Analisis Vitamin C dengan Metode HPLC

Kromatografi merupakan suatu cara pemisahan fisik dengan unsur-unsur yang akan dipisahkan
terdistribusikan antara dua fasa, satu dari fasa-fasa ini membentuk suatu lapisan stasioner dengan
luas permukaanyang besar dan yang lainnya merupakan cairan yang merembes lewat atau melalui
lapisan yang stasioner. Fasa stasioner mugkin suatu zat padat atau suatu cairan, dan fasa yang
bergerak mungkin suatu cairan atau suatu gas. Maka semua jenis kromatografi yang dikenal, terbagi
menjadi empat golongan: cair-padat, gas-padat, cair-cair, dan gas-cair (Underwood, 1986).
Pembahasan teknik kromatografi modern baru lengkap bila disebut kromatografi cairan penampilan
tinggi (HPLC). Kromatografi cairan kolom klasik merupakan prosedur pemisahan yang sudah
mapan dalam mana fase cair yang mobil mengalir lambat-lambat lewat kolom karena gravitasi.
Umumnya metode itu dicirikan oleh efisiensi kolom yang rendah dan waktu pemisahan yang lama.
Namun sejak kira-kira tahun 1969, perhatian dalam teknik kolom cairan hidup kembali dengan
sangat menyolok karena dikembangkannya sistem tekanan tinggi oleh Kirchland dan Huber,yang
bekerja pada tekanan sampai 2,07 x 10 7 Nm-2 (3000 p.s.i). Dalam metode ini digunakan kolom
berdiameter kecil (1-3 mm) dengan partikel pendukung berukuran sekitar 30 ?m dan eluen
dipompakan ke dalamnya dengan laju aliryang tinggi (sekitar 1-5 cm 3m-1). Pemisahan dengan
metode ini dilakukan jauh lebih cepat (sekitar 100 kali lebih cepat) daripada dengan kromatografi
cairan yang biasa. Meskipun peralatan yang tersedia di pasar dewasa ini agak mahal. HPLC telah
terbukti luas penggunaannya dalam kimia organik. Pengembangan penerapan dalam anorganik
menjadi mungkin, misalnya dalam bidang kromatografi pertukaran ion di mana telah tersedia
dipasar dengan nama dagang ‘Zipax’ resin peliklar, yakni resin yang dihasilkan dalam bentuk
saluran tipis pada permukaan manik kaca yang blat (diameter 2050 mikrometer). Manik-manik itu
mempunyai permukaan berpori yang tebalnya 2 mikrometer yang berperan sebagai pengikat saluran
resin itu (Bassett et. all., 1994).
Umumnya metode kromatografi seperti adsorpsi, partisi, dan penukar ion adalah contoh-contoh dari
kromatografi kolom. Pada metode kromatografi cair ini digunakan kolom tabung gelas dengan
bermacam diameter. Partikel dengan dimensiyang bervariasi digunakan sebagai penunjang
stasioner. Banyaknya cairan pada kolom jumlahnya sedemikian rupa sehingga hanya cukup
menghasilkan sedikit tekanan untuk memelihara aliran fase bergerakyang seragam. Secara
keseluruhan pemisahan ini memakan waktu lama. Berbagai usaha telah dilakukan untuk menambah
laju aliran tanpa mengubah tinggi piringan teoritis kolom. Penurunan ukuran partikel penunjang
stasioner tidak selalu menguntungkan. Kromatografi cair kinerja tinggi atau high performance
liquid chromatography (HPLC) berbeda dari kromatografi cair klasik. HPLC menggunakan kolom
dengan diameter umumnya kecil, 2-8 mm dengan ukuran partikel penunjang 50 ?m; sedangkan laju
aliran dipertinggi dengan tekananyang tinggi (Khopkar, 2003).
Bila dibandingkan terhadap kromatografi gas-cair/gas-liquid chromatography (GLC), maka HPLC
lebih bermanfaat untuk isolasi zat tidak mudah menguap, demikian juga zat yang secara termal
tidak stabil. Tetapi ditinjau dari kecepatan dan kesederhanaan, GC lebih baik. Kedua teknik ini
komplementer satu sama lainnya, keduanya efisien, sangat selektif hanya memerlukan sampel
berjumlah sedikit serta keduanya dapat digunakan untuk analisis kuantitatif (Khopkar, 2003).
Susunan kimia vitamin C ditemukan pada tahun 1933 oleh ilmuwan Inggris dan Swiss. Isolasi asam
askorbat mula-mula ditemukan oleh King dari USA dan Szent-Gyorgy dari Hungaria. Vitamin ini
mempunyai dua bentuk, yaitu bentuk oksidasi (bentuk dehydro) dan bentuk reduksi. Kedua bentuk
ini mempunyai aktivitas biologi. Dalam makanan bentuk reduksiyang terbanyak. Banyak dehydro
dapat terus teroksidasi menjadi diketogulonic acid yang inaktif.
Susunan vitamin C
Keadaan vitamin C inaktif ini sering terjadi pada proses pemanasan (bila sayur-sayuran dimasak).
Di dalam suasana asam vitamin ini lebih stabil daripada dalam basayang menjadi inaktif
(diketogulonic acid) (Prawirokusumo, 1991).
*SUMBER:
Bassett, J., R.C. Denney, G.H. Jeffery, dan J. Mendham, 1994, Kimia Analisis Kuantitatif
Anorganik, Penerbit Buku Kedokteran EGC, Jakarta.
Day, R.A dan Underwood, A.L., 1986, Analisis Kimia Kuantitatif, Erlangga, Jakarta.
Khopkar, S.M., 2003, Konsep Dasar Kimia Analitik, UI Press, Jakarta.
Prawirokusumo, Soeharto, Prof. Dr. M.Sc., 1991, Biokimia Nutrisi dan Vitamin, BPFE, Yogyakarta.