1

Bila anda akan mempelajari nilai Km dan Vmaks untuk enzim -glukosidase dengan substrat laktosa, jelaskan sampai diperoleh Km dan Vmaks. ? Enzim -galaktosidase (EC 3.2.1.23) termasuk enzim hidrolase yang dapat menghidrolisis ikatan -D-galaktosida pada ujung nonreduksi residu -D galaktosa. Enzim -galaktosidase bersifat intraseluler pada bakteri dan yeast sedangkan pada fungi bersifat ekstraseluler. Enzim ini pun bersifat induktif karena akan diproduksi jika terdapat induser berupa laktosa (Mahoney 2004). Penggunaan enzim -galaktosidase dalam proses hidrolisis ini mempunyai kekurangan dimana hidrolisis laktosa secara keseluruhan tidak mungkin terjadi karena enzim dihambat oleh terbentuknya galaktosa didalam reaksi hidrolisis (Boyer 2002).

Gambar 1: Reaksi hidrolisis laktosa oleh -galaktosidase (Chaplin, 2004). KM dan Vmaks merupakan 2 parameter yang paling penting untuk menguji tingkat efektivitas enzim. Penentuan kinetika reaksi penting dilakukan untuk mengetahui kecepatan reaksi enzim dalam menguraikan substrat. Kinetika reaksi ditentukan dengan dua parameter utama yaitu nilai Km dan kecepatan maksimum (Vmaks). Km merupakan salah satu ciri tetap suatu enzim untuk keadaan reaksi pada suhu dan pH tertentu, sedangkan Vmaks bersifat tidak tetap dan dapat ditingkatkan dengan meningkatkan konsentrasi enzim dan mengubah faktor lingkungan (Suhartono 1992). Untuk mengetahui Km dan Vmaks dari enzim -galaktosidase yang memiliki substrat laktosa dapat dilakukan dengan menguji stabilitas dan aktivitasnya. Pengujian stabilitas enzim -galaktosidase dapat dilakukan dengan memberikan substrat laktosa kepada enzim -galaktosidase kemudian mengujinya dengan suhu yang berbeda-beda, pengaruh suhu padareaksi katalais adalah meningkatkan laju-reaksi, namun yang perlu diingat adalah enzim merupakan protein ketika suhu semakin meningkat enzim akan terdenaturasi dan rusak. Melalui perlakuan suhu yang berbeda-beda dapat diketahui suhu optimal enzim galaktosidase bekerja. Sedangkan, pengujian aktivitas dapat dilakukan dengan jalan menginkubasi enzim dalam waterbath selama beberapa menit kemudian direaksikan pada suhu yang sama dengan variasi substrat, karena pada saat Vmaks seluruh enzim akan terikat dengan substrat dan enzim tersebut sudah jenuh terhadap substrat (Lehninger et al. 2004). Korelasi antara aktivitas enzim dan stabilitas enzim kemudian dapat dilihat menggunakan persamaan Michaelis-Menten dan Lineweaver-Burk untuk mengetahui nilai Km dan
Vmaks.

Apa bedanya inhibitor kompetitif dan non-kompetitif dalam menghambat aktivitas enzim, berikan penjelasan ? Inhibitor adalah senyawa yang dapat menurunkan aktifitas enzim, baik dengan mencegah pembentukan maupun pemecahan kompleks enzim substrat (Wirakartakusumah et al. 1986). a. Kompetitif , secara reversible terikat pada sisi aktif enzim. karena memiliki struktur yang mirip dengan substrat. Konsentrasi substrat yang tinggi dapat mengalahkan pengaruh inhibitor kompetitif, karena konsentrasi yang cukup tinggi akan lebih dapat berkompetisi dengan molekul inhibitor. daya ikat enzim-substrat menurun, Km bertambah, Vmaks tetap b. Nonkompetitif. secara reversibel terikat di tempat lain , bukan pada sisi aktif sehingga mengubah bentuk sisi aktif. Penambahan konsentrasi substrat tidak berpengaruh ,daya ikat enzim-substrat tetap, Km tetap, Vmaks menurun. Bagaimana dampaknya kedua jenis inhibitor terhadap nilai Km dan Vmaks, jelaskan mengapa demikian ? a. Kompetitif : 1. Inhibitor berkompetisi dengan substrat memperebutkan tempat aktif pada enzim yang bebas 2. Selanjutnya inhibitor tersebut membentuk kompleks enzim-inhibitor [EI], sehingga tidak dapat terbentuk kompleks [ES] dan tidak menghasilkan produk yg diharapkan. 3. Pada keadaan kompetitif terdapat 2 kemungkinan kompleks yang terjadi, yaitu [ES] dan [EI]. Disatu pihak aktif dan dilain pihak tidak aktif. 4. Laju reaksi bergantung pada [ES] dan pembentukan [EI] akan mengurangi laju reaksi. 5. konsentrasi ES, EI bergantung pada beberapa faktor: a) Konsentrasi substrat, b) Konsentrasi inhibitor, c) Afinitas enzim terhadap S dan I Pada inhibitor kompetitif dapat disimpulkan sbb: a) Tingkat hambatan menurun dengan meningkatnya [S] pada [I] tetap. b) Km yang didapatkan (Km apparent) lebih besar dari pada Km yang sebenarnya. c) Tidak mempengaruhi nilai V maks. d) Tidak menghalangi penguraian kompleks enzim substrat.

Gambar 2: Perbandingan kinetika reaksi antara ada dan tidaknya inhibitor kompetitif.

b. Nonkompetitif : Inhibitor kompetitif adalah hambatan di mana inhibitor bereaksi dengan suatu tempat diluar tempat aktif, sehingga kombinasi substrat dengan enzim tidak dihalangi tetapi pemecahan kompleks ES dicegah. Tingkatan inhibisi tidak akan bergantung pada [S] atau Ks (konstanta disosiasi substrat) tetapi pada [I] dan Ki (konstanta disosiasi inhibitor) Pada hambatan non-kompetitif, inhibitor dapat berikatan baik pada enzim bebas maupun kompleks ES

ES + I

ES

Gambar 3: Perbandingan kinetika reaksi antara ada dan tidaknya inhibitor non - kompetitif.

DAFTAR RUJUKAN Chaplin M. 2004. The use of lactases in dairy industry. [terhubung berkala]. http://www.lsbu.ac.uk/biology/enztech/lactase.html. Hames, David dan Nigel Hooper. 2005. Plant Biochemistry 3rd edition. New York. Taylor and Francis Group. Lehninger AL, DL Nelson, MM Cox. 2004. The Principles of Biochemistry. 4th Ed. New York: Worth Publisher. Suhartono MT. 1992. Protease. Bogor: PAU Bioteknologi IPB. Wirahadikusumah M. 1986. Biokimia; Protein, Enzim dan Asam Nukleat. Bogor: Penerbit ITB.