LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA

PERCOBAAN XI
ISOLASI DNA DAN ELEKTROFORESIS GEL AGAROSA

OLEH :

NAMA : NIRMALA SARI

NIM : O1A114098

KELAS : D

KELOMPOK : V (LIMA)

ASISTEN : NUR AIN RAJIANI, S.Si

JURUSAN FARMASI

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS HALU OLEO

KENDARI

2016
 PERCOBAAN XI
ISOLASI DNA DAN ELEKTROFORESIS GEL AGAROSA

A. TUJUAN
Tujuan dari percobaan ini yaitu :
1. Untuk mengetahui metode umum mengisolasi DNA
2. Untuk mengisolasi DNA dari buah

B. LANDASAN TEORI
Asam deoksiribonukleat (DNA) memiliki sejumlah karakteristik yang
memungkinkan seseorang untuk meniru kegiatan logis tradisional . DNA
lebih suka dalam bentuk beruntai ganda, urutan DNA beruntai tunggal alami
bermigrasi ke arah urutan komplementer untuk membentuk untai ganda
kompleks. Urutan komplementer memasangkan basis adenin (A) dengan
timin (T) dan sitosin (C) dengan guanin (G) (Gearheart dkk., 2012).
Isolasi DNA adalah salah satu teknik dasar yang harus dikuasai dalam
mempelajari teknik biologi molekuler. Tujuan dari ekstraksi atau isolasi DNA
adalah memisahkan DNA (asam nukleat) dan membuangnya dari komponen
sel lainnya seperti protein, karbohidrat dan lemak sehingga DNA yang
diperoleh dapat dianalisis dan dimodifikasi lebih lanjut dengan teknik biologi
molekuler (Putri dan I Ketut, 2015).
Kerusakan DNA yang disebabkan oleh radiasi ultraviolet dan pengion
dan spesies kimia reaktif, baik endogen dan eksogen, diyakini penyebab
utama mutasi dan induksi kanker. Mengukur kerusakan tersebut dan
kemampuan sel untuk memperbaiki mereka sangat penting untuk memahami
proses dasar dalam biologi kanker dan berkembang protokol untuk membatasi
eksposur untuk individu dan berbagai populasi manusia. Banyak jenis
kerusakan DNA yang efisien diperbaiki oleh salah eksisi dasar atau
nukleotida jalur perbaikan eksisi, yang menggunakan pelengkap urutan
berlawanan untai dari DNA rangkap untuk mengembalikan daerah yang rusak
dan daerah yang berdampingan untai yang rusak (Fillippova dkk., 2003).
 Gel elektroforesis adalah suatu teknik yang menggunakn medan listrik
untuk memisahkan molekul berdasarkan ukuran, di dalam karena mengandug
gugus fosfat yang bermuatan negatif, di dalam medan listrik DNA akan
bergerak menuju elektroda positif. Molekul yang lebih pendek bermigrasi
lebih cepat melalui pori-pori gel daripada molekul yang lebih panjang,
sehingga pemisahan didasarkan pada panjang. Gel yang tersusun dari
poliakrilamid dapat memisahkan molekul-molekul DNA yang perbedaan
panjangnya hanya satu nukleotida dan digunakan untuk menentukan urutan
basa DNA. Gel agarosa digunakan untuk memisahkan pita DNA pada gel
dapat dilihat dengan berbagai teknik. Pemberian zat warna misalnya etidium
bromida memungkinkan visualisasi langsung semua pita DNA dibawah sinar
ultra violet. Urutan spesifik biasanya dideteksi dengan probe berlabel (Marks
dkk., 2000).
Teknik elektroforesis dapat digunakan untuk analisis DNA, RNA,
maupun protein. Elektroforesis DNA dilakukan misalnya untuk menganalisis
fragmen-fragmen DNA hasil pemotongan dengan enzim retriksi. Fragmen
molekul DNA yang telah dipotong-potong dapat ditentukan ukurannya
dengan cara membuat gel agarosa, yaitu suatu bahan semi berupa polisakarida
yang diekstraksi dari rumput laut. Gel agarosa dibuat dengan melarutkannya
dalam suatu buffer. Agar dapat larut dengan baik, pelarutannya dibantu
dengan pemanasan, misalnya menggunakan oven gelombang mikro
(mikrowave oven). Dalam keadaan pans, gel akan berpa cairan sehingga
mudah dituang ke atas suhu lempeng (plate) yang biasanya terbuat dari
persex. Sebelum mendingin dan memadat, pada ujung gel tersebut dibuat
lubang-lubang dengan menggunakan lembaran perspex tipis yang dibentuk
menyerupai sisir. Sisir tersebut ditancapkan pada salah satu ujung gel yang
masih cair. Dengan demikian, pada waktu gel memadat dan sisirnya diambil
terbentuklah lubang-lubang kecil. Ke dalam lubang-lubang kecil itulah
sampel molekul DNA dimasukkan. Gel agarosa yang sudah terbentuk
kemudian dimasukkan ke dalam suatu tanki yang berisi buffer yang sama
dengan yang digunakan untuk membuat gel. Buffer dapat dibuat misalnya
dengan triasetat-EDTA (TAE) atau tris-borat-EDTA (TBE) (Yuwono, 2005).
C. ALAT DAN BAHAN
1. Alat
Alat-alat yang digunakan pada percobaan ini yaitu:
a. Batang pengaduk
b. Gel doc
c. Corong
d. Gelas kimia 100 mL
e. Gelas ukur 100 ml
f. Mikropipet
g. Mikrosentrifuse
h. Mortar dan stamfer
i. Handscoon
j. Masker
k. Parafin
l. Pipet tetes
m. Pisau
n. Spatula besi
o. Spidol
p. Satu set alat elektroforesis
q. Power supply
r. Tabung sentrifuse
s. Timbangan analitik
2. Bahan
Bahan-bahan yang digunakan pada percobaan ini yaitu:
a. Alkohol 70 %
b. Akuades
c. Buffer triaserar EDTA (TAE)
d. Es batu
e. Etridium bromida (Et Br)
f. Etanol dingin 96 %
g. Gel agarosa
h. Bengkoang
i. Lengkeng
j. Loading buffer (loading dye)
k. Sabun
l. Kiwi
m. Kertas saring
n. Anggur
o. Apel
p. Pier
q. Kelapa
r. Nangka
s. Jambu biji
t. Mangga
u. Sirsak
v. Melon
w. Srikaya
x. Manggopa
y. Salak
D. PROSEDUR KERJA
1. Isolasi DNA
a. Pembuatan larutan sabun
Sabun (sunlight)

- Diambil 10 mL sabun cair dan simpan pada

gelas kimia
- Ditambahkan 10 mL akuades
- Diaduk perlahan hingga homogen
- Dihilangkan busa pada sabun

Larutan sabun
b. Ekstraksi DNA buah

Bengkoang Lengkeng

- Diambil daging buah secukupnya

- Digerus hingga halus
- Dimasukan kedalam larutan sabun
- Diaduk hingga homogen, tanpa ada busa
sabun yang terbentuk
- Disaring menggunakan kertas saring

Filtart buah Residu

- ditambahkan kedalam tabung sentrifuse

- ditambahkan etanol dingin sebanyak dua kali lipat
volume filtrat
- didinginkan selama beberapa menit
- dipisahkan endapan yang terbentuk dari supernatan
- dicuci endapan tersebut dengan akuades
- diulang prosedur sebelumnya untuk sampel buah anggur,
mangga, sirsak, melon, srikaya, apel, pier, salak, nangka,
kelapa muda, kiwi, manggopa, strowbery, jambu biji

Hasil pengamatan..?
c. Elektroforesis DNA

Loading dye

- Dipipet menggunakan mikropipet

- Diteteskan sebanyak 3 tetes pada cawan petri
- Ditambahkan 3 tetes DNA bengkoang dan
lengkeng hasil isolasi
- Dicampurkan hingga homogen
- Dimasukan kedalam sumur gel agarosa, yang
telah ditambahkan buffer TAE
- Dielektroforesis pada tegangan 100 v selama 30
menit
- Direndam gel agarosa hasil elektroforesis pada
larutan EtBr kurang lebih 15 menit
- Dilanjutkan dengan direndam dalam akuades
kurang lebih 15 menit
- Divisualisasi dengan menggunakan gel dos
- Diambil gambarnya

Hasil pengamatan...?
E. HASIL PENGAMATAN
1. Tabel pengamatan
No Perlakuan Gambar
1 Masing-masing sampel buah yang akan
diisolasi DNAnya dihaluskan sampai
benar-benar halus
2 Disiapkan campuran 10 mL sabun dan 10
mL akuades (jangan sampai berbusa)

3 Sampel buah yang sudah dilumatkan

diambil residunya dan dicampur dengan
larutan sabun

4 Campuran larutan sabun dan residu

disaring, diambil filtratntya, dan ditetesi
etanol dingin 96%, sebanyak 2 kali lipat
volume filtrat
5 Disintrifugasi dengan kecepatan tinggi
dan terbentuk endapan

6 Endapan yang terbentuk dipisahkan dari

supernatannya (etanol dan larutan sabun)
dengan cara dicuci dengan akuades

7 Ekstrak atau isolat DNA dicampur

dengan loading dye
8 Dimikropipet, dimasukan kedalam sumur
agarosa untuk dilakukan elektroforesis

9 Pita DNA setelah elektroforesis dan

diamati dibawah sinar uv
F. PEMBAHASAN
DNA adalah asam nukleat yang mengandung materi genetik dan
berfungsi untuk mengatur perkembangan biologis seluruh bentuk kehidupan
secara seluler. DNA terdapat pada nukleus, mitokondria dan kloroplas.
Perbedaan ketiganya adalah DNA nukleus berbentuklinear dan berasosiasi
sangat erat dengan protein histon, sedangkan DNA mitokondria dan kloroplas
berbentuk sirkular dan tidak berasosiasi dengan protein histon. Selain itu,
DNA mitokondria dan kloroplas memiliki ciri khas, yaitu hanya mewariskan
sifat-sifat yang berasal dari garis ibu sedangkan DNA nukleus memiliki pola
pewarisan sifat dari kedua orang tua. Dilihat dari organismenya struktur DNA
prokariot tidak memiliki protein histon dan berbentuk sirkular, sedangkan
DNA eukariot, berbentuk linear dan memiliki protein histon.
Isolasi DNA merupakan suatu langkah penting dalam memulai
pengamatan DNA, baik pengidentifikasian jumlah pasang basa, urutan basa
nitrogen yang tersusun dan pengamatan-pengamatan lainnya. Tujuan isolasi
DNA ialah memisahkan DNA (asam nukleat) dan membuangnya dari
komponen sel lainnya seperti protein, karbohidrat dan lemak, sehingga DNA
yang diperoleh dapat dianalisis dan dimodifikasi lebih lanjut dengan teknik
molekuler.
Percobaan ini dilakukan untuk mengisolasi DNA dari sampel buah-
buahan. Adapun sampel-sampel buah yang digunakan ialah buah apel,
anggur, mangga, kelengkeng, bengkoang, nangka, pier, salak, srikaya, sirsak,
kelapa, manggopa putih, melon, strawberry dan kiwi. Percobaan isolasi DNA
ini idlakukan dengan 3 tahap yaitu lisis (pemecahan) sel, pengendapan DNA
dan elektroforesis. Ketiga prosedur tersebut dilakukan secara bertahap pada
masing-masing sampel buah yang digunakan.
Pemecahan (lisis) sel merupakan tahapan awal isolasi DNA yang
bertujuan untuk mengeluarkan isi sel. Pemecahan sel ini dilakukan dengan
perusakkan atau penghancuran membran dan dinding sel sampel buah. Tahap
penghancuran sel atau jaringan dilakukan dalam 2 cara, yakni mekanik dan
kimiawi. Secara mekanik, pemecahan dilakukan dengan menggerus sampel
buah menggunakan lumpang dan alu. Sedangkkan secara kimiawi, dilakukan
dengan pemberian larutan sabun (deterjen). Penambaha sabun cair untuk
memecah membra inti sehingga isi inti sel yang berisi DNA dapat keluar.
Penambahan deterjen dalam isolas DNA berfungsi sebagai penyebab
kerusakkan membran sel, melalui ikatan yang dibentuk melalui sisi
hidrofobik deerjen dengan protein dan lemka pada membra membentuk
senyawa lipid protein-deterjen kompleks. Senyawa tersebut dapat terbentuk
karena protein dan lipid memiliki ujung hidrofilik dan hidrofobik, demikian
juga dengan deterjen, sehingga dapat membentuk suatu ikatan kimia.
Pemecahan (lisis) sel menghasilkan DNA kasar dan belum murni
(masih banyak mengandung zat-zat yang lain). Untuk itu, dilakukan
pengendapan DNA, untuk memisahkan atau memurnikan DNA dari zat lain.
Pengendapan DN pada percobaan ini dilakukan dengan menggunakan etanol
atau alkohol dingin dengan konsentrasi 96%, hal ini bertujuan untuk
menyempurankan presipitasi. Apabila etanol yang digunakan kurang dingin,
makan akan mengakibatkan pembentukan presipitat yang tidak sempurna.
Untuk menyempurnakan pengendapan dan pemisahan, dilakukan sentrifugasi
dengan kecepatan tinggi, sehingga DNA akan murni berbentuk endapan.
Elektroforesis merupakan suatu teknik pemisahan molekul seluler
berdasarkan atas ukurannya dengan menggunakan medan listrik yang
dialirkan pada suatu medium yang mengandung sample yang akan
dipisahkan. Teknik elektroforesis dapat digunakan untuk menganalisis DNA,
RNA maupun protein. Proses elektroforesis membutuhkan gel agarosa dan
etidium bromida (EtBr). Gel agarosa pada percobaan ini digunakan untuk
memisahkan fragmen DNA yang memiliki perbedaan ukuran lebih besar.
Hasil elektroforesis dari percobaan ini terlihat adanya pita DNA
yang terbentuk pada beberapa sampel buah, seperti pada buah kelengkeng,
bengkoang, mangga, apel, anggur, dan beberapa buah lainnya. Namun, pada
sampel buah lain, beberapa diantaranya tidak terbentuk pita pada gel agarosa.
Beberapa kemungkinan yang menyebabkan pita-pita DNA tidak terbentuk
seperti seharusnya adalah DNA yang dimasukkan ke dalam sumur tidka hati-
hati sehingga hilang karena larut dan pemindahan gel agarosa ke
spektrofotometer UV dengan tidak hati-hati sehingga sebagian dari gel
agarosa patah yang megakibatkan tidak ada garis cahaya yang muncul pada
gel.
G. KESIMPULAN
Berdasarkan percobaan yang telah dilakukan dapat disimpulkan
bahwa :
1. Metode umum mengisolasi DNA dilakukan dengan melalui tahapan
reparasi, ektraks sel, pemurnia dan presipitasi DNA
2. Isolasi DNA buah dilakukan dengan tahapan isolasi pada ektraksi sel
DNA dan elektroforesis. Hasil yang diperoleh terlihat adanya pita DNA
pada sampel buah bengkoang, kelengkeng, anggur, mangga, dan apel.
 DAFTAR PUSTAKA

Fillippova, E. M., Denise C. M., Johon G. T., Betsy M. S., Stephan R. Q., John C.
S., 2003, Quantifying Double-Strand Breaks and Clustered Damages in
DNA by Single-Molecule Laser Fluorescence Sizing, Biophisical
Journal, Vol. 84(2)
Gearheart, C. M., Eric C. R., Benjamin A., 2012, DNA-Based Active Logic
Design and Its Implications, Journal of Emerging Trens in Computing
and Inforamation Sciences, Vol. 3(5).
Marks, D. B., Allan D. N., Collen M. S., 2000, Biokimia Kedokteran Dasar :
Sebuah Pendekatan Klinis, EGC : Jakarta.
Putri, D. B., I Ketut J., 2015, Kualitas dan Kuantitas DNA Darah Kering pada
Besi dan Kayu yang Disimpan dalam Kurun Waktu Berbeda, Jurnal
Biologi, Vol. 19(1).
Yuwono, T., 2005, Biologi Molekuler, Erlangga : Jakarta.