 KROMATOGRAFI KOLOM

• Kromatografi kolom merupakan teknik yang sangat

berharga dalam pemurnian senyawa sintetik maupun
bahan alam.

• Senyawa yang dipisahkan dengan KK memiliki

mekanisme yang sama dengan jenis kromatografi lain
yaitu :
berkaitan dengan perbedaan antara gaya-gaya antar
molekul dalam sampel dengan fasa gerak dan antara
komponen dengan fasa diam
 FASA SAMPEL FASA DIAM
GERAK

KROMATOGRAFI
CAIR

SOLVENT
SOLUBILITAS POLARITAS
STRENTH
 PRINSIP DASAR KROMATOGRAFI KOLOM

 JENIS INTERAKSI : • JENIS INTERAKSI :

PARTISI ADSORBSI
 FASA DIAM :
• FASA DIAM :
CAIRAN YANG DIDUKUNG OLEH
PADATAN PADATAN
 FASA GERAK : • FASA GERAK :
CAIRAN / SOLVENT CAIRAN / SOLVENT
EMPAT TIPE DASAR KROMATOGRAFI KOLOM
DENGAN FASA GERAK CAIR

• Partition Chromatography
Bonded-Phase
Liquid-Liquid

• Adsorption Chromatography
Liquid-Solid

• Ion-Exchange Chromatography

• Exclusion (or Gel) Chromatography

 SKEMA LC

Source: Skoog, Holler, and Nieman, Principles of Instrumental Analysis, 5th edition, Saunders College Publishing.
KROMATOGRAFI KOLOM
ADSORBSI
• JENIS INTERAKSI :
ADSORBSI
• FASA DIAM :
PADATAN
• FASA GERAK :
CAIRAN / SOLVENT
 Absorbsi versus Adsorbsi:

 Dalam absorbsi, bahan yang diabsorbsi masuk ke

dalam bahan lain secara menyeluruh.

 Sementara adsorbsi adalah fenomena penyerapan

yang terjadi hanya pada permukaan zat.
 Fasa diam untuk kromatografi adsorbsi disebut
"Adsorbent"

 Kromatografi adsorbsi merupakan bentuk

kromatografi tertua. (Tswett's work)
No. Jenis padatan Kegunaan dalam pemisahan

Alumina dan magnesia Sterol, zat warna, vitamin, ester, alkaloid,

senyawa anorganik

Silica gel Sterol, asam amino

Karbon aktif Peptide, karbohidrat, asam amino

Magnesium silikat Sterol, ester, gliserida. alkaloid

Magnesium karbonat Porphirin

Kalsium hidroksida Karotenoid

Kalsium karbonat Karotenoid, xanthofil

Kalsium phosphat Enzim, protein, polinukleotida

Aluminium silikat Sterol

Pati Enzim

Gula Klorofil, xanthofil

Syarat ideal adsorben: ( Stationary phase)

 Tidak larut dalam fasa gerak.

 Inert terhadap solut (adsorptif saja).
 Tidak berwarna, terutama bila pemisahan zat
berwarna.
 Ukuran partikel yang sesuai untuk mendapatkan
pemisahan yang baik dan laju alir yang tepat.
Contoh adsorben:
1- Silica gel - Silica - Silica acid:
 Paling banyak dpaki untuk K kolom dan KLT.
 Silica gel dibuat melalui asidifikasi natrium silicate dengan
asam sulfat dan dicuci dengan air dan dikeringkan.
 Situs aktif dalam silika gel disebut gugus silanol, yaitu gugus
hidroksil yang terikat pada silikon.
 Silica gel mencapai kekuatan maksimum setelah
dipanaskan pada 150 -250 0C agar bebas air.
 Jika silica gel mengandung air, maka ia bertindak secara
partisi dan bukan adsorbsi.
 Penurunan ukuran partikel dapat meningkatkan luas
permukaan dan konsekuensinya akan meningkatkan
kekuatan adsorbsi.
 Gugus silanol inilah yang membentuk
ikatan hidrogen dengan solut.
OH
OH
OH
OH
OH Si
Si O
Si O
Si O O
Si O O
O O
O O
O Si Si
O O
Si
Si O O O
Si O O
O
O O
O
Si
Si O
O
O O
O
2- Alumina:
 Merupakan suatu aluminum oxide (Al2O3).
 Alumina diaktivasi dengan pemanasan pada 400 0C selama 24
jam.

 Keuntungan menggunakan alumina :

1- kapasitas besar
2- tak mudah larut
3- cukup inert
4- banyak tersedia
5- mekanisme adsorbsi yang berbeda dengan silica gel karena oleh
adanya muatan positif yang kuat pada Al+++ dan pengaruh situs
basa yang dapat mempolarisasi senyawa secara mudah.
Sangat cocok untuk pemisahan senyawa-senyawa aromatik dalam
minyak/olefin.
Kerugian :

 Tidak cocok untuk senyawa yang bersifat basa

labil.
 Menyebabkan penataan ulang ikatan dan
perpanjangang cincin pada senyawa tak jenuh.
 Bereaksi secara kimia dengan senyawa asam.
 Types of commercial alumina :
1- Neutral alumna pH 7– 7.5.

2- Acidic alumina pH 4. It is prepared by

washing aluminum oxide with 2N HCl then with
distilled water.

3 – Basic alumina pH 10. This type is prepared

by washing with NaOH then distilled water.
 Alumina

Situs aktif

O OH OH OH OH

Al Al Al Al Al
O O O O O O
Acidic: -Al-OH
Neutral: -Al-OH + -Al-O-
Basic: -Al-O-
3- Charcoal:
 There are two types of charcoal based on
temperature of activation:
1-Non–polar of Charcoal prepared by
activation at 1000 0C and act by adsorption
through hydrogen bonds and electrostatic
forces.
2- Polar charcoal prepared at lower
temp and contains water so act by partition.

4- Kieselguhr (Diatomaceous earth):

 It have relatively low adsorption power.
 Di dalam kromatografi kolom adsorbsi
terdapat dua tipe gaya :

 Gaya yang menarik solut ke fasa diam.

 Gaya yang melepaskan solut dari fasa diam dan

bergerak bersama fasa gerak.

FASA SAMPEL FASA DIAM

GERAK
 Gaya tarik
Diklasifikasikan menurut kekuatannya, antara lain:
 Dipole–dipole attraction: gaya yang terjadi antara adsorben
polar dengan solut polar.

 Hydrogen bonding: Interaksi antara hidrogen dalam gugus -

OH dengan suatu atom elektronegatif seperti oksigen,
nitrogen dalam solut.
 Polarizability forces: Gaya yang terjadi antara adsorben
polar dan solut yang dapat mempolarisasi elektron
seperti pada senyawa aromatik.

 Weak covalent bonds: Gaya yang terjadi pada

pembentukan senyawa kompleks.

 Van der Waals forces: Gaya tarik antara inti atom

dengan elektron dalam molekul non polar yang
berlainan.
Gaya lepas solut:

 Elution:
 It is the tendency of solutes to dissolve and move with
the mobile phase.
 The solvent used as mobile phase must be just good
enough to dissolve the solutes to allow competition
with the adsorption power of the stationary phase.
 If very strong solvents are used they will wash out all
solutes together without separation.
 Ether/ hydrocarbons / carbonyl solvents are of common
use.
 Displacement:
 In this case solvent molecules compete
with the solutes for the adsorption sites
of the stationary phase.
 This competition makes solutes move in
different speeds.
 Elutropic Series of solvents:

Solvent are arranged in this series

according to their strength in ascending
(increasing) order.
 Arrangement of polar groups Elutropic series of solvents
according to their binding to adsorbent (increasing strength)
-COOH carboxylic Light petroleum & Hexanes
-OH hydroxyl Cyclohexane
-NH2 amines Carbon tetrachloride
-CHO aldehydes Trichloro ethylene
-C=O ketones Toluene
-COOR esters Benzene
-OCH3 ethers Dichloromethane
-C=C- olifens Chloroform
Ethyl ether
Ethyl acetate
Acetone
n-Propanol
Ethanol
Methanol
Water
KROMATOGRAFI KOLOM
PARTISI
 JENIS INTERAKSI :
PARTISI
 FASA DIAM :
CAIRAN YANG DIDUKUNG OLEH
PADATAN
 FASA GERAK :
CAIRAN / SOLVENT
 KROMATOGRAFI KOLOM PARTISI
Pemisahan Padatan pendukung Fasa Fasa gerak
diam

Alkohol C1 – C4 Cellite Air Kloroform, karbon

tetra klorida

Asam lemak C2 – C8 Silica gel Air Kloroform : n-

butanol

Asam amino Pati Air n-propanol , n-

butanol : asam
klorida

Fenol-fenol Selulosa Air Metanol : n-butanol

: kloroform
JENIS-JENIS FASA GERAK
 a. Deret Trappe
 Deret ini menggambarkan kekuatan elusi pelarut-
pelarut dengan kolom yang menggunakan padatan
penyerap silika gel :

Air murni < metanol < etanol < propanol < aseton <
etil asetat < dietil eter < kloroform < metilen klorida <
benzena < toluena < trikloro etilen < karbon
tetraklorida < sikloheksana < heksana
 b. Deret Williams
 Deret ini menggambarkan kekuatan elusi yang
berbeda dari deret sebelumnya untuk pelarut yang
digunakan pada teknik kromatografi kolom dengan
padatan karbon aktif untuk pemisahan asam-asam
amino dan sakarida-sakarida :

Etil asetat < dietil eter < propanol < aseton < etanol <
metanol < air murni
Schematic representation of a chromatographic separation
Column Chromatography Principles

IN COMMON : The stationary

phase (column packing) in
the column is very polar!
Principles of Separation on a column
Normal phase Column Chromatography

The column packing in the column is very polar!

Polar compounds are going to be attracted to the polar

column packing by hydrogen bonding or dipole-dipole
attractions. Polar compounds are going to move slowly!

Non-polar compounds are going to come off the column first,

while the polar compounds are going to come off column last.

Usually, one starts will a less polar solvent to remove

the less polar compounds, and then you slowly
increase the polarity of the solvent to remove the more
polar compounds.
REMEMBER…
 The stationary phase is POLAR
 The more polar component interacts
more strongly with the stationary phase
 The more polar component moves more
slowly.
 The non-polar component moves more
rapidly.
How does reverse phase chromatography
compare to normal phase chromatography?
Reverse phase chromatography
Silica is alkylated with long chain hydrocarbon groups, using 18 carbons long. This is
usually referred to as C-18 silica.

CH3

CH2
CH3 17 CH3
Si
CH2 SiCH3)3 CH3
17 CH3
SiCH3)3
SiCH3)3
O
Si O
CH3 O
O
O Si
Si O
Si O
Si O O
Si O O
O O
O O
O Si
Si O
Si O
Si O O
Si O O
O O
O O
O
Si
Si O
O
O O
O
Reverse Phase column chromatography

 The stationary phase (column packing) is

now NON-POLAR
 Non-polar compounds will move more
slowly because they are attracted to the
column packing.
 The more polar component moves more
quickly down the column.
 Polar solvents, such as water and
methanol are used in reverse phase
chromatography
 Used mainly in columns, such as HPLC
EXPERIMENT EXAMPLES
 1. Ion-exchange Chromatography

 First developed in the 1970’s

◦ Allows for separation and determination of anions and
cations based upon ion-exchange resins

Ion-exchange resin
 This experiment will illustrate the use of an
ion exchange resin for the separation of
Zn2+ and Mn2+
◦ Dowex 50 is a sulfonated polystyrene (divinylbenzene)
cation exchanger
 Ion-exchange Overview

Task 1
 We will determine the total metal ion concentration of a liquid
sample containing Zn2+ and Mn2+ by titration of exchanged
hydrogen ions using an automatic titrator

Task 2
 We will separate the individual metal ions and determine their
concentration compleximetrically using the disodium salt of
ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) and a metallochromic
indicator
 Task 1: Total Metal Ion Concentration

 Fill the column with Dowex 50

 Wash with ultra-pure water (2 x 50 mL washes)
 Add 1 mL of the unknown to the column
 Elute sample
 Perform a titration using an automatic titrator
 Task 2: Separation and Individual
Determination of Mn and Zn

 Fill the column with Dowex 50

 Wash with ultra-pure water (2 x 50 mL washes)
 Add 1 mL of the unknown to the column
 Elute manganese
 Elute Zinc
 Using the automatic titrator, perform a titration
with EDTA using Eriochrome Black T as indicator
2. TLC - Optimizing for column chromatography

Optimum: 0.2 < Rf < 0.5

 COLUMN CHROMATOGRAPHY

Skoog and Leary: Principals of Instrumental Analysis, 4th ed. Suanders, 1992
Concentration profiles of solute bands
A and B at two different times in their
migration down the column.
Two-component chromatogram illustrating two methods of improving separation:
(a) Original chromatogram with overlapping peaks
(b) Improvement brought about by an increase in band separation
(c) Improvemnet brought about by a decrease in the widths.
 COLUMN CHROMATOGRAPHY

Polar components (b) adsorb more strongly to the polar silica and elute after
the less polar components (a), which move more quickly with the non-polar
(relative to silica) solvent.
3. FLASH COLUMN CHROMATOGRAPHY
 3. FLASH COLUMN CHROMATOGRAPHY

• Build column
• Apply sample
• Elute
• Collect Fractions
• Analyze by TLC
• Combine pure fractions
FLASH COLUMN CHROMATOGRAPHY
FCC - OPTIMIZATION

Measure of column efficiency

FCC – Sample vs Column Size
TLC vs High Performance Liquid Chromatography (HPLC)
TLC vs High Performance Liquid Chromatography (HPLC)

http://www.labhut.com/education/flash/introduction07.php