I. TUJUAN
I.1 Praktikum ini bertujuan untuk melakukan transformasi pada sel
E.coli .
II. PRINSIP
II.1 Pembuatan sel kompeten yang dapat disisipi vektor DNA
rekombinan.E.Coli dibiakkan dalam suspensi media,pada saat mid-
log phase diambil dengan cara sentrifugasi dan inkubasi dalam es
dengan penambahan larutan CaCl2 dingin.
II.2 Transformasi E.Coli dengan plasmid rekombinan ditambahkan
ke dalam sel kompeten disertai dengan kontrol.Campuran sel
kompeten dan DNA plasmid diinkubasi dalam es kemudian diberi
kejut panas (heat-shock) pada suhu 42C dam selanjutnya diinkubasi
pada suhu 37C.
II.3 Seleksi koloni E.Coli yang telah disisipi DNA plasmid
rekombinan dengan menggunakan cawan LB/Amp/X-Gal/IPTG.
III. TEORI
Dalam perkembangannya, istilah transformasi telah
didefinisikan secara lebih luas lagi yaitu pengambilan molekul DNA
oleh setiap jenis sel tanpa memandang apakah pengambilan molekul
DNA tersebut menyebabkan adanya perubahan dalam sel yangdapat
dideteksi atau tidak dan objek dari transformasi ini tidak terbatas pada
bakteri saja,tetapi termasuk juga fungi, hewan, dan tumbuhan.
Transformasi merupakan teknik transfer molekul DNA ke dalam sel
inang bakteri misalnya bakteri E.coli. Fenotif Strain E. coli hasil
transforman akan berubah karena mendapatkan gen-gen penyandi baru
yang dibawa oleh molekul DNA tersebut. Molekul DNA ini biasanya
dikemas dalam suatu vektor, misalnya plasmid. Pemasukkan molekul
DNA rekombinan ke dalam sel inang disebut transformasi apabila
vektor yang digunakan berupa plasmid. Peristiwa ini disebut
transformasi karena plasmid dapat mengubah sifat sel inang.
Keberhasilan plasmid masuk dan bertahan di dalam sel umumnya
dideteksi berdasarkan ekspresi gen marka yang dibawa oleh plasmid
tersebut(Brown, 1991).
Transformasi memiliki arti penting dan sangat berguna dalam
penelitian penelitian genetik bakteri di laboratorium terutama bagi
pemetaan kromosom bakteri. Hal ini terjadi karena frekuensi terjadinya
transformasi antara dua gen pada waktu yang samamerupakan petunjuk
jarak antara gen gen ini pada kromosom. Plasmid adalah molekul
DNA sirkuler berukuran relatif kecil di luar kromosom yang terdapat di
dalam sel prokariot, khususnya bakteri. Gen-gen yang terdapat di dalam
plasmid pada umumnya tidak esensial bagi pertumbuhan dan
kelangsungan hidup individu bakteri, tetapi sering kali menyandi
sintesis protein untuk resistensi terhadap antibiotik. Dalam rekayasa
genetika plasmid sering digunakan sebagai vektor untuk membawa gen-
gen tertentu yang diinginkan ke dalam suatu sel inang. Gen-gen tersebut
selanjutnya akan mengekspresikan produk komersial tertentu seperti
insulin, interferon, dan berbagai enzim(Pelczar dan Chan, 1986).
Transformasi merupakan teknik transfer molekul DNA ke dalam
sel inang bakteri misalnya bakteri E.coli. Fenotif Strain E. coli hasil
transforman akan berubah karena mendapatkan gen-gen penyandi baru
yang dibawa oleh molekul DNA tersebut. Molekul DNA ini biasanya
dikemas dalam suatu vektor, misalnya plasmid. Proses transformasi
merupakan proses yang tidak efisien walaupun sel telah dibuat
kompeten. Bagian sel yang berhasil menyerap DNA plasmid sangat
rendah, sehingga diperlukan metode untuk membedakan antara sel
transforman dan sel nontransforman. Sel transforman adalah sel yang
berhasil menyerap DNA plasmid, sedangkan sel nontransforman adalah
sel yang tidak membawa DNA plasmid. Seleksi transforman umumnya
berdasarkan adanya marka seleksi 18 yang disisipkan pada plasmid.
Marka seleksi merupakan gen yang memberi karakterisrik baru pada sel
transforman yang tidak dimiliki oleh sel bukan transforman. Sel inang
yang telah mengandung DNA rekombinan dibiakkan dalam medium
padat, sehingga membentuk koloni. Koloni yang terbentuk merupakan
sekumpulan sel yang identik karena hasil pembiakan sebuah sel. Koloni
yang dapat tumbuh pada media seleksi ini adalah koloni yang berasal
dari bakteri transforman saja ( Wibowo, 2002).
Tahap berikutnya dalam eksperimen pengklonan gen setelah
molekul DNA rekombinan berhasil dikonstruksi adalah memasukkan
molekul DNA rekombinan tersebut ke dalam sel hidup yang disebut sel
inang. Sel inang yang paling umum digunakan adalah Escherichia coli.
Tidak semua sel secara alami memiliki kemampuan untuk menyerap
DNA asing. Setiap sel memiliki efisiensi yang berbeda dalam menyerap
molekul DNA. Beberapa spesies yang dapat menyerap DNA secara
efisien adalah Bacillus dan Streptococcus. Sel yang tergolong tidak
efisien dalam menyerap DNA adalah Escherichia coli. Sel ini memiliki
kemampuan alami menyerap DNA asing yang rendah. Sel E. coli secara
alami memiliki kemampuan transformasi yang rendah. Peningkatan
kemampuan transformasi secara alami dilakukan dengan memanen sel
pada fase stasioner dan penumbuhan kembali pada media. Sel yang
kompeten diperoleh pada fase lag dan menghilang pada fase log
(eksponensial). Laju transformasi meningkat seiring dengan jumlah
plasmid hingga mencapai fase plateau. Sel E.coli yang kompeten diberi
perlakuan kejut panas untuk membuka pori pada dinding sel bakteri.
Inkubasi dengan plasmid akan menyebabkan masuknya plasmid ke
dalam sel. Penambahan media LB setelah perlakuan kejut panas
berfungsi untuk memenuhi kebutuhan nutrisi dari bakteri setelah
mengalami perlakuan yang ekstrem(Tsen,2002).
Salah satu cara untuk menyeleksi klon yang benar adalah dengan
menggunakan media tumbuh yang mengandung antibiotik.Cairan
suspensi dalam pekerjaan transformasi (campuran antara
bakteri,plasmid,dan DNA asing yang telah di perlukan dalam rangka
trasformasi) di sedarkan pada media yang mengandung tetasiklin.
Koloni bakteri yang tumbuh adalah koloni sel 1 dan koloni sel 2 (koloni
adalah kumpulan sel yang sama yang semula berasal dari satu sel). Sel
bakteri yang tidak mengandung plasmid tidak mampu tumbuh. Masing-
masing koloni yang tumbuh pada media + tetrasklin kemudian di
pindahkan pada media + ampisilin. Koloni yang tidak tumbuh pada
media + ampisilin adalah koloni yang di inginkan (sel-sel bakterinya
mengandung plasmid rekombinasi). Bakteri ditumbuhkan pada medium
yang mengandung ampisilin. Dengan adanya ampisilin, maka sel E. coli
yang dapat tumbuh hanya sel transforman atau sel yang telah
memasukkan plasmid(Wibowo, 2002).
DNA rekombinan (rDNA) adalah bentuk DNA buatan yang
dibuat dengan menggabungkan dua atau lebih sekuens yang tidak akan
biasanya terjadi bersama-sama.Dalam hal modifikasi genetik, itu adalah
diciptakan melalui pengenalan DNA yang relevan ke dalam DNA
organisme yang ada, seperti plasmid bakteri, untuk kode untuk atau
mengubah sifat berbeda untuk tujuan tertentu, seperti resistensi
antibiotik.Ini berbeda dari rekombinasi genetika dalam hal itu tidak
terjadi melalui proses alam dalam sel, tetapi direkayasa.Sebuah protein
rekombinan adalah protein yang berasal dari DNA rekombina(Pelcza,
1986).
Teknologi DNA Rekombinan telah memberikan banyak manfaat
bagi perkembangan ilmu pengetahuan maupun bagi kehidupam manusia
sehari-hari. Beberapa jenis obat-obatan, vaksin, bahan pangan, bahan
pakaian dan lainnya telah diproduksi dengan memanfaatkan teknologi
DNA Rekombinan.Dalam kehidupan kita sehari-hari, secara langsung
maupun tidak langsung, sebagian dari kita pernah berhubungan dengan
hasil penggunaan teknologi DNA Rekombinan. Contoh: insulin telah
digunakan untuk mengobati penyakit diabetes. Penyakit diabetes pada
manusia diobati dengan insulin manusia.Saat ini insulin manusia telah
berhasil diproduksi secara masal dengan menggunakan bakteri.
Kemampuan bakteri untuk memproduksi insulin manusia ini adalah
karena manusia telah berhasil memasukkan dan mengintegrasikan gen
yang menyandikan insulin manusia kedalam genom bakteri(Wibowo,
2002).
pCAMBIA vektor backbone berasal dari vektor pPZP (dibangun
oleh Hajdukiewicz, Svab& Maliga, lihat References21). Sementara
keterbatasan teknis dan IP tidak sempurna dan memiliki (lihat BioForge
GUSPlus Project 22, di mana kita meningkatkan gen reporter dan
metode seleksi untuk lebih lengkap kebebasan untuk beroperasi), vektor
pCAMBIA menawarkan:
jumlah salinan tinggi dalam E.coli untuk hasil DNA tinggi
pVS1 replicon untuk stabilitas tinggi dalam Agrobacterium
ukuran kecil, 7-12kb tergantung pada plasmid
situs restriksi dirancang untuk modifikasi plasmid modular dan
kecil tapi memadai poli-linker untuk memperkenalkan DNA
Anda minati
Pilihan bakteri dengan kloramfenikol atau kanamisin
Pilihan tanaman dengan higromisin B atau kanamisin (seleksi
fosfinotrisin dihentikan di permintaan pemilik IP, Bayer, setelah
distribusi awal tahun 1997)
cara sederhana untuk membangun fusi translasi gen reporter
gusA.
Gambar 1: pCAMBIA
IV. PROSEDUR
Dalam percobaan ini strain E.coli Top 10 yang dikulturkan semalaman
ke media LB cair 25 ml dengan cara memindahkan satu koloni strain
E.coli Top 10 ke media LB cair. Kemudian diinkubasi di dalam shaker-
incubator dengan kecepatan rotasi 125rpm pada suhu 37C selama 16
jam(semalaman).Setelah itu Hasil inkubasi semalaman dipindahkan ke
media LB cair 25ml, dilakukan dengan cara mengambil 250l kultur
E.coli Top 10 ke dalam media LB cair 25 ml, atau dikatakan
perbandingan anatara volume media dan volume kultur 10:1.Kemudian
kultur tersebut diinkubasi dalam shaker incubator dengan kecepatan
rotasi 125 rpm selama 120 menit yaitu selama 2 jam pada suhu 37C.
Setelah sebanyak 1,5 ml kultur diinkubasi selama 2 jam, kultur tersebut
diambil dan dimasukkan ke dalam tadung sentrifuga dan dengan
kecepatan 5.700 x g dilakukan sentrigfigasi selama 5 menit. Setelah
disentrifugasi supernatan yang terhasil dibuang dan ditambahkan 500l
CaCl2 yang dingin,diresuspensi kemudian disentrifugasi pada kecepatan
5.700 x g selama 5 menit. Supernatan dibuang kembali dan
ditambahkan kembali 200 l CaCl2dingin ke dalam tabung, diresuspensi
dan diinkubasi dalam es. Dalam perlakuan ini terdapat lima tabung
mikrosentrifuga, dua diantaranya diinkubasi 2 jam dan 3 lainnya untuk
diinkubasi 16 jam. Tabung mikrosentrifuga hasil inkubasi 2 jam yang
masing-masing berisi 200 l selkompeten, salah satunya atau tabung
nomor 1 ditambah dengan 10 l palsmid pUC19sirkuler, sedangkan
tabung nomor 2 tidak ditambah dengan plasmid. Kedua tabung
diinkubasi lebih lanjut dalam es selama 20 menit, kemudian diberi kejut
panas (heat-shock) selama 90 detik dengan suhu 42C dan segera
dipindahkan ke dalam es dan diinkubasi kembali selama 10 menit.
Tabung mikrosentrifuga ditambahkan media LB hingga 1 ml setelah
diinkubasi 10menit, dilanjutkan dengan inkubasi dalam shaker-
incubator pada suhu 37C dengan kecepatan rotasi 150 rpm selama 1,5
jam. Sebanyak 100 l hasil inkubasi ditumbuhkan dengan cara plating
ke media cawan LB/Amp untuk kedua tabung. Selain itu, sebanyak 50
l hasil inkubasi pada tabung nomor 2 ditumbuhkan juga pada media
LB tanpa ampisilin. Diinkubasiksn selama 16 jam pada suhu 37C.
Sementara itu, ke dalam tabung mikrosentrifuga hasil inkubasi 16 jam
yang masing-masing berisi 200 l sel kompeten, ditambahkan 10 l
vektor pUC19 sirkuler untuk penentuan efisiensi transformasi (tabung
nomor 3), 2 l vektor pUC19 rekombinan(tabung nomor 4) dan tidak
ditambahkan apapun (tabung nomor 5). Ketiga tabung mikrosentrifuga
diinkubasi lebih lanjut dalam es selama 20 menit dan diberi kejut panas
(heat-shock) selama 90 detik pada suhu 42C dan segera dipindahkan ke
es untuk diinkubasi kembali selama 10 menit. Tabung mikrosentrifuga
selanjutnya ditambahkan dengan media LB hingga 1 ml,dilanjutkan
dengan inkubasi dalam shaker-incubator selama 1,5 jam pada suhu
37C. Disiapkan media cawan LB/Amp/X-Gal/IPTG dengan cara
menambahkan 50 l X-Gal dan 100 l IPTG ke media cawan LB/Amp,
lalu diinkubasi pada suhu 37Cselama lebih kurang 30 menit. Hasil
inkubasi tabung nomor 3 ditumbuhkan dengan cara plating ke media
cawanLB/Amp/X-Gal/IPTG sebanyak 100 l. Tabung nomor 4
disentrifugasi dengan kecepatan 5.700 x g selama 5 menit.Supernatan
dibuang hingga tersisa 100 l, dan kemudian ditumbuhkan dengan cara
plating ke media LB/Amp/X-Gal/IPTG.Hasil inkubasi pada tabung no.5
ditumbuhkan dengan cara plating ke media cawanLB/Amp sebanyak
100 l dan ke media cawan LB sebanyak 50 l, dilanjutkan dengan
inkubasi selama 16 jam pada suhu 37C. Dilakukan penjumlahan untuk
cawan yang berisi E. coli dengan pUC19 sirkuler koloni untuk diketahui
efisiensi transformasinya.Efisiensi transformasi dihitung dengan cara
sebagai berikut, Dimana,koloni= jumlah koloni putih (dalam cfu)
[pUC19] = konsentrasi pUC19 (dalam ng).
V.2 Bunsen
V.3 Inkubator
V.4 Lemari es
V.6 Mikrosentrifuga
V.7 Pengocok orbital
Bahan
5.1 Aquabides
5.2 Etanol 95%
5.3 GeneJET plasmid minprep kit (fermentas life sciences):
Resuspension solution, Lysis solution, Neutralization solutiom,
Wash solution, RNase A, Elution Buffer (10mM Tris-HCL, pH
8.5), GeneJET Spin Colums dan tabung kolektor 2mL
5.4 Kloramfenikol/ kanamisin 100 g/mL dalam medium LB cair
5.5 Medium lurea bertani (LB) cair (Biogen)
5.6 Plat biakan bakteri E.coli Top 10 berumur 18-24jam
5.7 pCambia 1201
Kontrol
1.
(+)
Kontrol
2.
(-)
(Ada
3.
pChambia
1201)
(Tanpa
4.
pChambia
1201)
VII. PEMBAHASAN
Perbedaan antara kedua vector tersebut adalah size. Gus A merupakan reporter
gene untuk kedua-dua vektor tersebut. Fungsi kedua vektor adalah untuk
meningkatkan produksi E.coli . Basa pasang kedua vektor berbeda. pCAMBIA
2201 dan pCAMBIA 1201 terdiri dari Gus intro selection vectors pCAMBIA.
Gambar 2: Struktur pCAMBIA
Dari hasil pengamatan menunjukkan bahwa cawan petri yang dibuat
kontrol positif yang telah digores dengan E.Coli terdapat pertumbuhan
manakala kontrol negatif yang hanya mengandungi LB agar tidak terdapat
pertumbuhan mikroorganisme. Manakala cawan petri A yang mengandungi
pCAMBIA dan diletakkan antibiotik kloramfenikol didapati tidak ada
pertumbuhan.Cawan petri B yang tanpa pCambia tapi tapi mengandungi
kloramfenikol juga tidak mengandungi pertumbuhan mikroorganisme.
VIII. KESIMPULAN
Dari hasil percobaan kali ini cawan petri yang dibuat kontrol positif
yang telah digores dengan E.Coli terdapat pertumbuhan manakala kontrol
negatif yang hanya mengandungi LB agar tidak terdapat pertumbuhan
mikroorganisme. Manakala cawan petri A yang mengandungi pCAMBIA dan
diletakkan antibiotik kloramfenikol didapati tidak ada pertumbuhan. Cawan
petri B yang tanpa pCambia tapi tapi mengandungi kloramfenikol juga tidak
mengandungi pertumbuhan mikroorganisme. Daripada percobaan ini
sepatutnya cawan petri A akan terdapat pertumbuhan koloni ini kerana hal ini
dikarenakan bahwa E.coli tersebut mengandung gen resisten kloramfenikol
yang di transformasi dari pCAMBIA yang mengandung gen resisten
kloramfenikol. Kesalahan yang mungkin dilakukan oleh kami yang
memungkinkan mempengaruhi result dimungkinkan kloramfenikol telah rusak
karena kepanasan, atau mungkin disebabkan karena dalam berkerja kurang
aseptis atau kurang steril.
IX. LAMPIRAN
DAFTAR PUSTAKA
Pelczar, M.J. dan E.C.S. Chan, 1986. Dasar _ Dasar Mikrobiologi Jilid I.
Universitas Indonesia. Jakarta.