Bahan Kuliah 6

PEMISAHAN MENGGUNAKAN
METODE SENTRIFUSI
Prof. Drs. Manihar Situmorang, M.Sc., PhD
Dr. Marudut Sinaga, M.Si

Jurusan Kimia FMIPA

UNIVERSITAS NEGERI MEDAN
2022 1
 Sentrifusi
 Termasuk metode pemisahan dengan cara
fisika
 Banyak digunakan dalam pemisahan sel,
organel dam molekul (Biologi/Biokimia)
 Dalam analisis diperlukan untuk pemisahan
partikel berdasarkan ukuran partikel
 Misal:
 Sedimentasi koloid
 Fraksinasi gradien
2
 Gaya Sentrifugal Relatif
 Pemisahan secara mekanik berdasarkan
perpindahan partikel yang dipaksa atau
gravitasi (sedimentasi)
 Untuk pemisahan secara mekanik sangat
baik untuk partikel halus jika secara gravitasi
tidak memberikan hasil yang baik.
 Ada dua kategori pemisahan secara
sentrifusi
 Senyawa dimana cairan bergerak melalui
media konstan (syklon, hidroklon, dll.)
 Senyawa dimana system bergerak
membentuk gaya sentrifugal (sentrifusi) 3
 Kerja Sentrifusi
 Pada sentrifusi, wadah container berputar
untuk menghasilkan gaya sentrifugasi pada
sistem
 Larutan bergerak dari bagian bawah dan
menetap dibagian atas. Pada saat cairan
bergerak, partikel menjadi mengendap pada
bagian bawah
 Konsentrasi partikel berbeda-beda pada fasa
cair  berubah berdasarkan waktu sentrifusi,
karena volume dan kecepatan meningkat 
Fenomena ini disebut pengenceran radial
(radial dilution)
4
 Gaya Sentrifugal Relatif
 Pemisahan secara sentrifusi didasarkan pada gaya
sentrifugal relatif
 Setiap partikel yang berputar pada kecepatan sudut
yang konstan memperoleh gaya keluar sebesar F

F  W 2. r
W = kecepatan sudut
r = radius perputaran (cm)
 F dinyatakan sebagai gaya gravitasi bumi atau gaya
sentrifugal relatif (Relative Centrifugal Force = RCF)
w2 r
RCF 
980
5
 Gaya Sentrifugal Relatif
 Dalam penggunaan, dinyatakan dalam putaran
per menit (revolution per minute = rpm)
 Maka: rpm diubah menjadi radian
(rpm)
W 
30
sehingga:

𝑹𝑪𝑭=¿¿¿ −5
𝑹𝑪𝑭 =(1,119.1 0 ) ¿ 6
 Rotor Sentrifusi
Sumbu Rotasi
Swinging-bucket

At rest Spinning g
g

Fixed-angle

7
 Geometry Rotor

rmax rav rmin Sumbu Rotasi

a
rmin rmin
rav rav
rmax rmax
b c

Sedimentation path length 8

Gaya Sentrifugal Relatif

Sumbu Rotor

r minimum

r rata-rata

r maksimum

9
 Contoh soal
 Misalkan suatu sentrifusi
mempunyai rotor yang Sumbu Rotor

berputar dengan r
berbeda sebagai berikut:
r minimum = 4,8 r minimum

cm, dan r maksimum =

r rata-rata
8,0 cm. Bila kecepatan
berputar adalah 12.000
r maksimum
rpm. Hitunglah RCF yang
bekerja pada ujung atas
dan bawah wadah yang
berputar tersebut
10
 Jawaban soal
 Dengan menggunakan rumus diperoleh
RCF = (1,119 x 10-5)(rpm)2r
RCF atas = (1,119 x 10-5)(12000)2 x 4,8 cm = 7734 g
RCF bawah = (1,119 x 10-5)(12000)2 x 8,0 cm = 12981 g
 Kesimpulan:
 Terjadi perbedaan gaya sentrifugal yang berbeda
pada ujung atas dan bawah tabung.
 Nilai RCF dinyatakan sebagai RCF rata-rata dari
ujung atas dan bawah tabung
 Penentuan r rata-rata sangat penting

11
 Kategori Sentrifusi

 Kategori sentrifusi dapat

diklassifikasikan menjadi dua,
yaitu
1) Sentrifusi Laboratorium
2) Sentrifusi Preparative

12
 Sentrifusi Laboratorium
 Dipergunakan untuk pemisahan sampel
dalam skala kecil dan pemisahan partikel
dalam sampel di laboratorium
 Besar sampel berada pada skala 1 – 5000 ml
 Bahan yang akan disentrifusi terdistribusi di
dalam wadah sentrifusi
 Wadah sentrifusi terletak secara simetris di
dalam rotor
 Jenis rotor yang dipergunakan:
 wadah melekat pada rotor permanen
 wadah berayun pada rotor
13
 Sentrifusi laboratorium

Kuning berkabut
Kuning bersih

Bening bersih

Endapan putih

sampel Penyeimbang
14
 Sentrifusi Laboratorium
 Menginduksi pergerakan partikel
menuju dasar tabung pada medan
grafitasi
 Kecepatan rotasi 1.000 – 15.000 rpm
 Induksi medan grafitasi diukur sebagai
harga G
 Harga G dipengaruhi oleh kecepatan
rotasi dan posisi wadah sentrifusi pada
rotor
15
 Sentrifusi Preparative
 Dipergunakan untuk larutan dengan skala
volume besar (misalnya 1 – ratusan liter)
 Didisain khusus untuk industri
 Bentuk umum: Biasanya suspenssi
dimasukan pada satu ujung dan dan
supernantnya ditampung pada ujung yang
lain secara berkelanjutan
 Bentuk yang umum adalah sentrifusi tubular
 Kecepatan rotasi: 500 - 2000 rpm
16
 Jenis Sentrifusi
 Beberapa jenis sentrifusi yang
dipergunakan dalam teknik pemisahan
diantaranya
1) Sentrifusi klinis (Clinical
centrifuge)
2) Sentrifusi kecepatan tinggi (High
speed centrifuge)
3) Sentrifusi Ultra (Ultra centrifuges)
17
 Jenis-jenis Sentrifusi
1. Sentrifusi klinis (clinical centrifuges)
 Termasuk sentrifusi sederhana
 Digunakan untuk pemisahan partikel yang
mudah mengendap dalam sampel klinis,
Sel darah dan Bakteri
 Kecepatan SK < 3000 rpm
 Dioperasikan pada suhu kamar

18
Sentrifusi Klinis

19
 Jenis-jenis Sentrifusi (lanjutan)
2. Sentrifusi kecepatan tinggi (High speed
centrifuge)
 Lebih baik dari sentrifusi klinik
 Digunakan untuk memisahkan partikel
yang lebih kecil dan untuk preparatif
sampel biokimia: Mengumpulkan ragi
atau bakteri
 Kecepatan HSC = 20000-30000 rpm
 Dilengkapi dengan pendingin untuk
mendinginkan rotor
20
Sentrifusi Kecepatan Tinggi

21
 High Speed Centrifuge
 Beckman Avanti J
series High speed
centrifuge
 26,000 rpm (revolutions
per minute)
 82,000 g (gravities)
 Weight 600 lb

22
Micro HS Centrifuge

23
 Jenis HSC
 Ada 2 jenis Sentrifusi kecepatan tinggi
1. HSC Sederhana
2. HSC Modifikasi (Lebih baik)

1. HSC Sederhana
 Dilengkapi motor elektris (steam turbine)
 Kapasitas 1-2 liter
 Sampel dapat dipompakan secara otomatis
dan pemisahan dapat dikumpulkan secara
kontiniu 24
 Jenis HSC
2. Sentrifusi HSC Modifikasi (lebih baik)
 Dilengkapi dengan pendingin (0-4oC)
 Kapasitas lebih kecil
 Digunakan untuk mengumpulkan
mikroorganisme seperti virus, Sel-sel,
Organel selular yang besar, Endapan dari
koloid, Organel kecil seperti ribosom

25
 Jenis-jenis Sentrifusi (lanjutan)
3. Sentrifusi ultra (ultra centrifuges)
 Sangat canggih dan dilengkapi komponen:
pengatur kecepatan, pengatur suhu,
sistem vakum, dan rotor
 Kecepatan 90000 rpm (r = 8 cm)
 Untuk sentrifusi ultra mikro 150000 rpm
 Dapat digunakan untuk fraksinasi organel
subselular, Mengisolasi virus dalam
bentuk murni, Mengisolasi molekul seperti
DNA, RNA
 Perlu untuk analisis preparatif
26
Sentrifusi Ultra

27
Sentrifusi Ultra

28
 Sentrifusi Ultra

BECKMAN Model: L8-55 ULTRA-CENTRIFUGE

29
 Ultra Centrifuges

• Sorvall Ultra-
Pro 80
• 80,000 rpm
• 602,644 g

30
 Micro-ultra Centrifuges

• Sorval M150 SE
• 150,000 rpm
• 1,048,000 g

31
 Komponen Sentrifusi Ultra
1. Pengtur kecepatan dan penggerak
 Dilengkapi pengatur agar pergerakan rotor tidak
bergerak diatas kecepatan maksimum
 Penggerak tersusun oleh motor listrik yang
didinginkan dengan air
 Kecepatan dapat diatur dengan ketelitian jumlah
putaran per menit (mis 1-10 min)
2. Pengatur suhu berupa thermocouple dengan
menggunakan sensor radiometrik IR
3. Sistem Vakum: Pada kecepatan tinggi (>40000 rpm)
terjadi friksi udara mengakibatkan panas
4. Rotor: Tipe swinging bucket terdiri dari 3-6 bucket
Tipe angle
32
 Koefisien Sedimentasi
 Molekul/partikel yang berputar disekeliling sumbu
menerima gaya sentrifugal F
 Partikel mengalami sedimentasi ke arah dasar
tabung pada kecepatan V
dr ( p  m ) 2
V   wr
dt f
r = jarak sumbu rotasi ke molekul yang mengalami
sedimentasi (cm)
 = volume partikel (cm3)
p = dentinitas partikel (g/cm3)
m = dentinitas medium (g/cm3)
f = koefisien friksi (cm/det)
33
 Koefisien Sedimentasi
(lanjutan)

 Kecepatan sedimentasi per menit gaya F disebut

sebagai koefisien sedimentasi (S)
dr 1 ( p  m )
S x 2 atau S 
dt w r f

 Koefisien friksi suatu molekul bergantung pada

ukuran, bentuk dan visko sitas medium.
 Untuk molekul bulat dengan radius rm berlaku

f  6. .n.rm
n = visikositas medium (g/cm det)
rm = radius partikel (cm)
34
 Penentuan Sedimentasi
 Koefisien sedimentasi ditentukan menggunakan
ultrasentrifusi
 Dilengkapi instrumen optik untuk mengamati
pergerakan sedimen menjauh dari sumbu rotasi
 Bila koefisien sedimentasi partikel belum
diketahui maka penetuan koefisien sedimentasi
dilakukan menggunakan partikel yang diketahui
koefisien sedimentasinya (standar)
 Harga perbandingan pada waktu tertentu
dinyatakan (R)
Jarak yang ditempuh unknown
R
Jarak yang ditempuh yang diketahui
35
 Penentuan Sedimentasi
 Proses sedimentasi bergantung pada waktu

2 2
r.w1 .t1  r.w2 .t 2
Unknown Standard
Dimana:
w = kecepatan sudut
t = waktu
r = radius perputaran

36
 CONTOH SOAL
1) Pemisahan organel dilakukan secara
sentrifusi ultra menggunakan gradien 10%
sukrosa selama 140 menit dengan kecepatan
49000 rpm. Untuk memperoleh hasil yang
sama dalam waktu 100 menit, hitunglah
berapa kecepatan yang diperlukan. Anggap r
konstan
Jawab: 2 2
r.w1 .t1  r.w2 .t 2
Unknown Standard

37
 Densitas Gradien

 Diperlukan untuk sentrifusi ultra preparatif

 Pergerakan partikel di dalam larutan (media)
dipengaruhi oleh:
 getaran mekanis
 Suhu
Terganggu
 Gradien (terpengaruh)
 Konveksi

38
 Densitas Gradien
 Untuk mengatasi gangguan dibutuhkan gradien di
dalam tabung/wadah sentrifusi seperti:
 Sukrosa
 Gliserol Konsentrasi gradien
 sesium klorida dan pemilihan
 sesium sulfat disesuaikan dengan
 Ficoll partikel/molekul yang
 Metrizamide akan dipisahkan

 Sifat gradien dapat berubah tergantung penggunaan

39
 Tipe teknik yang digunakan
1. Sentrifusi zona
 Dalam proses sedimentasi, spesies/partikel yang
berbeda ukuran tetapi densitas sama (dekat)
 Digunakan untuk memisahkan partikel berbeda
ukuran tetapi densitas sama
 Densitas gradien maksimum < densitas partikel
yang diendapkan

Contoh: Pemisahan protein

Gradien : sukrosa 5-20%
RCF : 67986 g
Waktu : 9 jam
Pemisahan : Protein BM 54000 Dalton dan Protein
BM 154000 Dalton
 Sedimentasi tidak sempurna
 Waktu sedimentasi singkat, kecepatan lebih rendah
40
 Tipe teknik yang digunakan
2. Sentrifusi Isopiknik
 Dalam proses sedimentasi: partikel/molekul
tersedimentasi melalui gradien menuju daerah
yang mempunyai densitas sama dengan
densitas gradien
 Sentrifusi berlangsung lama pada kecepatan
tinggi
 Digunakan untuk memisahakn partikel/moelkul
dengan ukuran sama tetapi densitas berbeda
 Densitas gradien maksimum > densitas
spesies yang diendapkan
41
 Sentrifusi Isopiknik
Contoh penggunaan:
(1) Pemisahan organel subselular:
 Mitokondria ( = 119 g/cm3)
 Proplastid ( = 1,23 g/cm3)
 Glikosom ( = 1,25 g/cm3)
(2)Pemisahan asan nukleat (DNA, RNA)
 Sedimentasi berlangsung sempurna
 Karena protein mempunyai densitas
hampir sama maka teknik isopiknik tidak
dapat digunakan untuk memisahkan
42