Teknik Aseptis PDF
Teknik Aseptis PDF
Pendahuluan
Teknik kultur jaringan mensyaratkan kondisi aseptik, bebas dari bakteri,
jamur, yeast dan jasad renik lain pada setiap tahapan kegiatannya. Hambatan
utama keberhasilan pelaksanaan kultur jaringan adalah adanya kontaminasi
yang dapat timbul baik selama prosedur tersebut dikerjakan maupun selama
kultur dipelihara didalam ruang inkubator. Kontaminasi oleh mikroorganisme
menjadi problem yang sangat serius, karena mikrobia kontaminan akan segera
mengkonsumsi zat hara yang ada pada medium kultur. Mikroorganisme ini
meskipun berukuran sangat kecil, tetapi jumlahnya sangat banyak dan aktivitas
metabolismenya sangat tinggi, jika pertumbuhannya tidak dapat dicegah maka
dalam waktu yang relatip singkat segera mendominasi kultur. Sel dan jaringan
tanaman yang dikulturkan akan mati, matinya eksplan dapat disebabkan karena
dibebaskanya senyawa-senyawa toksik sebagai hasil metabolisme dari mikrobia
kontaminan, dapat juga karena eksplannya "dimakan" oleh mikrobia kontaminan
tsb.
Kontaminasi dapat timbul pada setiap tahapan dari pelaksanaan kultur
jaringan, prosedur kerja aseptis yang harus dikerjakan untuk menanggulangi
kontaminasi adalah:
1. Sterilisasi ruang kerja
2. Sterilisasi medium dan alat-alat
3. Sterilisasi eksplan.
Pendahuluan
Sebagaimana telah diuraikan pada Pokok Bahasan Laboratorium Kultur
Jaringan, kegiatan aseptis dimulai didalam Ruang Steril dan Ruang Inkubasi /
Kultur, kegiatan utama yang dilakukan meliputi sterilisasi dan penanaman
eksplan diatas atau didalam medium kultur. Laboratorium sederhana setidaknya
mempunyai dua ruangan tersebut, yang kebersihannya senantiasa harus
diperhatikan. Ruang kerja yang kotor, akibat terlalu banyak orang yang lalu
lalang didalamnya, dapat mengundang timbulnya kontaminasi. Ruang kultur yang
tidak terpelihara dapat mengundang serangga-serangga kecil untuk masuk
kedalam botol-botol yang berisi medium kultur. Serangga-serangga kecil ini
menimbulkan permasalahan tersendiri karena spora-spora jamur dan bakteri
biasanya ikut lerbawa masuk kedalam botol kultur. Ruang kerja harus mudah
dibersihkan dan dilengkapi dengan AC sehingga senantiasa kering dan sejuk.
Kegiatan sterilisasi medium dan alat-alat dikerjakan diruang persiapan.
Kebersihan dan organisasi laboratorium yang efisien, ditunjang dengan peralatan
yang memadai, dapat menciptakan kondisi aseptis yang terkendali.
Gambar 4.1. Laminar air flow dengan bagian-bagiannya (a) udara masuk (b)
blower (c) HEPA filter (d) ruang kerja aseptis (e) prefllter.
Udara yang dihisap oleh blower dihembuskan melalui HEPA (high
efficiency particulate air) filter dengan porositas 0,22 μm, spora-spora
jamur dan bakteri akan tertahan, sehingga udara yang berhembus keluar
sudah suci hama, laf kadang-kadang dilengkapi dengan UV. Sebelum
mulai bekerja, permukaan meja kerja laf disemprot dan dilap dengan kain
yang telah dibasahi alkohol 70% atau spiritus, semua alat-alat
dimasukkan ruang kerja (lihat gambar 2. detail ruang kerja). Alat-alat dan
medium harus sudah steril baik permukaan maupun bagian dalamnya,
untuk botol kultur yang berisi media, permukaannya disemprot atau dilap
dengan alkohol 70%. Untuk laf yang dilengkapi dengan UV, sebelum
bekerja lampu UV dinyalakan selama 30-60 menit untuk mematikan
kontaminan pada permukaan ruang kerja.
Gambar 4.2. Detail ruang kerja dan Laminar air flow, botol berisi medium kultur
dan alat-alat harus diletakkan dikanan kiri ruang kerja dan tidak boleh
menghalangi hembusan udara steril.
Didalam laf juga sering dilengkapi dengan instalasi gas yang diperlukan
untuk sterilisasi alat-alat dengan pembakaran, tetapi ini dapat diganti
dengan lampu spiritus atau baktisinerator.
Gambar 4.3 Steril box (entkas) yang terbuat dari bahan kaca
Beberapa komponen medium ada yang tidak stabil kalau kena panas
yang tinggi, misalnya GAs, Ca-panthothenate dan Thiamin-HCl harus disterilisasi
dengan ultra filtrasi (Millipore filter) pada suhu ruangan (25°C). Dengan memakai
ultrafiltrasi larutan yang berisi bahan-bahan yang termolabil dimasukkan kedalam
medium kultur yang telah steril, langkah ini dikerjakan didalam ruang steril (laf)
ketika medium agar telah agak dingin tetapi belum memadat. Ada beberapa
macam Millipore filter, yang terbuat dari polyethylene film sekali pakai terus
dibuang (disposable), ada Millipore filter yang dilengkapi dengan holder , filter
holder ini dapat disterilisasi dengan autoclave (autoclavable). Porositas dari
filternya juga bermacam-macam, mulai dari 0,22 - 0,45 μm. Untuk larutan
termolabil dalam jumlah sedikit (5-50 ml) dengan mudah dapat disterilisasi
dengan Millipore filter yang dipasang pada ujung syrink (alat suntik). Dalam
jumlah besar (50 - 5000 liter) sterilisasi dengan ultrafiltrasi ini harus dibantu
dengan pompa vakum.
Alat-alat yang digunakan didalam ruang steril antara lain : scalpel, pinset
bermacam-macam ukuran, petridish, cork borrer, pipet, alat-alat gelas (botol
kultur dsb), gunting, kertas saring dsb. Alat-alat tersebut, sebelum disterilisasi,
dibersihkan terlebih dahulu kemudian dibungkus rapi dengan kertas coklat. Alat-
alat yang akan disterilisasi dengan autoclave tidak boleh dibungkus dengan
aluminum foil sebab uap air tidak dapat masuk kedalam bungkusan. Untuk botol
kultur, sebelumnya harus dicuci kemudian ditutup dengan aluminum foil atau
bahan lain yang terbuat dari karet, kain atau plastik yang tahan panas. Botol
kultur dengan penutup yang berulir, tidak boleh ditutup terlalu rapat ketika
disterilisasi, ini diperlukan agar tidak terjadi perbedaan tekanan dengan ruangan
didalam autoclave, perbedaan tekanan akan mengakibatkan pecahnya botol
kultur.
Sterilisasi eksplan
Eksplan adalah bagian kecil dari tanaman baik itu sel, jaringan, ataupun
organ yang digunakan untuk memulai suatu kultur. Eksplan yang digunakan
didalam kultur jaringan harus yang masih muda (primordia), sel-selnya masih
bersifat meristematik. Sel-sel yang bersifat meristematik dicirikan dengan sifatnya
yang selalu membelah, selnya berukuran kecil tetapi inti selnya relatip besar,
penuh plasma, vacuola kecil-kecil, dinding sel tipis terdiri dari dinding primitip
yang berupa selulosa microfibril. Bagian tanaman yang bersifat meristematik
antara lain terdapat pada ujung (kuncup) batang atau akar, dikenal dengan nama
meristem apikal, pada batang disebut shoot apical meristem sedangkan
meristem yang terdapat pada kuncup diketiak daun disebut meristem aksiler
(gambar 4. 4).
Gambar 4. 4. Tanam dikotil dengan kuncup apikal dan aksiler dimana
didalamnya terdapat sel-sel yang meristematik.