BAB II

TINJAUAN PUSTAKA
2.1. Teori Dasar
Metode pengukuran obat dalam media biologis semakin penting untuk banyak
kelompok-kelompok sosial. Masalah-masalah yang berhubungan dengan bioavaibilitas,
bioekivalensi, pengembangan obat baru, penyalahgunaan obat, farmakokinetika klinik,
dan penelitian obat sangat bergantung pada metode analisis (Smith,1981).
Validasi metode menurut United States Pharmacopeia (USP) dilakukan untuk
menjamin bahwa metode analisis akurat, spesifik, reprodusibel, dan tahan pada kisaran
analit yang akan dianalisis. Suatu metode analisis harus divalidasi untuk melakukan
verifikasi bahwa parameter-parameter kinerjanya cukup mampu untuk mengatasi
problem analisis, karenanya suatu metode harus divalidasi, ketika:
a) Metode baru dikembangkan untuk mengatasi problem analisis tertentu.
b) Metode yang sudah baku direvisi untuk menyesuaikan perkembangan atau karena
munculnya suatu problem yang mengarahkan bahwa metode baku tersebut harus
direvisi.
c) Penjaminan mutu yang mengindikasikan bahwa metode baku telah berubah
seiring dengan berjalannya waktu.
d) Metode baku digunakan di laboratorium yang berbeda, dikerjakan oleh analis
yang berbeda, atau dikerjakan dengan alat yang berbeda.
e) Untuk mendemonstrasikan kesetaraan antar dua metode, seperti antara metode
baru dan metode baku (Gandjar, 2007).
Parameter kesahihan (validasi) metode analisis antara lain akurasi, presisi,
spesivitas, linearitas, sensitivitas, dan ruggedness :
a) Akurasi yang baik untuk bioanalisis rentang akurasi 80-120 % masih bisa
diterima. Untuk bioanalisis CV= 15-20 % masih diterima.
b) Linearitas yang bisa diterima jika memenuhi nilai koefisien korelasi (r) > 0,999
(Mulja dan Hanwar, 2003).
c) Sensitivity metode analisis

adalah

kemampuan metode analisis

untuk

memisahkan perbedaan kecil dalam konsentrasi analit. Ada dua faktor yang
mempengaruhi sensitivitas yaitu slope kurva baku dan keterulangan (Skoog,
1994).
d) Ruggedness digunakan untuk melihat reprodusibilitas hasil analisis menggunakan
sampel yang sama dengan berbagai macam kondisi percobaan seperti
laboratorium, analisis, instrument, waktu yang berbeda dan lain-lain (Anonim,
1995).

Dalam penetapan kadar obat dalam darah (cairan tubuh), metode yang digunakan
harus tepat dan dalam pengerjaannya diperlukan suatu ketelitian yang cukup tinggi agar
diperoleh hasil yang akurat. Sehingga nantinya dapat menghindari kesalahan yang fatal.
Akurasi yang baik untuk bahan obat dengan kadar kecil adalah 90-110%, akurasi untuk
kadar obat yang lebih besar biasanya disepakati 95-105%, akurasi untuk bahan baku
biasanya disepakati 98-102%, sedangkan untuk bioanalisis rentang akurasi 80-120%
masih bisa diterima. Dalam analisis ini, kesalahan hasil tidak boleh lebih dari 10 %,
akan tetapi hal ini tergantung pula pada alat yang digunakan (Ritschel,1976).
Dalam sebuah analisis obat dalam cairan hayati, ada hal-hal penting dalam
farmakokinetika yang digunakan sebagai parameter- parameter antara lain :
a) Tetapan laju invasi atau tetapan absorpsi.
b) Volume distribusi : menghubungkan jumlah obat dalam tubuh dengan konsentrasi
c)
d)
e)
f)
g)

obat (C) di dalam darah atau plasma.

Ikatan protein
Laju eliminasi dan waktu paruh dalam plasma (t1/2)
Clearence ginjal, ekstrarenal dan total
Luas dibawah kurva dalam plasma (AUC)
Ketersediaan hayati
Parameter di atas diperoleh dari perubahan konsentrasi bahan obat dan

metabolitnya dalam cairan darah (darah, plasma, serum) dan dalam urin terhadap
waktu. Kedua cairan tersebut mudah dilewati dan konsentrasi dalm darah yaitu alat
transportnya, mencerminkan proses kinetika dalam organisme (Mutschler, 1991).
Dalam menaksir ketersediaan hayati ada tiga parameter yang biasanya diukur
untuk menggambarkan profil konsentrasi obat dalam darah dan waktu dari obat yang
diberikan, yaitu :
a) Konsentrasi puncak (Cmax)
Menggambarkan konsentrasi obat tertinggi dalam sirkulasi sistemik.
Konsentrasi ini tergantung pada konstanta absorbsi, dosis volume distribusi dan
waktu pencapaian konsentrasi obat maksimum dalam darah. Konsentrasi puncak
harus di atas konsentrasi efektif minimum dan tidak melebihi konsentrasi toksik
minimun.
b) Waktu untuk konsentrasi puncak (Tmax)
Menggambarkan lamanya waktu tersedia untuk mencapai konsentrasi
puncak dari obat dalam sirkulasi sistemik. Parameter ini tergantung pada
konstanta absorbsi yang menggambarkan permulaan dari level puncak oleh
respon biologis dan bisa digunakan sebagai perkiraan kasar laju absorbsi.
c) Luas daerah di bawah kurva (AUC)
Total area di bawah kurva konsentrasi vs waktu yang menggambarkan
perkiraan jumlah obat yang berada pada sirkulasi sistemik. Parameter ini

menggambarkan jumlah ketersediaan hayati dan bisa digunakan sebagai perkiraan

kasar jumlah obat diabsorbsi (Syukri, 2002).
Parameter farmakokinetika sangat penting karena dapat menggambarkan
seberapa besar obat diabsorbsi, seberapa tepat obat dieliminasi, seberapa besar efek
terapeutik dan ketoksisikan suatu obat. Oleh karena itu agar parameter dapat dipercaya,
metode yang digunakan dalam menentukan kadar obat yang digunakan harus
memenuhi criteria sebagai berikut:
a) Selektif atau spesifik
Selektifitas metode adalah kemampuan suatu metode untuk membedakan suatu
obat dari metabolitnya. Selektifitas metode menempati prioritas utama karena
bentuk obat yang akan ditetapkan dalam cuplikan hayati adalah dalam bentuk tak
berubah atau metabolitnya. Metode analisis yang digunakan harus memiliki
spesifitas yang tinggi terhadap salah satu obat yang akan ditetapkan tersebut.
Penetapan kadar secara kalorimetrik dan spektrofotometrik biasanya kurang
spesifik. Gangguan dari zat lain dapat memperbesar kesalahan hasil (Shargel,
1999).
b) Sensitif atau peka
Sensitifitas metode berkaiatan dengan kadar terendah yang dapat diukur oleh
suatu metode analisis yang digunakan. Pemilihan metode analisis tergantung pada
tingkat sensitifitas yang dimiliki oleh metode tersebut. Hal ini dapat dipahami
karena dalam menghitung parameter farmakokinetika suatu obat, diperlukan
sederetan kadar dari waktu ke waktu. Sehingga metode analisis yang dipilih harus
dapat mengukur kadar obat tertimggi sampai yang terendah yang ada dalam
badan.
c) Ketelitian (accuracy) dan ketepatan (precision)
Ketelitian ditunjukan oleh kemampuan suatu metode untuk memberikan hasil
pengukuran sedekat mungkin dengan true value (nilai sesungguhnya). Presisi
menyatakan seberapa dekat nilai hasil dua kali atau lebih pengulangan
pengukuran. Semakin dekat nilainilai hasil pengulangan pengukuran maka
semakin presisi pengukuran tersebut.

Recovery=

h argauji
x 100 =P
h arga sesunggu h nya

Kesalahan sistematik =100 P

d) Cepat
Kecepatan berkaitan dengan banyaknya cuplikan hayati yang harus dianalisis
dalam suatu macam penelitian farmakokinetika

e) Efisien
Metode tidak terlalu panjang karena dikhawatirkan akan menimbulkan suatu
kesalahan sistematik.
2.2. Parasetamol
Parasetamol atau asetaminofen adalah senyawa turunan para-aminofenol yang
memiliki rumus bangun seperti di bawah ini :

Parasetamol berupa serbuk hablur atau serbuk putih yang tidak berbau dengan
rasa agak pahit. Kelarutan parasetamol yakni larut dalam air mendidih dan dalam
NaOH 1 N, serta mudah larut dalam etanol (Anonim, 1995). Parasetamol merupakan
obat asam lemah dengan pKa 9,5 (Katzung, 1989).
Parasetamol merupakan metabolit fenasetin dengan efek antipiretik yang sama
dan digunakan sejak tahun 1893. Efek antipiretiknya ditimbulkan oleh gugus
aminobnezen. Efek analgesik parasetamol serupa dengan asam salisilat, yaitu
menghilangkan nyeri ringan sampai sedang dengan mekanisme yang diduga
berdasarkan efek sentralnya. Parasetamol merupakan penghambat biosintesis
prostaglandin yang lemah. Dalam plasma, 25 % parasetamol terikat pada protein
plasma. Sebagai analgesik, parasetamol sebaiknya tidak diberikan terlalu lama karena
kemungkinan menimbulkan nefropati analgesik (Wilmana, 1995).
Farmakokinetika
Parasetamol diabsorpsi cepat dan sempurna melalui saluran cerna.
Konsentrasi tertinggi dalam plasma dicapai dalam waktu jam dan
masa paruh plasma antara 1-3 jam. Obat ini tersebar ke seluruh
cairan tubuh. Dalam plasma, 25% parasetamol terikat protein
plasma, dan dimetabolisme oleh enzim mikrosom hati. Sebagian
asetaminofen 80% dikonjugasi dengan asam glukoronat dan sebagian
kecil lainnya dengan asam sulfat. Selain itu dapat mengalami
hidroksilasi. Metabolit hasil hidroksilasi ini dapat menimbulkan
methemoglobinemia dan hemolisis eritrosit. Obat ini diekskresi
melalui ginjal, sebagian kecil sebagai parasetamol (3%) dan sebagian
besar dalam bentuk terkonjugasi.
2.3. Plasma Darah

Darah terdiri dari sel darah terdiri dari sel darah (eritrosit), sel darah putih
(leukosit), dan keping darah (trombosit), yang tersuspensi dalam plasma. Plasma
merupakan komponen cairan dari darah yang mengandung fibrinogen terlarut. Setelah
aktivasi oleh enzim plasmin, terbentuklah gumpalan fibrin. Sesudah gumpalan ini
disingkirkan, sisa yang tertinggal disebut serum.
Pada darah normal, jumlah plasma mencapai 55% dari volume darah. Plasma
tersebut mengandung 90% air dan 7% protein (albumin, globulin, fibrinogen), dan 3%
zat terlarut yang lain (garam-garam, oksigen, gas, glukosa, hormon, metabolit, nutrient
dan zat-zat lain) (Stalcup et al., 1995). Dalam plasma, protein yang terbanyak
ditemukan adalah albumin (Montgomery et al., 1992).
Dua fungsi utama albumin adalah untuk transport molekul kecil dalam plasma
dasn cairan ekstraseluler, dan untuk mempertahankan tekanan osmotik dalam kapiler
nonspesifik (Montgomery et al., 1992) yang memiliki 2 tempat ikatan pada setiap
molekulnya (Rang et al., 2003).
Pengikatan molekul kecil pada protein dapat dituliskan dengan persamaan umum
sebagai berikut: [P] + [A] [PA], dimana [P] = protein yang tidak membentuk kompleks
dengan molekul kecil, [A] = kadar molekul kecil yang tidak terikat, dan [PA] = kadar
kompleks protein-molekul kecil (Montgomery et al., 1992).
Tekanan osmosis plasma yaitu 7,3 atm dan dijaga dengan pengaturan osmosis
yang berfungsi dengan baik. Pada tekanan ini, yang berperan sampai 96% elektrolit
anorganik. Perbandingan ion yang satu terhadap ion yang lain dan pH plasma juga
dijaga hampir tetap oleh proses pengaturan khusus. Kation dengan konsentrasi plasma
tertinggi adalah natrium sedangkan anion plasma yang secara kuantitatif paling berarti
adalah klorida.
Pada umumnya serum atau plasma digunakan untuk pengukuran obat. Untuk
mendapatkan serum, darah dibekukan dan serum serum diambil dari supernatant setelah
disentrifugasi. Plasma diperoleh dari supernatant darah yang disentrifugasi dengan
ditambahkan antikoagulan seperti heparin. Oleh karena itu, serum dan plasma tidak
sama. Plasma mengalir ke seluruh jaringan tubuh termasuk semua elemen seluler dari
darah. Dengan berasumsi bahwa obat di plasma dalam kesetimbangan equilibrium
dengan jaringan, perubahan konsentrasi obat akan merefleksikan perubahan konsentrasi
perubahan konsentrasi obat di jaringan (Shergel, 2005).
2.4. Spektrofotometer UV-Visibel
Spektrofotometer sesuai dengan namanya adalah alat yang terdiri dari
spektrometer dan fotometer. Spektrometer menghasilkan sinar dari spektrum dengan
panjang gelombang tertentu dan fotometer adalah alat pengukuran intenditas cahaya

yang ditransmisikan atau yang diabsorbsi. Jadi, spektrofotometer digunakan untuk

mengukur energi secara relative jika energi tersebut ditransmisikan, direflesikan atau
diemisikan sebagai fungsi dari panjang gelombang.
Spektrofotometri merupakan salah satu metode dalam kimia analisis yang
digunakan untuk menentukan komposisi suatu sampel baik secara kuantitatif dan
kualitatif yang didasarkan pada interaksi antara materi (atom atau molekul) dengan
cahaya atau radiasi elektromagnetik (REM). Peralatan yang digunakan dalam
spektrofotometri disebut spektrofotometer.
Spektrofotometri Sinar Tampak (UV-Vis) adalah pengukuran energi cahaya oleh
suatu sistem kimia pada panjang gelombang tertentu. Sinar ultraviolet (UV)
mempunyai panjang gelombang antara 200-400 nm, dan sinar tampak (visible)
mempunyai panjang gelombang 400-750 nm. Metode pengukuran menggunakan
prinsip spektrofotometri adalah berdasarkan absorbsi cahaya pada panjang gelombang
tertentu melalui suatu larutan yang mengandung kontaminan yang akan ditentukan
konsentrasinya. Proses ini disebut absorbsi spektrofotometri, dan jika panjang
gelombang yang digunakan adalah gelombang cahaya tampak, maka disebut sebagai
kolorimetri, karena memberikan warna. Prinsip kerja dari metode ini adalah jumlah
cahaya yang di absorpsi oleh larutan sebanding konsentrasi kontaminan dalam larutan.
Spektrofotometer terdiri atas spektrometer dan fotometer. Spektrofotometer
menghasilkan sinar dari spektrum dengan panjang gelombang tertentu dan fotometer
adalah alat pengukur intensitas cahaya yang ditranmisikan atau yang diabsorpsi.
Spektrofotometer tersusun atas sumber spektrum yang kontinyu, monokromator, sel
pengabsorpsi untuk larutan sampel atau blangko dan suatu alat untuk mengukur
pebedaan absorpsi antara sampel dan blangko ataupun pembanding.
2.4.1. Prinsip Kerja dari Spektrofotometer
Prinsip kerja spektrofotometer adalah interaksi antara obat atau molekul
dengan radiasi elektromagnetik (REM) yang energinya sesuai. Interaksi tersebut
dapat membuat molekul suatu obat menghamburkan REM, menyerap REM atau
mengemisikan REM. Apabila terjadi penyerapan REM sebagai interaksi antara
molekul dengan REM, maka akan penyerapan tersebut akan diemisikan oleh
molekul tersebut. Interaksi tersebut akan meningkatkan energi potensi elektron
(eksitasi) pada tingkat aksitan (ground state). Namun, posisi molekul yang
mengalami eksitasi tersebut tidaklah stabil. Sehingga dengan cepat molekul
tersebut akan kembali ke ground state dan akan mengemisikannya. Apabila pada

molekul yang sederhana tadi hanya terjadi transisi elektronik pada suatu macam
gugus maka akan terjadi suatu absorbsi yang merupakan garis spektrum.
2.4.2. Tipe Instrumen Spektrofotometri UV-Vis
Double beam spektrofotometer : mengandung sumber cahaya UV-Visible,
cahaya UV-Visible akan melewati dua sel dan dektetor (photomultipier) untuk
mengetahui banyaknya cahaya yang melewati sel. Prinsip dari spektrofotometer
adalah absorbansi pada panjang gelombang tertentu yang diatur oleh pengguna
dan membaca pajang gelombang UV-Vis yang masuk. Double beam memiliki
variable panjang gelombang atau multiwavelength. Spektrofotometer di kontrol
dan memberikan kemampuan fleksibilitas yang baik, contoh membentuk grafik
kalibrasi untuk menentukan konsentrasi yang tidak diketahui. Kalkulasi dari
spetrofotometer UV-Vis Double beam adalah :

Keterangan I0 = cahaya yang ditransmisikan awal I = Cahya

ditransmisikan pada sampel
Single beam spektrometer UV-vis : Memiliki prinsip yang sama dengan double
beam, tetapi pertama melakukan absropsi terhadap blanko, kemudian bar
sampel yang dideteksi (Rosaleen J. Andreson dkk, 2004). Pada Single beam
berdasarkan pada sinar tunggal yang akan ditentukan jumlahnya pada satu
panjang gelombang (Hobart H. Willlard dkk, 1998).
2.4.3. Komponen Spektrofotometer UV-Vis
Sumber cahaya/ radiasi
Dua sumber radiasi yang digunakan dalam spktrofotometer yang mana
diantaranya dapat menyediakan selang panjang gelombang dari 200 - 800 nm.
Untuk pengukuran di atas 320 nm, sumber radiasi dari bahan tungsten halogen
dan pengukuran di bawah 320 nm, sumber radiasi dari bahan deuterium.
Monokromator
Digunakan untuk memperoleh sumber sinar yang monokromatis.
Alatnya dapat berupa prisma ataupun grating. Untuk mengarahkan sinar
monokromatis yang diinginkan dari hasil penguraian ini dapat digunakan celah.
Jika celah posisinya tetap, maka prisma atau gratingnya yang dirotasikan untuk
mendapatkan yang diinginkan.
Sel absorbsi.
Pada pengukuran di daerah tampak kurvet kaca atau kurvet kaca corex
dapat digunakan, tetapi untuk pengukuran pada daerah UV kita harus
menggunakan sel kuarasa karena gelas tidak tembus daerah cahaya pada daerah

ini. Umumnya tebal kurvetnya adalah 10 mm, tetapi yang lebih kecil ataupun
yang lebih besar dapat digunakan. Sel yang digunakan biasanya berbentuk
persegi, tetapi bentuk silinder dapat juga digunakan.
Detektor
Peranan detector penerima adalah memberikan respon terhadap cahaya
pada berbagai panjang gelombang. Pada spektrofotometer, tabung pengganda
electron yang digunakan prinsip kerjanya telah diuraikan. Setiap detector
menyerap tenaga foton yang mengenainya dan mengubah tenaga tersebut untuk
dapat diukur secara kuantitatif seperti sebagai arus listrik atau perubahanperubahan panas. Kebanyakan detector menghasilkan sinyal listrik yang dapat
mengaktifkan meter atau pencatat. Setiap pencatat harus menghasilkan sinyal
yang secara kuantitatif berkaitan dengan tenaga cahaya yang mengenainya.
Hasil Keluaran
Dalam instrumen manual diperoleh hasil keluaran secara tetap dari
beberapa bentuk yang mana menunjukan transmitansi secara langsung atau
dugunakan sebagai penunjuk nol dalam sirkuit potensiometri. Potensiometri
biasanya dikalibrasi dalam satuan transmitansi dan dalam satuan absorbansi.
Instrumen modern lebih digunakan karena mempunyai hubungan keluaran
digital pada mikroprosesor yang memberikan nilai absorbansi secara langsung
atau dapat dikalibrasi dalam satuan konsentrasi setelah larutan standar diukur

Gambar 1. Komponen Alat Spektrofotometer Uv-Vis

2.4.4. Hukum Lambert-Beer
Jika intensitas cahaya Io pada panjang gelombang tertentu dilewatkan
melalui larutan yang mengandung bahan yang mengabsorpsi cahaya dapat
diukur

dengan

detektor. Hukum

Lambert

Beer

digunakan

untuk

menggambarkan absorpsi cahaya pada panjang gelombang tertentu yang

diberikan oleh absorpsi spesi dalam larutan :

Keterangan :
A
= absorbansi

= absorptivitas molar (L mol -1 cm -1 )

1
= panjang laluan sinar melalui larutan (cm)
c
= adalah konsentrasi spesi (molal)

Daftar Pustaka
Ditjen POM, (1995), Farmakope Indonesia, Edisi IV, Depkes RI. Jakarta
Gandjar I.G, dan Rohman A. 2007. Kimia Farmasi Analisis. PustakaPelajar : Yogyakarta.
Katzung, 1989, Basic and Clinical Pharmacology, diterjemahkan oleh Binawati, H.K., Budi,
I., Christianto, S., Hermawan, S., Yurita, H.H., Gunadi, B., Petrus, A., edisi 3, 3,
Penerbit Buku Kedokteran EGC, Jakarta
Hart, H. 2003. Kimia Organik. Erlangga : Jakarta.
Montgomery et al., 1992, BioChemistry: A Case Oriented Approach, Alih bahasa Staff
Pengajar FKUI. Edisi V, Jilid I, 80-91, Binarupa Aksara, Jakarta
Mulja, M., Hanwar , D., 2003, Prinsip-Prinsip Cara Laboratorium yang Baik, Majalah
Farmasi Airlangga, Volume VI, 73, Airlangga University Press, Surabaya
Mutschler, E. 1991. Dinamika Obat : Buku Ajar Farmakologi dan Toksikologi, ITB :
Bandung.
Rang et al., 2003, Pharmacology, 5th Ed., Chorchill Livingstone, Ednburg, London, New
York, Oxford, Philadelphia, St Louis, Sydney, Toronto
Ritschel, W. A., 1976, Handbook of Basic Pharmacokinetics, 1st ed. Drug Intelegence
Publication Inc. Hamilton, USA
Roth, H.J., Blaschke, 1981, Pharmaceutical Analysis, diterjemahkan oleh sarjoko Kisman
dan Slamet Ibrahim, 359-361, Gadjah Mada University Press, Yogyakarta Shargel, L.
dan A. B. C. Yu. 2005. Biofarmasetika dan Farmakokinetika Terapan. Edisi Kedua.
Surabaya : Airlangga University Press.
Skoog, A., D., West, M., Donald, J., F., 1994, Analytical Chemistiy, 6rh ed, Saunde College
Publishing, United Stated of America.

Smith, R. & Steavary, 1981, Textbook of Biopharmaceutics Analysis A Description of

Methods for The Determination of Drug in Biological Fluid, Les & Febiger,
Philadelphia
Stalcup et al., 1995, Medwork: Anatomy and Physiology, Victory Technology Inc.
Syukri Y. 2002. Biofarmasetika. Yogyakarta: UI-Press
Wilmana, P.F., 1995, Analgesik-Antipiretik, Analgesik Anti-Inflamasi Nonsteroid dan Obat
Pirai, dalam Ganiswara, S.G., Farmakologi dan Terapi, Edisi IV.Bagian Farmakologi
Fakultas Kedokteran-Universitas Indonesia, Jakarta