Sekresi suatu protein oleh suatu organisme merupakan proses yang melalui beberapa tahapan,

diantaranya yaitu translokasi protein. Translokasi protein ke lumen retikulum endoplasma (RE)
merupakan salah satu tahapan yang penting dalam jalur sekresi protein, khususnya pada
organisme eukariot. Translokasi suatu protein melewati membran lipid seperti RE secara umum
diarahkan oleh peptida sinyal yang terdapat pada ujung N-terminal protein, yang kemudian
dipotong oleh suatu enzim saat sintesis protein sedang berlangsung atau setelah sintesis protein
selesai. Struktur primer peptida sinyal setiap protein jarang sekali sama, namun pada umumnya
terdiri dari beberapa bagian yaitu : N-terminal yang bermuatan positif, daerah pusat hidrofobik,
dan sisi pemotongan yang dapat dikenali oleh enzim signal peptidase. Hidrofobisitas peptida
sinyal diduga memainkan peran penting dalam translokasi protein dengan cara berinteraksi
dengan membran lipid atau dengan beberapa komponen sel lainnya (Yamamoto et al., 1987).
Gnter Blobel adalah peneliti yang meraih Hadiah Nobel pada tahun 1999 karena penemuannya
yang impresif yang membuktikan fungsi peptida sinyal dalam translokasi protein dalam
organisme eukariotik.

Proses translokasi protein dari ribosom ke lumen RE yang diarahkan oleh peptide sinyal dibantu
oleh suatu partikel pengenal peptida sinyal yang disebut Signal Recognition Particles (SRP.
Gambar diatas adalah mekanisme translokasi protein dalam organisme eukariotik. Hidrofobisitas
peptida sinyal diduga memainkan peran dalam interaksi peptida sinyal dengan SRP. Jika peptida
sinyal cukup hidrofobik tetapi tidak terlalu panjang, peptida sinyal dapat dikenali oleh SRP
ketika peptida sinyal baru disintesis dan keluar dari ribosom (Egea et al., 2005). SRP yang
mengikat peptida sinyal kemudian akan dikenali oleh reseptor-SRP (SR) yang terdapat pada
membran RE. Jadi SRP dan SR berperan dalam memediasi proses pentargetan ko-translasi dari
protein membran dan protein sekresi pada semua jenis sel. Baik SRP maupun SR keduanya
memiliki domain untuk mengikat Guanosine Tri Phosphate (GTP). Kompleks SRPSR yang
berinteraksi dengan adanya GTP berperan dalam mentargetkan Ribosome-Nascent Chain
complex (RNC) ke aparatus translokasi protein yang terdapat dipermukaan membran yang
disebut translokon. Sehingga SRP dan SR berperan sebagai molekul match-makers yang
mengantarkan RNC yang mensintesis protein tertentu ke translokon (Egea et al., 2005).
Produksi protein heterolog sudah banyak dilakukan dengan teknologi rekombinan baik itu pada
organisme prokariot maupun eukariot. Protein dapat disekresikan ke medium ekstraselular
dengan cara memilih peptida sinyal yang tepat. Banyak jenis sinyal-sinyal yang telah digunakan
dalam sistem ekspresi ragi, seperti peptida sinyal yang berasal dari gen PHO1, yeast invertase,
sinyal sekresi alfa-mating factor, dan lain-lain. Masing masing sinyal memiliki keunggulan
tersendiri dan tidak ada aturan khusus untuk menentukan urutan sinyal yang efektif. Diantara
peptida sinyal yang paling umum digunakan adalah peptida sinyal protein alfa-mating factor dari
S. cerevisiae (Cereghino and Cregg, 2000). Gambar 2 menunjukkan jalur sekresi protein dalam
S. cerevisiae dengan menggunakan peptida sinyal alfa-mating factor (AMF). Peptida sinyal AMF
cukup efektif dalam mensekresikan protein keluar sel.
Efisiensi dan efektifitas translokasi protein tidak dapat dilepaskan dari karakteristik peptida
sinyal protein tersebut. Menurut Shi-Hwei et al., 2004, beberapa masalah yang sangat potensial
dalam sekresi protein, termasuk dalam organisme eukariot adalah : (1) jenis penggunaan kodon
dari gen yang diekspresikan, (2) jumlah gen yang digunakan, (3) efisiensi dan kekuatan
promotor, (4) efisiensi sinyal translasi, (5) jenis peptida sinyal, (6) proses dan pelipatan di dalam
retikulum endoplasma dan badan golgi, (7) faktor lingkungan dalam sekresi ekstraseluler, dan (8)
hidrolisis protein oleh protease. Semakin banyak protein yang ditranslokasikan ke lumen
retikulum endoplasma, maka jumlah protein yang akan disekresikan pun akan bertambah.
Sehingga peran peptida sinyal dalam translokasi protein cukup menjadi perhatian.

Peptida SinyalElemen yang paling penting pada jalur translokasi protein adalah suatu urutan
asam amino yang disebut peptida sinyal, yang fungsinya dijelaskan pertama kali oleh Gnter
Blobel dan rekan-rekannya pada tahun 1970. Peptida sinyal adalah peptida rantai pendek yang
terdiri dari 18 30 asam amino yang perperan dalam mengarahkan protein-protein ke lumen RE.
Pada kebanyakan protein, peptida sinyal akan dihidrolisis pada ujung N-terminal protein saat
sintesis protein sedang berlangsung atau setelah sintesis protein selesai (Nelson and Cox, 2000).

Peptida sinyal biasa disebut juga sinyal pentarget (targeting signal), urutan sinyal (signal
sequences), transit, peptida-peptida (peptidas), atau sinyal lokalisasi (localization signal). Urutan
asam amino peptida sinyal mengarahkan protein (yang disintesis di dalam sitosol) ke organel-
organel dalam sel seperti inti sel, matrik mitokondria, retikulum endoplasma, kloroplast,
apoplast, dan peroksisom. Beberapa sinyal peptida adalah hasil pemecahan protein oleh signal
peptidase setelah protein ditransportkan ke organel-organel sel (Koolman and Roehm, 2005).

Pemilihan peptida sinyal yang tepat untuk sekresi protein heterolog telah dibuktikan oleh
Treerattrakool et al., 2002, yang mengekspresikan gen pengode CHH/MIH/GIH (PemCMG),
yang merupakan peptida yang berperan penting dalam reproduksi dan pertumbuhan pada
Paneaus monodon, dalam P. pastoris. Treerattrakool et al., 2002, menggunakan dua jenis peptida
sinyal yaitu peptida sinyal natif dan peptida sinyal -mating factor (AMF). PemCMG dengan
peptida sinyal natif tidak disekresikan, meskipun analisis dengan menggunakan metode dot-
blotting dengan menggunakan antibodi anti-CMG menunjukkan bahwa PemCMG
diekspresikan oleh P. pastoris. Namun gagal disekresikan ke medium kultur. Sedangkan
PemCMG dengan peptida sinyal AMF berhasil disekresikan ke medium kultur sebanyak 150
mg/L (Treerattrakool et al., 2002). Hal ini dapat disebabkan karena peptida sinyal natif
PemCMG tidak dikenali oleh SRP pada proses translokasi dan tidak diproses pada jalur sekresi
ragi, tidak seperti sinyal sekresi AMF S. cereviseae.

Hidrofobisitas peptida sinyal pun menjadi salah satu faktor yang dapat mempengaruhi efisiensi
sekresi protein heterolog dalam sistem ekspresi ragi. Namun hidrofobisitas peptida sinyal pun
memiliki batasan. Yamamoto et al., 1987, melakukan variasi panjang daerah hidrofobik pada
peptida sinyal lisozim manusia. Selain itu Yamamoto et al., mengganti asam amino yang
hidrofilik seperti Cistein dengan asam amino yang lebih hidrofobik yaitu Leusin. Ternyata
tingkat sekresi lisozim manusia dengan peptida sinyal yang memiliki 10 residu leusin meningkat
1,6 kali dari sekresi lisozim manusia dengan peptida sinyal natif. Namun peptida sinyal dengan
14 residu leusin justru sekresi lisozim manusia menjadi sangat rendah yaitu hanya 0,1 mg/L.
Lebih rendah dibandingkan dengan sekresi dengan peptida sinya natif. Kemungkinan peptida
sinyal dengan 14 residu leusin terlalu panjang sehingga kurang disukai untuk berinteraksi dengan
signal peptidase dan laju prosesnya lambat. Lisozim yang belum matang (mature), akhirnya
banyak menumpuk atau terakumulasi dalam sel. Panjang hidrofobisitas yang paling baik adalah
dengan 8 atau 10 residu leusin.

Menurut Heijne, 1985, variasi daerah hidrofobik (h-region) pada peptida sinyal (~8 hingga ~20
residu asam amino hidrofobik) panjangnya adalah sekitar 25 sampai 30 ditengah-tengah
interior non-polar pada membran yang strukturnya sebagian membentuk konformasi -heliks,
sebagiannya memanjang tergantung pada panjang daerah hidrofobik. Konformasi heliks secara
termodinamik lebih disukai dalam lingkungan non-polar, daerah hidrofobik dengan panjang yang
sedang dapat menjangkau membran dengan sebagian membentuk konformasi alfa dan sebagian
mambentuk rantai panjang.

Peptida sinyal dapat dimodifikasi untuk meningkatkan sekresi protein heterolog dalam
organisme eukariot. Shi-Hwei et al., 2004 melakukan modifikasi peptida sinyal untuk
meningkatkan tingkat sekresi enzim Glukoamilase. Glukoamilase (GA) dari R. oryzae
diproduksi oleh Shi-Hwei et al., 2004, dalam P. pastoris dengan menggunakan dua jenis plasmid
ekspresi yang dirancang sebelumnya. Satu gen pengode GA memiliki peptida sinyal wild type
(Wild Type Signal Peptide, WTSP) dengan urutan 25 asam amino yang terdapat pada ujung-N
(N-terminus). Gen pengode GA yang lainnya memiliki ujung-N dengan peptida sinyal yang
dimodifikasi (Modified Signal Peptide, MSP) yang mengandung 15 asam amino dari peptida
sinyal alfa-amilase saliva mencit yang diikuti dengan 70 asam amino peptida sinyal pro-region
alpha-mating factor (AMF) Saccharomyces cerevisiae. Selain itu ditambah dengan penggantian
residu asam amino kedelapan, yaitu Serin (Ser) yang diganti dengan Leusin (Leu) atau S8L pada
MSP. Kedua plasmid ekspresi pPICZA-WTSPGA dan pPICZA-MSPGA, masing-masing
ditransformasikan ke P. pastoris GS115 dengan rekombinasi homologi pada lokus promotor
AOX1 dalam kromosom. DNA genom kemudian diisolasi dari setiap transforman dan dipotong
dengan enzim restriksi EcoRI, dan dikarakterisasi dengan elektroforesis agarosa.

Modifikasi peptida sinyal mudah untuk dilakukan dan cukup efektif dalam meningkatkan sekresi
protein. Selain berperan penting dalam translokasi protein, hidrofobisitas peptida sinyal pun
menjadi salah satu faktor yang dapat mempengaruhi tingkat sekresi protein heterolog dalam
sistem ekspresi ragi. Hal ini telah dibuktikan dengan meningkatnya sekresi GA R. oryzae dengan
peptida sinyal termodifikasi yang meningkat sampai 3,6 kali dibandingkan dengan sekresi GA R.
oryzae dengan peptida sinyal natif dalam P. pastoris.