Bahan Kuliah 5 Bahan Kuliah 5

PEMISAHAN MENGGUNAKAN
METODE SENTRIFUSI METODE SENTRIFUSI
Prof. Drs. Manihar Situmorang, M.Sc., Ph.D
Jurusan Kimia FMIPA Jurusan Kimia FMIPA
UNIVERSITAS NEGERI MEDAN
1
2014
Sentrifusi Sentrifusi
Termasuk metode pemisahan dengan cara Termasuk metode pemisahan dengan cara
fisika
Banyak digunakan dalam pemisahan sel,
organel dam molekul (Biologi/Biokimia)
Dalam analisis diperlukan untuk pemisahan
partikel berdasarkan ukuran partikel p p
Misal:
Sedimentasi koloid
Fraksinasi gradien
2
Fraksinasi gradien
Gaya Sentrifugal Relatif Gaya Sentrifugal Relatif
Pemisahan secara mekanik berdasarkan Pemisahan secara mekanik berdasarkan
perpindahan partikel yang dipaksa atau
gravitasi (sedimentasi) g ( )
Untuk pemisahan secara mekanik sangat
baik untuk partikel halus jika secara gravitasi p j g
tidak memberikan hasil yang baik.
Ada dua kategori pemisahan secara Ada dua kategori pemisahan secara
sentrifusi
Senyawa dimana cairan bergerak melalui Senyawa dimana cairan bergerak melalui
media konstan (syklon, hidroklon, dll.)
Senyawa dimana system bergerak
3
Senyawa dimana system bergerak
membentuk gaya sentrifugal (sentrifusi)
Kerja Sentrifusi Kerja Sentrifusi
Pada sentrifusi, wadah container berputar p
untuk menghasilkan gaya sentrifugasi pada
sistem
Larutan bergerak dari bagian bawah dan
menetap dibagian atas. Pada saat cairan p g
bergerak, partikel menjadi mengendap pada
bagian bawah
Konsentrasi partikel berbeda-beda pada fasa
cair berubah berdasarkan waktu sentrifusi, cair berubah berdasarkan waktu sentrifusi,
karena volume dan kecepatan meningkat
Fenomena ini disebut pengenceran radial
4
(radial dilution)
Gaya Sentrifugal Relatif Gaya Sentrifugal Relatif
Pemisahan secara sentrifusi didasarkan pada gaya Pemisahan secara sentrifusi didasarkan pada gaya
sentrifugal relatif
Setiap partikel yang berputar pada kecepatan sudut
k t l h k l b F yang konstan memperoleh gaya keluar sebesar F
r W F .
2
=
W= kecepatan sudut
r = radius perputaran (cm) p p ( )
F dinyatakan sebagai gaya gravitasi bumi atau gaya
sentrifugal relatif (Relative Centrifugal Force = RCF) sentrifugal relatif (Relative Centrifugal Force RCF)
980
2
r w
RCF =
5
980
Gaya Sentrifugal Relatif Gaya Sentrifugal Relatif
Dalam penggunaan, dinyatakan dalam putaran p gg y p
per menit (revolution per minute = rpm)
Maka: rpm diubah menjadi radian Maka: rpm diubah menjadi radian
30
) (rpm
W =
sehingga:
30
) . (
2
rpm
980
.
30
) . (
2
r
rpm
CRF

=
980
r rpm CRF . ) )( 10 . 119 , 1 (
2 5
=
6
r rpm CRF . ) )( 10 . 119 , 1 (
Rotor Sentrifusi
Sumbu Rotasi
Swinging-bucket
At rest Spinning
g
At rest
g
Spinning
g
Fixed-angle g
7
Geometry Rotor Geometry Rotor
Sumbu Rotasi
r
max
r
av
r
min
r
r
a
r
av
r
min
r
r
av
r
min
b c
r
max
r
max
b c
8
Sedimentation path length
Gaya Sentrifugal
Relatif Relatif
Sumbu Rotor
r minimum
r rata-rata
r maksimum
9
Contoh soal Contoh soal
Misalkan suatu sentrifusi Misalkan suatu sentrifusi
mempunyai rotor yang
berputar dengan r
Sumbu Rotor
berputar dengan r
berbeda sebagai berikut:
r minimum = 4,8 cm, dan
r minimum
, ,
r maksimum = 8,0 cm.
Bila kecepatan berputar
r rata-rata
adalah 12.000 rpm.
Hitunglah RCF yang
r maksimum
bekerja pada ujung atas
dan bawah wadah yang
10
berputar tersebut
Jawaban soal Jawaban soal
Dengan menggunakan rumus diperoleh Dengan menggunakan rumus diperoleh
RCF = (1,119 x 10
-5
)(rpm)
2
r
RCF atas = (1,119 x 10
-5
)(12000)
2
x 4,8 cm = 7734 g
RCF bawah = (1,119 x 10
-5
)(12000)
2
x 8,0 cm = 12981 g
Kesimpulan:
Terjadi perbedaan gaya sentrifugal yang berbeda Terjadi perbedaan gaya sentrifugal yang berbeda
pada ujung atas dan bawah tabung.
Nilai RCF dinyatakan sebagai RCF rata-rata dari Nilai RCF dinyatakan sebagai RCF rata-rata dari
ujung atas dan bawah tabung
Penentuan r rata-rata sangat penting
11
Penentuan r rata rata sangat penting
Soal Tahun 2009 dan 2012 Soal Tahun 2009 dan 2012
Pemisahan organel tanaman dilakukan secara Pemisahan organel tanaman dilakukan secara
sentrifusi pada kecepatan 25000 rpm, dan
posisi tabung sentrifusi pada rotor yang posisi tabung sentrifusi pada rotor yang
digunakan memiliki r
minimum
4 cm dan r
maksimum
7 cm Hitunglah RCF yang bekerja pada 7 cm. Hitunglah RCF yang bekerja pada
sentrifusi
P i h l dil k k t if i Pemisahan organel dilakukan secara sentrifusi
pada kecepatan 25000 rpm, dan posisi tabung
t if i d t di k iliki sentrifusi pada rotor yang digunakan memiliki
r
minimum
3 cm dan r
maksimum
8 cm. Hitunglah RCF
b k j d t if i
12
yang bekerja pada sentrifusi
Kategori Sentrifusi Kategori Sentrifusi
Kategori sentrifusi dapat
diklassifikasikan menjadi dua diklassifikasikan menjadi dua,
yaitu y
1) Sentrifusi Laboratorium
2) Sentrifusi Preparative
13 13
Sentrifusi Laboratorium Sentrifusi Laboratorium
Di k t k i h l Dipergunakan untuk pemisahan sampel
dalam skala kecil dan pemisahan partikel
dalam sampel di laboratorium dalam sampel di laboratorium
Besar sampel berada pada skala 1 5000 ml
Bahan yang akan disentrifusi terdistribusi di
dalam wadah sentrifusi
Wadah sentrifusi terletak secara simetris di
dalam rotor
Jenis rotor yang dipergunakan:
wadah melekat pada rotor permanen
14 14
p p
wadah berayun pada rotor
Sentrifusi laboratorium Sentrifusi laboratorium
Kuning berkabut Kuning berkabut Kuning berkabut Kuning berkabut
Kuning bersih Kuning bersih
Bening bersih Bening bersih
Endapan putih Endapan putih
15 15
sampel sampel
Penyeimbang Penyeimbang
Sentrifusi Laboratorium Sentrifusi Laboratorium
M i d k i k tik l Menginduksi pergerakan partikel
menuju dasar tabung pada medan
grafitasi
Kecepatan rotasi 1 000 15 000 rpm Kecepatan rotasi 1.000 15.000 rpm
Induksi medan grafitasi diukur sebagai g g
harga G
Harga G dipengar hi oleh kecepatan Harga G dipengaruhi oleh kecepatan
rotasi dan posisi wadah sentrifusi pada
t
16 16
rotor
Sentrifusi Preparative Sentrifusi Preparative
Dipergunakan untuk larutan dengan skala
volume besar (misalnya 1 ratusan liter)
Didisain khusus untuk industri
Bentuk umum: Biasanya suspenssi
dimasukan pada satu ujung dan dan
supernantnya ditampung pada ujung yang
lain secara berkelanjutan
Bentuk yang umum adalah sentrifusi tubular
17 17
Kecepatan rotasi: 500 - 2000 rpm
Jenis Sentrifusi Jenis Sentrifusi
B b j i t if i Beberapa jenis sentrifusi yang
dipergunakan dalam teknik pemisahan
diantaranya
1) S t if i kli i (Cli i l 1) Sentrifusi klinis (Clinical
centrifuge)
2) Sentrifusi kecepatan tinggi (High
d t if ) speed centrifuge)
3) Sentrifusi Ultra (Ultra centrifuges)
18 18
3) Sentrifusi Ultra (Ultra centrifuges)
Jenis jenis Sentrifusi Jenis-jenis Sentrifusi
1. 1. Sentrifusi Sentrifusi klinis klinis (clinical centrifuges) (clinical centrifuges)
Termasuk sentrifusi sederhana
Digunakan untuk pemisahan partikel yang Digunakan untuk pemisahan partikel yang
mudah mengendap dalam sampel klinis,
Sel darah dan Bakteri Sel darah dan Bakteri
Kecepatan SK < 3000 rpm Kecepatan SK 3000 rpm
Dioperasikan pada suhu kamar
19
Sentrifusi Klinis Sentrifusi Klinis
20
Jenis jenis Sentrifusi Jenis-jenis Sentrifusi (lanjutan)
2. Sentrifusi Sentrifusi kecepatan kecepatan tinggi tinggi (High speed (High speed
centrifuge) centrifuge)
Lebih baik dari sentrifusi klinik
Dig nakan nt k memisahkan partikel Digunakan untuk memisahkan partikel
yang lebih kecil dan untuk preparatif
sampel biokimia: Mengumpulkan ragi sampel biokimia: Mengumpulkan ragi
atau bakteri
K t HSC 20000 30000 Kecepatan HSC = 20000-30000 rpm
Dilengkapi dengan pendingin untuk
21
g p g p g
mendinginkan rotor
Sentrifusi Kecepatan Tinggi Sentrifusi Kecepatan Tinggi
22
High Speed Centrifuge High Speed Centrifuge
Beckman Avanti J
series High speed series High speed
centrifuge
26,000 rpm (revolutions
per minute) p )
82,000 g (gravities)
W i ht 600 lb Weight 600 lb
23
Jenis HSC Jenis HSC
Ad 2 j i S t if i k t ti i Ada 2 jenis Sentrifusi kecepatan tinggi
1. HSC Sederhana
2. HSC Modifikasi (Lebih baik)
1. HSC Sederhana
Dilengkapi motor elektris (steam turbine) Dilengkapi motor elektris (steam turbine)
Kapasitas 1-2 liter
Sampel dapat dipompakan secara otomatis
dan pemisahan dapat dikumpulkan secara
24
kontiniu
Jenis HSC Jenis HSC
2. Sentrifusi HSC Modifikasi (lebih baik)
Dilengkapi dengan pendingin (0-4
o
C) Dilengkapi dengan pendingin (0-4 C)
Kapasitas lebih kecil
Digunakan untuk mengumpulkan
mikroorganisme seperti virus, Sel-sel, g p , ,
Organel selular yang besar, Endapan dari
koloid, Organel kecil seperti ribosom g p
25
Jenis jenis Sentrifusi Jenis-jenis Sentrifusi (lanjutan)
3 Sentrifusi ultra (ultra centrifuges) 3. Sentrifusi ultra (ultra centrifuges)
Sangat canggih dan dilengkapi komponen:
pengatur kecepatan pengatur suhu pengatur kecepatan, pengatur suhu,
sistem vakum, dan rotor
Kecepatan 90000 rpm (r = 8 cm) Kecepatan 90000 rpm (r = 8 cm)
Untuk sentrifusi ultra mikro 150000 rpm
Dapat digunakan untuk fraksinasi organel
subselular, Mengisolasi virus dalam
b t k i M i l i l k l ti bentuk murni, Mengisolasi molekul seperti
DNA, RNA
P l k li i if
26
Perlu untuk analisis preparatif
Sentrifusi Ultra Sentrifusi Ultra
BECKMAN M d l L8 55 ULTRA CENTRIFUGE
27
BECKMAN Model: L8-55 ULTRA-CENTRIFUGE
Ultra Centrifuges Ultra Centrifuges
Sorvall Ultra-
P 80 Pro 80
80,000 rpm
602,644 g
28
Micro ultra Centrifuges Micro-ultra Centrifuges
Sorval M150 SE
150,000 rpm
1 048 000 g 1,048,000 g
29
Komponen Sentrifusi Ultra Komponen Sentrifusi Ultra
1 Pengtur kecepatan dan penggerak 1. Pengtur kecepatan dan penggerak
Dilengkapi pengatur agar pergerakan rotor tidak
bergerak diatas kecepatan maksimum bergerak diatas kecepatan maksimum
Penggerak tersusun oleh motor listrik yang
didinginkan dengan air
Kecepatan dapat diatur dengan ketelitian jumlah
putaran per menit (mis 1-10 min)
2. Pengatur suhu berupa thermocouple dengan
menggunakan sensor radiometrik IR
3 Si t V k P d k t ti i ( 40000 ) 3. Sistem Vakum: Pada kecepatan tinggi (>40000 rpm)
terjadi friksi udara mengakibatkan panas
4 Rotor: Tipe swinging bucket terdiri dari 3 6 bucket
30
4. Rotor: Tipe swinging bucket terdiri dari 3-6 bucket
Tipe angle
Koefisien Sedimentasi Koefisien Sedimentasi
Molekul/partikel yang berputar disekeliling sumbu
menerima gaya sentrifugal F
Partikel mengalami sedimentasi ke arah dasar Partikel mengalami sedimentasi ke arah dasar
tabung pada kecepatan V
d
V
m p
r 2
) (

r = jarak sumbu rotasi ke molekul yang mengalami
r w
f d
V
m p
t
r 2
) (
= =
j y g g
sedimentasi (cm)
= volume partikel (cm
3
)

p
= dentinitas partikel (g/cm
3
)

m
= dentinitas medium (g/cm
3
)
31
f = koefisien friksi (cm/det)
Koefisien Sedimentasi Koefisien Sedimentasi
(lanjutan)
Kecepatan sedimentasi per menit gaya F disebut
sebagai koefisien sedimentasi (S)
d 1
) (
atau
r w
x
d
d
S
t
r
2
1
=
f
S
m p
) (

=
Koefisien friksi suatu molekul bergantung pada
ukuran, bentuk dan visko sitas medium.
Untuk molekul bulat dengan radius r
m
berlaku
r n f . . . 6 =
n = visikositas medium (g/cm det)
r = radius partikel (cm)
m
r n f . . . 6
32
r
m
= radius partikel (cm)
Penentuan Sedimentasi Penentuan Sedimentasi
Koefisien sedimentasi ditentukan
menggunakan ultrasentrifusi
Dilengkapi instrumen optik untuk mengamati
pergerakan sedimen menjauh dari sumbu rotasi
Bila koefisien sedimentasi partikel belum
dik t h i k t k fi i di t i diketahui maka penetuan koefisien sedimentasi
dilakukan menggunakan partikel yang diketahui
koefisien sedimentasinya (standar) koefisien sedimentasinya (standar)
Harga perbandingan pada waktu tertentu
dinyatakan (R) dinyatakan (R)
dik h i di h k
unknown ditempuh yang J arak
R =
33
diketahui yang ditempuh yang J arak
Penentuan Sedimentasi Penentuan Sedimentasi
Proses sedimentasi bergantung pada waktu Proses sedimentasi bergantung pada waktu
2 2
2
2
2 1
2
1
. . . . t w r t w r =
Dimana:
Unknown
Standard
Dimana:
w = kecepatan sudut
t = waktu
r = radius perputaran
34
p p
CONTOH SOAL
1) Pemisahan organel dilakukan secara ) g
sentrifusi ultra menggunakan gradien 10%
sukrosa selama 140 menit dengan kecepatan g p
49000 rpm. Untuk memperoleh hasil yang
sama dalam waktu 100 menit, hitunglah , g
berapa kecepatan yang diperlukan. Anggap r
konstan
Jawab:
2
2
2 1
2
1
. . . . t w r t w r =
2 2 1 1
Unknown
Standard
35
Densitas Gradien Densitas Gradien
Diperlukan untuk sentrifusi ultra preparatif
Pergerakan partikel di dalam larutan (media)
dipengaruhi oleh:
getaran mekanis
Suhu Suhu
Gradien
Terganggu
(terpengaruh)
Konveksi
36
Densitas Gradien Densitas Gradien
Untuk mengatasi gangguan dibutuhkan gradien di
dalam tabung/wadah sentrifusi seperti:
Sukrosa
Gliserol
Konsentrasi gradien
d ilih
sesium klorida
sesium sulfat
dan pemilihan
disesuaikan dengan
partikel/molekul yang
Ficoll
Metrizamide
partikel/molekul yang
akan dipisahkan
Sifat gradien dapat berubah tergantung penggunaan
37
Tipe teknik yang digunakan
1. Sentrifusi zona
D l di t i i / tik l
y g g
Dalam proses sedimentasi, spesies/partikel yang
berbeda ukuran tetapi densitas sama (dekat)
Digunakan untuk memisahkan partikel berbeda
k t t i d it
g p
ukuran tetapi densitas sama
Densitas gradien maksimum < densitas partikel
yang diendapkan y g p
Contoh: Pemisahan protein
Gradien : sukrosa 5-20%
RCF : 67986 g
Waktu : 9 jam
P i h P t i BM 54000 D lt d P t i Pemisahan : Protein BM 54000 Dalton dan Protein
BM 154000 Dalton
Sedimentasi tidak sempurna
38
p
Waktu sedimentasi singkat, kecepatan lebih rendah
Tipe teknik yang digunakan
2. Sentrifusi Isopiknik
Tipe teknik yang digunakan
2. Sentrifusi Isopiknik
Dalam proses sedimentasi: partikel/molekul
tersedimentasi melalui gradien menuju daerah tersedimentasi melalui gradien menuju daerah
yang mempunyai densitas sama dengan
densitas gradien
Sentrifusi berlangsung lama pada kecepatan
tinggi gg
Digunakan untuk memisahakn partikel/moelkul
dengan ukuran sama tetapi densitas berbeda g p
Densitas gradien maksimum > densitas
spesies yang diendapkan
39
spesies yang diendapkan
Sentrifusi Isopiknik
Contoh penggunaan:
Sentrifusi Isopiknik
Contoh penggunaan:
(1) Pemisahan organel subselular:
Mit k d i ( 119 /
3
) Mitokondria ( = 119 g/cm
3
)
Proplastid ( = 1,23 g/cm
3
)
Glikosom ( = 1,25 g/cm
3
)
(2)Pemisahan asan nukleat (DNA, RNA) ( ) ( , )
Sedimentasi berlangsung sempurna
Karena protein mempunyai densitas
hampir sama maka teknik isopiknik tidak
40
dapat digunakan untuk memisahkan
Tugas Pribadi 4
Gunakan EBSCO atau Proquest, Download
Tugas Pribadi 4
Gunakan EBSCO atau Proquest, Download
Jurnal Internasional (thn 2011-2013) berisi
analisis pemisahan menggunakan sentrifusi:
Buat ringkasan 500 sampai 1500 kata diketik
rapi dan sertakan halaman depan Jurnal
t b t d h l t khi t tesebut pada halaman terakhir tugas
Tulis Tugas ke 4 Sentrifusi di halaman
depan, Nama dan NIM
Hindarkan Plagiat dan duplikasi dengan g p g
mahasiswa lain (dianggap nilai nol)
Tugas diserahkan pada Minggu ke-8
41
g p gg