Studi Potensi Aktivitas Antioksidan Biopigmen Mikroalga Laut

Tropis Cyclotella sp. dan Porphyridium cruentum dengan

Radikal DPPH

Skripsi

Etana Nisa Noorsyifa

10511076

PROGRAM STUDI SARJANA KIMIA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG
2017
STUDI POTENSI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN BIOPIGMEN
MIKROALGA LAUT TROPIS CYCLOTELLA SP. DAN
PORPHYRIDIUM CRUENTUM DENGAN RADIKAL DPPH

Judul Skripsi dalam Bahasa Inggris Bla Bla Bla.... Bla Bla
Bla... Bla Bla Bla.... Bla Bla Bla

Skripsi

Etana Nisa Noorsyifa

10511076

PROGRAM STUDI SARJANA KIMIA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG
2017

ii
 Abstrak

Radikal bebas merupakan spesi reaktif yang dapat menyebabkan kerusakan makromolekul
seluler, dan menimbulkan berbagai penyakit degeneratif. Aktivitas radikal bebas dapat
dihambat oleh senyawa antioksidan, salah satunya, biopigmen dari mikroalga. Pada
penelitian ini, identifikasi, pemurnian, dan pengujian aktivitas antioksidan biopigmen dari
mikroalga laut Cyclotella sp. dan Porphyridium cruentum dilakukan. Berdasarkan tujuan
tersebut, telah dilakukan kultivasi mikroalga Cyclotella sp. dan Porphyridium cruentum,
pemanenan biomassa dengan teknik sentrifugasi, isolasi biopigmen menggunakan teknik
homogenasi dengan pelarut aseton, pemurnian kromatografi kolom silika, karakterisasi
dengan spektrofotometri sinar tampak, dan kromatografi lapis tipis (KLT), serta pengujian
aktivitas antioksidan biopigmen dengan menggunakan radikal 2,2-difenil – 1 pikrilhidrazil
(DPPH). Hasil penelitian menunjukkan, kultivasi Cyclotella sp. mencapai kerapatan sel
optimum pada hari ke-12 sebesar 0,70 × 106 sel/mL (2,8× dari semula) dengan berat 0,51 g
biomassa/L kultur. Identifikasi biopigmen menggunakan KLT menghasilkan 6 pita yang
diduga sebagai fukosantin, diadinosantin, diatosantin, klorofil a, feofotin a, dan β-karoten
dengan nilai Rf berturut-turut 0,25; 0,33; 0,38; 0,44; 0,77; dan 0,99. Sedangkan pada
Porphyridium cruentum, kultivasi mencapai kerapatan sel optimum pada hari ke-9 sebesar
22,05 × 106 sel/mL (44,1× dari semula) dengan berat 2,5 g biomassa/L kultur. Identifikasi
biopigmen menggunakan KLT menghasilkan 4 pita yang diduga sebagai lutein, klorofil a,
feofotin a, dan β-karoten dengan nilai Rf berturut-turut 0,32; 0,44; 0,67; dan 0,89. Asam
askorbat digunakan sebagai kontrol positif pada uji kuantitatif aktivitas antioksidan,
memiliki nilai IC50 sebesar 2,67 µg/mL. Nilai IC50 β-karoten dan fukosantin dari Cyclotella
sp. terhadap radikal DPPH berturut-turut adalah 30,73 µg/mL dan 104,93 µg/mL. Sedangkan
nilai IC50 β-karoten dan klorofil a dari Porphyridium cruentum berturut-turut adalah
108,21µg/mL dan 106,42 µg/mL.

Kata kunci: radikal bebas, antioksidan, biopigmen, Porphyridium cruentum, Cyclotella sp.

iii
 Abstract (Times New Roman, 12, regular)

Abstract bahasa Inggris. Abstrak skripsi dicetak dengan satu spasi dan mempunyai
batas tepi yang sama seperti tubuh utama skripsi. Abstrak ditulis maksimal 1
halaman. (Times New Roman, 11, regular)

iv
 Program Studi Sarjana Kimia
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Institut Teknologi Bandung

Menerangkan bahwa Skripsi yang disusun oleh:

Nama: Etana Nisa Noorsyifa

NIM: 10511076

Telah disetujui sebagai persyaratan untuk mendapatkan gelar

Sarjana Kimia

Bandung,..............................

Pembimbing

Prof. Zeily Nurrachman, D.Sc

NIP. 196503131989031025

v
Dipersembahkan untuk …………………………………………….

vi
 Ucapan Terima Kasih

Alhamdulillah, puji syukur penulis penjatkan ke hadirat Allah SWT, karena atas karunia dan
kehendak-Nya penulis bisa menyelesaikan skripsi ini. Shalawat serta
salamxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx.xxxxxxxxx.xxxxxxxxxxxx.xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx.xx
xxxxxxxxxxxxxxxxxx.

Semoga Allah SWT membalas setiap kebaikan dengan kebaikan yang berlipat ganda.

Bandung,................................

Penulis

vii
 Daftar Isi

Abstrak....................................................................................................................................iii
Abstract...................................................................................................................................iv
Ucapan Terima Kasih.............................................................................................................vii
Daftar Isi...............................................................................................................................viii
Daftar Tabel.............................................................................................................................ix
Daftar Gambar..........................................................................................................................x
Daftar Lampiran......................................................................................................................xi
1 Pendahuluan..................................................................Error! Bookmark not defined.
1.1 Rumusan Masalah.........................................................Error! Bookmark not defined.
1.2 Tujuan Penelitian..........................................................Error! Bookmark not defined.
1.3 Ruang Lingkup Penelitian.............................................................................................2
2 Tinjauan Pustaka............................................................................................................3
2.1 Mekanisme Reaksi.........................................................................................................3
2.1.1 Sub mekanisme reaksi...................................................Error! Bookmark not defined.

2.2 Analisis Organoleptik...................................................Error! Bookmark not defined.

2.2.1 Sub sub bab...................................................................Error! Bookmark not defined.

3 Metodologi Penelitian....................................................................................................8
3.1 Tempat dan Bahan Penelitian.........................................................................................8
3.2 Peralatan........................................................................................................................8
3.3 Cara Kerja......................................................................................................................8
4 Hasil dan Pembahasan.................................................................................................12
4.1 Mekanisme Transisi xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx xxxxxxxxxx xxxxxx
xxxxxxxxxxxx..............................................................Error! Bookmark not defined.
4.1.1 Reaksi elektrofilik.........................................................Error! Bookmark not defined.

4.2 Paramagnetik Kinetik...................................................Error! Bookmark not defined.

5 Kesimpulan..................................................................................................................20
5.1 Kesimpulan..................................................................................................................20
5.2 Saran............................................................................................................................20
Daftar Pustaka........................................................................................................................21
LAMPIRAN...........................................................................................................................23

viii
ix
 Daftar Tabel

Tabel 2.1 Identifikasi senyawa-senyawa yang terlibat dalam reaksi substitusi

nukleotida di dalam pelarut polar............Error! Bookmark not defined.
Tabel 3.1 Nama mikroorganisme yang digunakan..Error! Bookmark not defined.

x
 Daftar Gambar

Gambar 2.1 Pengaruh gerhana matahari pada profil kota besar di Pulau pulau Indonesia
bagian Barat (Sumatra, Jawa, dan Kalimantan)...........Error! Bookmark not
defined.
Gambar 2.2 Fenomena alam.............................................Error! Bookmark not defined.
Gambar 2.3 Spora xxxxxxxxxxxxxxx...............................Error! Bookmark not defined.

xi
 Daftar Lampiran

Lampiran A Contoh Halaman Lampiran..........................................................................23

Lampiran B Contoh Halaman Lampiran Contoh Halaman Lampiran Contoh Halaman
Lampiran......................................................................................................24

xii
 1 Pendahuluan

Pada bab ini, akan dijelaskan latar belakang dilakukannya penelitian studi potensi aktivitas
antioksidan biopigmen dari mikroalga laut tropis Cyclotella sp. dan Porphyridium
cruentum dengan radikal DPPH, uraian rumusan masalah, tujuan, serta ruang lingkup
penelitian.

1.1 Latar Belakang Penelitian

Radikal bebas merupakan spesi reaktif yang tidak stabil karena memiliki elektron yang tidak
berpasangan. Hal ini membuat senyawa radikal mudah bereaksi dengan cara mengambil
elektron dari senyawa lain. Pada dasarnya senyawa radikal merupakan senyawa yang
dihasilkan secara normal sebagai hasil sampingan dari metabolisme. Berbagai pengaruh
lingkungan, seperti radiasi sinar UV/ X/ γ, senyawa xenobiotik (asap rokok, gas buangan
kendaraan, zat anastesi), serta infeksi virus/ bakteri juga dapat mengasilkan radikal bebas
(Devasagayam, 2004). Keadaan lingkungan yang tidak sehat dapat memicu timbulnya
senyawa radikal bebas dalam kadar yang berlebih. Dalam konsentrasi rendah, radikal bebas
dapat bersifat menguntungkan karena terlibat dalam beberapa fungsi fisiologis, seperti sistem
signaling sel dan mekanisme pertahanan sel terhadap agen penginfeksi (Valko, Leibfritz,
Moncola, & Cronin, 2007). Namun dalam konsentrasi tinggi, radikal bebas dapat
menyebabkan kerusakan berbagai makromolekul seluler, seperti peroksidasi lipid, mutasi
DNA, atau oksidasi asam amino pada protein. Proses ini dapat mempengaruhi fungsi,
menyebabkan kematian pada sel, dan menimbulkan berbagai penyakit degeneratif
(Devasagayam, 2004).

Aktivitas oksidasi radikal bebas dapat dihambat oleh suatu spesi dengan struktur molekul
yang dapat memberikan elektronnya kepada molekul radikal bebas, yang dikenal dengan
antioksidan. Jenis antioksidan terdiri dari dua, yaitu antioksidan alam dan antioksidan
sintetik. Namun seiring dengan berkembangnya pengetahuan masyarakat, antioksidan
sintetik cenderung kurang diminati karena potensi toksik dan karsinogenik yang dimilikinya
(Gramza & Korczak, 2005). Untuk mengatasi masalah ini, banyak dilakukan penelitian
terkait alternatif dari sumber antioksidan alami. Salah satu alternatif yang dapat digunakan
sebagai sumber antioksidan dari mikroalga (Annisa, 2013).

xiii
1.2 Rumusan Masalah

Sebelumnya telah dilakukan uji aktivitas antioksidan terhadap kloforil a dan b-karoten dari
biopigmen Porphyridium cruentum, mamun dalam pengembangannya perlu adanya
pembaharuan data mengenai aktivitas antioksidan tersebut. Sedangkan Cyclotella sp.
merupakan mikroalga baru dalam koleksi mikroalga laboratorium Biokimia ITB yang belum
dilakukan karekterisasi terhadap biopigmen dan aktivitas antioksidannya. Porphyridium
cruentum merpakan mikroalga merah bersel satu, sedangkan Cyclotella sp. tergolong
mikroalga berjenis diatom. Perbedaan karakteristik ini membuat penelitian uji aktivitas
antioksidan terhadap biopigmen kedua mikroalga menarik untuk dilakukan.

1.3 Tujuan Penelitian

Berdasarkan rumusan masalah yang diajukan, tujuan penelitian ini adalah menentukan
aktivitas antioksidan biopigmen dari mikroalga laut Porphyridium cruentum dan
Cyclotella sp. dengan radikal DPPH.

1.4 Ruang Lingkup Penelitian

Penelitian ini meliputi kultivasi mikroalga laut Porphyridium cruentum dan Cyclotella sp.
dalam fotobioreaktor sederhana dengan kondisi aerasi dan cahaya terkontrol. Kultivasi
dilakukan dalam air laut yang diperkaya dengan medium pertumbuhan AF3 dan silika.
Pemanenan biomassa basah dilakukan dengan teknik sentrifugasi. Isolasi biopigmen
dilakukan dengan teknik homogenasi menggunakan pelarut aseton p.a untuk biopigmen
yang larut dalam pelarut organik. Ekstrak kasar biopigmen diidentifikasi menggunakan
kromatografi lapis tipis (KLT), selanjutnya dilakukan pemurnian dengan kromatografi
kolom silika untuk dikarakterisasi menggunakan spektrofotometri sinar tampak.
Biopigmen murni dengan kelimpahan terbesar kemudian diuji aktivitas antioksidannya
dengan menggunakan radikal DPPH.

xiv
 2 Tinjauan Pustaka

Pada bab ini akan dijelaskan uraian terkait tinjauan pustaka mengenai mikroalga,
biopigmen, radikal bebas, dan antioksidan.

2.1 Mikroalga

Mikroalga atau biasa disebut fitoplankton merupakan organisme fotosintetik mirip

tanaman yang berukuran renik sekitar 1-50 µm tanpa akar dan daun. Mikroalga dapat
ditemukan dalam sel tunggal maupun koloni dengan habitat alami air laut, ait tawar, atau
air payau. Mikroalga memiliki karakteristik yang unik, perpaduan dari tanaman tingkat
tinggi dan mikroorganisme. Hal ini menyebabkan mikroalga mampu melakukan
fotosintesis optimal dengan laju pertumbuhan tinggi serta mampu melakukan sekresi
metabolit primer & sekunder, namun kebutuhan nutrisinya sederhana (Campo dkk.,
2007). Mikroalga memiliki kemampuan adaptasi yang tinggi dan mampu hidup dalam
berbagai tekanan lingkungan, seperti panas, dingin, salinitas, fotooksidasi, anaerobiosis,
tekanan osmosis, dan paparan sinar UV (de Marsac & Houmard, 1993).

Setiap spesies mikroalga memiliki komposisi kimia yang berbeda beda, bergantung pada
faktor internal maupun eksternal (Annisa, 2013). Konstituen utama penyusun sel
mikroalga ialah protein (12-35%), lipid (7,2-23%), dan karbohidrat (4,6-23%) (Coutteau,
2007). Selain berpotensi sebagai sumber makronutrien, mikroalga juga memiliki potensi
sebagai sumber mikronutrien, terutama biopigmen (Campo et al., 2007). Berdasarkan
pigmen warna, mikroalga dikelompokkan menjadi diatom (Bacillariophyceae), mikroalga
hijau (Chlorophyceae), mikroalga merah (Rhodophyta), mikroalga cokelat keemasan
(Chrysophyceae), Prymnesiophytes (Prymnesiophyceae), Eustigmatophytes
(Eustigmatophyceae), dan mikroalga biru kehijauan (Cyanophyceae).

2.1.1 Cyclotella sp.

Diatom merupakan kelompok mikroalga yang memiliki jumlah spesies terbanyak,yaitu
100.000 spesies yang telah diketahui. Pada habitatnya, diatom dapat hidup dengan cara
melayang di perairan sebagai fitoplankton, berada pada dasar perairan (benthic), atau
menempel pada partikel tertentu (epiphilic).Perbedaan paling khas antara diatom dengan
mikroalga lainnya yaitu, dinding sel diatom mengandung silikon. Pigmen utama yang
terkandung dalam diatom adalah fukosantin, yang menyebabkan sel diatom berwarna
cokelat.

Selain fukosantin, terdapat pigmen warna lainnya seperti β-karoten, klorofil a, dan
klorofil c dalam jumlah yang rendah.Diatom dapat bersifat autotrof dan
heterotrof.Autotrof merupakan suatu sifat jika nutrient yang diperolehnya berasal dari
senyawa anorganik terlarut, sedangkan heterotrof merupakan sifat suatu organisme jika
nutrien yang diperoleh berasal dari karbon organik (untuk yang bersifat menempel).

2.1.2 Porphyridium cruentum

Porphyridium cruentum merupakan mikroalga merah bersel satu yang termasuk kelas
Rhodophyceae, hidup bebas atau hidup berkoloni dalam mucilago. Mucilago merupakan
polisakarida sulfat yang bersifat larut dalam air (Purnaningtyas, 2015). Bentuk sel P.
cruentum adalah bulat berdiameter 4-9 μm. Sel P. cruentum tersusun atas nukleus,
kloroplas, badan golgi, mitokondria dan vesikel (Lee et al., 1989)

Klasifikasi biologi mikroalga P. cruentum memiliki klasifikasi biologi menurut Vonshak

(1988) sebagai berikut:

Divisi : Rhodophyta

Sub Kelas : Bangiophyceae

Ordo : Porphyridiales

Famili : Porphyriceae

Genus : Porphyridium

Spesies : Porphyridium cruentum

2.2 Biopigmen

Biopigmen merupakan zat warna alami yang aman untuk digunakan, seperti keperluan
konsumsi (Nurachman, 2013). Struktur biopigmen umumnya berupa rantai lurus/cincin
dengan sistem terkonyugasi, sehingga biopigmen dapat menyerap dan memantulkan
gelombang elektromagnetik pada daerah UV dekat atau sinar tampak (300-800 nm)
(Rabinowitch & Govindjee, 2010). Pada sel, biopigmen terletak dalam organel kloroplas.
Biopigmen secara umum dibagi menjadi 3 kelompok yaitu klorofil, karotenoid, dan
fikobilin.

2.2.1 Klorofil

Klorofil adalah pigmen hijau yang memberikan sebagian besar warna pada tanaman dan
berperan penting dalam fotosintesis. Secara kimia, klorofil memiliki beberapa bentuk
yang sama, masing-masing berisi struktur kompleks tetrapirol, tersusun membentuk
cincin forfirin yang berkoordinasi dengan ion magnesium. Cincin forfirin ini dapat
tersubstitusi oleh gugus hidrofobik pitol, alkohol berkarbon 20 yang teresterifikasi pada
rantai samping asam (Stryer & Berg, 2002). Pada proses fotosintesis klorofil menangkap
energi cahaya, elektron dalam struktur klorofil akan tereksitasi ke tingkat energi tinggi
dan masuk dalam tahap rantai transfer elektron (Stryer & Berg, 2002).

a b c
d

Gambar 2.1 Struktur berbagai jenis klorofil

(a) = klorofil a, (b) = klorofil b, (c) = klorofil d, (d) = klorofil c1, (e) = klorofil c2
Sumber: Richfield (2007)
2.2.2 Karotenoid
Karotenoid adalah pigmen merah, oranye dan kuning yang disintesisi pada kloroplas
makhluk hidup yang mengalami fotosintesis seperti tanaman, alga, bakteri, dan fungi.
Karotenoid berperan sebagai pigmen aksesori dalam proses fotosintesis, menyerap sinar
tampak pada daerah 460 dan 550 nm, dan meneruskan energi cahaya yang diserapnya
pada klorofil. Selain itu, karotenoid juga berfungsi sebagai antioksidan, pigmen proteksi,
dan penstabil membran (Palozza & Krinsky, 1992). Dengan begitu, karotenoid
melindungi klorofil dari kerusakan akibat cahaya (fotooksidatif) dan memadamkan
pembentukan singlet oksigen reaktif (SOR).

Karotenoid memiliki struktur tetraterpenoid yang terbentuk dari ikatan kepala-ekor 8 unit
isoprena, C5 (kecuali pada pusat, ikatan adalah ekor-ekor) yang menghasilkan molekul
simetri. Kerangka dasar ini kemudian dapat mengalami modifikasi berupa siklisasi,
hidrogenasi, dehidrogenasi, substitusi gugus fungsi oksigen, penyusunan ulang,
pemendekan rantai, atau kombinasi proses tersebut (Rodriguez & Kimura, 2004).

Gambar 2.2 Struktur karotenoid (Rodriguez, 2001)

2.3 Radikal Bebas

Radikal bebas merupakan spesi reaktif yang tidak stabil karena memiliki elektron yang
tidak berpasangan pada orbital terluarnya. Radikal bebas dapat menyerang molekul
sekelilingnya sehingga akan menyebabkan terjadinya reaksi berantai, yang kemudian
menghasilkan senyawa radikal baru. Pada dasarnya senyawa radikal merupakan senyawa
yang dihasilkan secara normal sebagai hasil sampingan dari metabolisme. Berbagai
pengaruh lingkungan, seperti radiasi sinar UV/ X/ γ, senyawa xenobiotik (asap rokok, gas
buangan kendaraan, zat anastesi), serta infeksi virus/ bakteri juga dapat mengasilkan
radikal bebas (Devasagayam, 2004).
Radikal bebas umumnya dibagi dalam dua kelompok, yaitu spesi reaktif oksigen/ reactive
oxygen species (ROS) dan spesi reaktif nitrogen/ reactive nitrogen species (RNS)
(Devasagayam, 2004). Dalam konsentrasi rendah, spesi radikal ini dapat bermanfaat
dalam pertahanan terhadap serangan infeksi, induksi proses mitogenik, transportasi ion,
serta proses signaling sel (Valko, Leibfritz, Moncola, & Cronin, 2007).

Salah satu contoh senywa radikal adalah DPPH merupakan radikal bebas komersil
berpusat nitrogen yang dikembangkan pertama kali oleh Blois (1958). Larutan DPPH
dalam methanol berwarna ungu gelap, dengan serapan sinar tampak pada 517 nm (pH
5,0-6,5). DPPH memiliki kestabilan yang cukup tinggi, karena delokalisasi elektron pada
strukturnya, sehingga molekul ini tidak membentuk dimer seperti radikal lainnya.Radikal
DPPH yang dipadamkan oleh antioksidan akan berubah menjadi bentuk hidrazin dan
mengalami penurunan absorbansi secara stoikiometri.

2.4 Antioksidan

Antioksidan merupakan suatu spesi dengan struktur molekul yang dapat memberikan
elektronnya kepada molekul radikal bebas dan dapat memutus reaksi berantai dari radikal
bebas. Antioksidan dapat menetralkan radikal bebas dengan cara menerima/
menyumbangkan satu atau lebih elektronnya untuk menghilangkan kondisi elektron yang
tidak berpasangan pada radikal. Dengan demikian, antioksidan dapat menghambat laju
oksidasi dari senyawa radikal bebas. Reaksi antara antioksidan dan radikal akan
menghilangkan sifat reaktif dari radikal, sementara antioksidan akan membentuk radikal
baru, namun dengan kereaktifan yang lebih rendah (Annisa, 2013). Hal ini karena
struktur terkonnyugasi pada antioksidan memungkinkan terjadinya delokalisasi elektron
bebas pada strukturnya.
 3 Metodologi Penelitian
Pada bab ini akan dijelaskan mengenai metodologi penelitian yang meliputi tempat dan
waktu penelitian, alat dan bahan, serta cara kerja penelitian.

3.1 Tempat dan Waktu Penelitian

Penelitian studi potensi aktivitas antioksidan biopigmen dari mikroalga laut tropis
Cyclotella sp. dan Porphyridium cruentum dengan radikal DPPH ini dilakukan di
Laboratorium Penelitian Kelompok Keahlian Biokimia Program Studi Kimia dan Gedung
Riset dan Inovasi lantai 5 Institut Teknologi Bandung dengan waktu kurang lebih selama
6 bulan.

3.2 Peralatan

Penelitian ini memerlukan beberapa macam peralatan umum dan khusus. Peralatan umum
diantaranya meliputi peralatan gelas dan non gelas. Peralatan gelas terdiri dari gelas
kimia, biuret 25 mL, batang pengaduk, tabung reaksi, cawan petri, labu erlenmeyer, gelas
ukur, corong gelas, pipet tetes, termometer, dan botol vial. Peralatan non gelas terdiri dari
tabung alat sentrifuga, kuvet 1000 µL, pipet mikro 1000 µL dan 200 µL, tip mikro,
bunsen, botol semprot, pompa air, oven, pipa L, sumbat karet, aerator, selang plastik, dan
lampu neon. Sedangkan peralatan khusus untuk pengukuran, sterilisasi, pemanenan yang
meliputi otoklaf, neraca analitik, luxmeter, hidrometer, hemositometer, mikroskop
cahaya, alat penghitung, pH-meter, alat sentrifuga BeckmannJS-H2, alat homogenasi,
pelat KLT, dan spektrofotometer uv-vis.

3.3 Bahan

Mikroalga laut Cyclotella sp. dan Porphyridium cruentum didapatkan dari koleksi
Laboratorium Biokimia Institut Teknologi Bandung. Sedangkan bahan kimia yang
digunakan antara lain bahan untuk kultur (kultivasi), sterilisasi, ekstraksi, pemanenan
serta bahan untuk menentukan berat protein. Bahan kultivasi meliputi air laut yang
diperkaya bahan medium yaitu medium AF3 dengan komposisi pupuk Hyponex,
Na2EDTA, FeCl3, serta aquades. Ekstraksi, karakterisasi dan pemisahan dilakukan dengan
menggunakan metanol p.a, aseton p.a, heksana p.a, serta silika 60G.

3.4 Cara Kerja

3.4.1 Penyiapan Air Laut

Air laut alami diukur salinitasnya menggunakan salinometer. Kemudian dibuat air laut
dengan salinitas 27-28 ppt, dan pH 7,9-8,0 melalui pengenceran menggunakan aquades.
Selanjutnya air laut disaring, dan disterilisasi menggunakan otoklaf (15 menit, 121 ºC).

3.4.2 Penyiapan Medium Pertumbuhan

Medium termodifikasi yang digunakan terdiri dari 2 macam medium yaitu medium AF3
dan medium silikat. Setiap medium ditempatkan dalam botol yang berbeda. Medium AF3
dibuat dengan melarutkan EDTA sebanyak 70 g dalam 1 L aquades kemudian
ditambahkan pupuk Hyponex sebanyak 115 g. Setelah larutan homogen, kemudian
ditambahkan FeCl3 3,3 g dengan pengadukan hingga larutan kembali homogen.
Sedangkan medium silikat dibuat dengan melarutkan 45 g Na 2SiO3 dalam 1 L aquades.
Masing – masing medium disaring, dan disterilisasi menggunakan otoklaf ( 15 menit,
121ºC).

3.4.3 Kultivasi Mikroalga

Kultivasi mikroalga dilakukan dalam fotobioreaktor sederhana dengan metode Batch
secara aseptik. Pada Porphyridium cruentum kultivasi dilakukan dengan sel awal
minimum 0,50 × 106 sel/mL, intensitas cahaya 2500 Lux, fotoperiodis 12:12
(gelap:terang), dan aerasi terkontrol. Volume total kultur adalah 900 mL dengan
penambahan medium pertumbuhan AF3 sebanyak 0,2% (v/v). Sedangkan pada Cyclotella
sp. kultivasi dilakukan dengan sel awal minimum 0,25 × 10 6 sel/mL, intensitas cahaya
7000 Lux, fotoperiodis 12:12 (gelap:terang), dan aerasi terkontrol. Volume total kultur
adalah 900 mL dengan medium pertumbuhan AF3 dan medium silikat masing-masingg
0,1% (v/v).

Kerapatan sel dihitung dengan menggunakan haemocytometer di bawah mikroskop optik

dengan perbesaran 40×. Perhitungan kerapatan sel di dalam haemocytometer dapat
dihitung dengan menggunakan persamaan :

21
 106

3.4.4 Pemanenan Kultur Mikroalga

Pemanenan biomassa basah Porphyridium cruentum dan Cyclotella sp. dilakukan dengan
metode sentrifugasi menggunakan alat sentrifuga Thermo Scientific SL—16R Centrifuge
selama 30 menit, kecepatan 4500 rpm, dan suhu 4oC.

3.4.5 Isolasi Biopigmen Mikroalga

Isolasi biopigmen dilakukan menggunakan pelarut yang sesuai dengan menggunakan alat
homogenasi sebagai pemecah sel secara mekanik. Pada Porphyridium cruentum dan
Cyclotella sp., isolasi biopigmen dilakukan dalam pelarut aseton p.a dengan komposisi 5
mL pelarut setiap 1 gram berat biomassa kering. Isolasi dilakukan sebanyak 5 siklus,
dengan waktu 5 menit ekstraksi dan jeda 1 menit untuk setiap siklusnya dalam keadaan
dingin.

3.4.6 Pemurnian Biopigmen Mikroalga

Pada ekstrak kasar biopigmen dilakukan pemurnian menggunakan kromatografi kolom
silika 60G. Preparasi kolom silika dilakukan dengan melakukan perendaman 10 gram
silika 60 G dalam 20 mL pelarut heksana:aseton (4:1) selama 12-24 jam. Silika yang telah
mengembang kemudian dimasukkan ke dalam kolom yang telah berisi 15-20 mL eluen
heksana:aseton (4:1), dan dialiri eluen hingga kolom homogen. Ekstrak kasar yang akan
dimurnikan dikeringkan dengan menggunakan gas N2 sampai membentuk padatan untuk
kemudian dicampurkan dengan 1 gram silika 60 G, dan dielusi dalam kolom silika
dengan gradient eluen. Komposisi eluen yang digunakan heksana:aseton berturut-turut
adalah 4:1; 3:2; 2:3; dan 4:1 masing-masing sebanyak 20 mL. Biopigmen hasil
pemisahan ditampung dalam tabung mikro 1,5 µL.

3.4.7 Pemurnian Biopigmen Mikroalga

Sebanyak 25 µL ekstrak kasar biopigmen hasil homogenasi ditotolkan pada pelat silika
berukuran 4×10 cm. Chamber KLT dijenuhkan terlebih dahulu dengan eluen
heksana:aseton (8:2) selama 30 menit. Pelat kemudian dielusi dalam chamber sehingga
biopigmen terpisah dengan nilai Rf yang berbeda-beda.

22
3.4.8 Karakterisasi Spektroskopi Sinar Tampak
Pigmen murni yang dihasilkan dapat dikarekterisasi menggunakan spektofotometer sinar
tampak pada panjang gelombang 300-800 nm. Pengukuran dilakukan menggunakan
kuvet bervolume 1 mL dengan aseton p.a sebagai blanko. Setiap sampel yang akan diukur
diencerkan terlebih dahulu dengan aseton p.a.

23
 4 Hasil dan Pembahasan

Pada bab ini akan dijelaskan mengenai hasil penelitian yang diperoleh beserta
pembahasannya.

4.1 Pertumbuhan Mikroalga

Pertumbuhan mikroalga dipengaruhi oleh beberapa kondisi yang digolongkan dalam

faktor kimia dan fisika. Faktor kimia yang mengatur pertumbuhan mikroalga meliputi
makronutrien dan mikronutrien dalam medium pertumbuhan. Selain nutrisi, pertumbuhan
mikroalga juga diatur oleh faktor fisika yang meliputi suhu, pH kultur, salinitas, intensitas
dan fotoperiodisme cahaya, serta densitas sel awal dan kondisi dari inokulum (Coutteau,
2007). Pada penelitian ini, Cyclotella sp. dan Porphyridium cruentum digunakan sebagai
sumber biopigmen. Untuk memperoleh biomassa mikroalga, sel Cyclotella sp. dan
Porphyridium cruentum dikultivasi. Optimasi parameter pertumbuhan yang sesuai
dilakukan terhadap Cyclotella sp., karena Cyclotella sp. merupakan mikroalga baru dalam
stok mikroalga di Laboratorium Biokimia ITB. Cyclotella sp. dikultivasi pada variasi
salinitas kultur, yaitu botol 1 dengan salinitas 22 ppt dan pH air laut 7,99, kemudian botol
2 digunakan salinitas 27-28 ppt dengan pH air laut 7,79.

(A) (B)
Gambar 4.1 Cyclotella sp.
Gambar (A) Sel Cyclotella sp. mikroskopis, (B) Botol 1 kultur Cyclotella sp. pada salinitas 22 ppt;
botol 2 Cyclotella sp. pada salinitas 27-28 ppt

Hasil penelitian menunjukkan, Cyclotella sp. yang dikultivasi pada salinitas 22 ppt
tumbuh lebih baik dibandingkan kultur Cyclotella sp. pada salinitas 27-28 ppt, seperti
diperlihatkan pada gambar 4.1. Kultur Cyclotella sp. 22 ppt mulai mengalami perubahan
warna pada hari ke-3 yang menandakan adanya pertumbuhan sel. Namun, kultur
Cyclotella sp. pada salinitas 27-28 ppt tidak mengalami perubahan warna hingga hari ke-
23. Cyclotella sp. selanjutnya dikultivasi dengan salinitas kultur 22 ppt. Kerapatan sel
optimum dicapai pada hari ke-12 sebesar 0,7×10 6 sel/mL atau 2,8 kali dari semula. Untuk
memperoleh biomassa yang besar, digunakan akuarium pada kultivasi Cyclotella sp.
dengan volume total 10L.

Gambar 4.2 Kultur Cyclotella sp.

Porphyridium cruentum dikultivasi pada salinitas 27-28 ppt dengan air laut 7,99.
Parameter pertumbuhan ini dipilih berdasarkan hasil penelitian yang telah dilakukan
Purnaningtyas pada tahun 2011. Jika dibandingkan dengan Cyclotella sp., pertumbuhan
Porphyridium cruentum lebih cepat sehingga pada hari ke-9 telah mencapai kerapatan sel
optimum. Kurva pertumbuhan Porphyridium cruentum diperlihatkan oleh gambar 4.2.
Dengan kerapatan sel awal 0,5×10 6 sel/mL, sel Porphyridium cruentum mencapai
kerapatan sel optimum pada hari ke-9 sebesar 22,05×10 6 sel/mL yaitu 44,1 kali dari
semula. Porphyridium cruentum tergolong mikroalga yang mudah beradaptasi dan dapat
bertahan dalam kondisi ekstrim serta serangan predator jika dibandingkan dengan
mikroalga jenis diatom yang membutuhkan waktu relatif lama dalam beradaptasi. Untuk
memperoleh biomassa yang besar, digunakan akuarium pada kultivasi Porphyridium
cruentum dengan volume total 20L.

(A) (B)
Gambar 4.3 Porphyridium cruentum.
Gambar (A) Sel Porphyridium cruentum mikroskopis, (B) Kultur Porphyridium cruentum

25
 Gambar 4.4 Kurva pertumbuhan Porphyridium cruentum

4.2 Biomassa Cyclotella sp. dan Porphyridium cruentum

Setelah mencapai kerapatan sel optimum, biomassa mmikroalga dikumpulkan melalui

proses pemanenan. Pemanenan dilakukan dengan menggunakan teknik sentrifugasi.
Teknik sentrifugasi mudah untuk dilakukan dan tidak membutuhkan waktu yang lama,
terutama bagi diatom yang sangat mudah mengendap. Biomassa Cyclotella sp. diperoleh
sebanyak 2,5521 g dengan kerapatan biomassa sebesar 0,51 g biomassa/L kultur.
Sementara biomassa basah Porphyridium cruentum diperoleh sebanyak 18,4437 g dengan
kerapatan biomassa 2,42 g biomassa/L kultur. Selanjutnya dilakukan pengeringbekuan
biomassa basah untuk menghilangkan kadar air yang berkisar 70-80%. Keberadaan kadar
air yang tinggi harus dihilangkan karena dapat menyebabkan biomassa rusak dan
berjamur (Annisa, 2014). Teknik pengeringbekuan ini sangat cocok untuk menjaga agar
biopigmen mikroalga yang sensitif terhadap suhu tidak rusak.

(A) (B)
Gambar 4.5 Biomassa kering
(A) Biomassa kering dari Cyclotella sp., (B) Biomassa kering dari Porphyridium cruemtm

26
4.3 Ekstrak Kasar Biopigmen Cyclotella sp. dan Porphyridium cruentum

Ekstraksi biomassa dilakukan untuk memperoleh ekstrak kasar biopigmen yang terdiri
dari klorofil dan karotenoid. Ekstrak kasar biopigmen berwarna hijau dan mudah
mengalami perubahan warna. Proses ekstraksi dilakukan dengan sessedikit mungkin
paparan cahaya, oksigen, suhu tinggi, karena hal ini dapat menyebabkan degradasi,
isomerasi, dan penyusunan ulang struktur biopigmen (Henriques, 2008). Ekstraksi
biopigmen dari mikroalga dilakukan menggunakan teknik homogenasi dengan pelarut
aseton p.a. Aseton digunakan sebagai pelarut dalam proses ekstraksi karena efektivitasnya
yang tinggi dalam mengekstrak biopigmen, pada hampir 90% organisme (Arar, 1997).
Proses ekstraksi dilakukan selama 5 siklus ( 1 siklus = 5 menit ekstraksi + 1 menit
istirahat) dengan perbandingan 5:1 (mL aseton : g biomassa kering) dan pergantian
pelarut setelah 5 siklus (setiap proses ekstraksi). Berdasarkan penelitian, ekstraksi
tersebut telah berhasil mengeluarkan seluruh biopigmen dalam sel mikroalga, dibuktikan
dengan warna aseton yang semakin bening setelah 5 kali ektraksi. Hal ini menunjukkan
aston tidak lagi mengikat biopigmen.

Gambar 4.6 Proses perubahan warna ekstrak kasar hasil ekstraksi

Ekstrak kasar biopigmen Cyclotella sp. mengandung komposisi ± 41% klorofil dan ±
59% karotenoid. Sementara ekstrak kasar Porphyridium cruentum mengandung
komposisi ± 68% klorofil dan ± 32% karotenoid. Perbedaan komposisi ini dapat
dipengaruhi oleh faktor cahaya. Intensitas cahaya yang tinggi dapat meningkatkan kadar
karotenoid dalam sel mikroalga sebab karotenoid berdifat fotoprotektif. Saat menerima
cahaya berlebih, sel akan terstimulasi untuk menghasilkan karotenoid yang dapat
menerap radiasi berlebih untuk melindungi pusat reaksi fotosintesis (Annisa, 2014).
Intesitas cahaya yang dibutuhkan mikroalga berbeda-beda, pada penelitian ini digunakan
intensitas cahaya 7000 Lux. Bagi Cyclotella sp. yang merupakan diatom dan terbiasa

27
berada didasar lautan, intesitas cahaya tersebut tergolong cukup tinggi sehingga
fotoprotektif karotenoid bekerja dan dihasilkan komposisi karotenoid yang lebih tinggi.

(A) (B)
Gambar 4.7 Ekstrak kasar biopigmen
(A) Ekstrak kasar biopigmen Cyclotella sp., (B) Ekstrak kasar biopigmen Porphyridium cruentum

Sebelum dilakukan pemurnian, ekstrak kasar biopigmen diuji kandungan biopigmennya

menggunakan teknik KLT 2 dimensi. Uji ini dimaksudkan untuk memperkirakan
biopigmen apa saja yang terdapat dalam ekstrak kasar. Eluen yang digunakan adalah
heksana : aseton (7:3). Eluen ini dipilih karena sifatnya yang tidak terlalu polar maupun
non polar. Merujuk ada penellitian sebelumnya, eluen yang sangat polar baik untuk
memisahkan komponen biopigmen dengan tingkat kepolaran tinggi seperti fukosantin,
diadinosantin, dan diatosantin. Sebaliknya eluan yang sangat non polar baik untuk
memisahkan komponen biopigmen dengan tingkat kepolaran yang lebih rendah seperti β-
karoten, klorofil a, dan feofitin a.

(A) (B)
Gambar 4.8 KLT ekstrak kasar biopigmen
(A) KLT ekstrak kasar biopigmen Cyclotella sp., (B) KLT ekstrak kasar biopigmen Porphyridium
cruentum

Ekstrak kasar biopigmen Cyclotella sp. menghasilkan 6 pita berwarna pada R f 0,99; 0,77;
0,44; 0,38; 0,33; dan 0,25 yang diperkirakan berturut-turut sebagai biopigmen β-karoten,
feofitin a, klorofil a, diatosantin, diadinosantin, dan fukosantin. Ekstrak kasar biopigmen

28
Porphyridium cruentum menghasilkan 4 pita pada Rf 0,89; 0,67; 0,44; dan 0,32 yang
diperkirakan sebagai biopigmen β-karoten, feofitin a, klorofil a, dan lutein. Nilai Rf atau
faktor retensi merupakan perbandingan jarak yang ditempuh sampel pada plat
dibandingkan jarak tempuh eluen. Biopigmen yang bersifat non polar akan mudah untuk
terelusi sehingga memiliki nilai Rf yang tinggi, sebaliknya biopigmen yang bersifat polar
akan terikat pada silika sehingga memiliki nilai Rf lebih rendah.

4.4 Biopigmen Murni Cyclotella sp. dan Porphyridium cruentum

Biopigmen murni diperoleh melalui proses pemurnian ekstrak kasar biopigmen

menggunakan teknik kromaografi kolom silika. Metode kromatografi kolom silika
memisahkan komponen berdasarkan kepolarannya. Biopigmen dengan kepolaran tinggi
akan terikat kuat pada fasa diam, sementara biopigmen degnan kepolaran lebih rendah
akan mudah terbawa oleh fasa geraknya. Fasa diam yang digunakan adalah silika,
sedangkan fasa gerak berupa eluen yaitu heksana : aseton. Pada proses elusi digunakan
teknik elusi gradien. Berdasarkan literatur, teknik ini telah sangat baik dalam memisahkan
biopigmen. Elusi gradien dilakukan dengan peningkatan kekuatan eluen yaitu dengan
meningkatkan kepolaran eluen secara bertahap selama proses elusi. Keuntungan dari
teknik elusi gradien ini adalah meningkatkan efisiensi pemisahan dengan mempersingkat
waktu pemisahan dan mengurangi jumlah pemakaian eluen.

(A) (B)
Gambar 4.8 Pemurnian ekstrak kasar biopigmen
(A) Kromatografi kolom silika, (B) Fraksi-fraksi hasil Pemurnian ekstrak kasar biopigmen
Cyclotella sp.

29
Gambar 2.1 Fraksi-fraksi hasil Pemurnian ekstrak kasar biopigmen Porphyridium
cruentum

30
31
 5 Kesimpulan

Sebelum sub bab, harus terdapat minimal satu paragraf (pengantar) yang menjelaskan
tentang isi sub bab.

5.1 Kesimpulan

Bab ini memuat elaborasi dan rincian kesimpulan yang dituliskan pada abstrak. Saran
untuk riset lanjutan serta practical implication dari kerja kandidat doktor dapat dituliskan
pada bab ini.

Setiap bab dimulai pada halaman baru. Cara menuliskan dan meletakkan bab dan judul
dilakukan seperti yang sudah dijelaskan pada bab VII.6 dalam pedoman ini.

5.2 Saran
 Daftar Pustaka

Baker, A.A., Sosro, K., dan Suditomo, B. (1998) : Pembakaran Hutan di Kalimantan,
Majalah Kehutanan, 5, 23 – 25.

Cotton, F.A. (1998) : Kinetics of Gasification of Brown Coal, Journal of American

Chemical Society, 54, 38 – 43.

Hill, R. (1997) : The Mathematical Theory of Plasticity, Oxford Press, Oxford, 545 – 547.

Kramer, A., Djubiantono T., Aziz, F., Bogard, J.S., Weeks, R. A., Weinand, D.C., Hames,
W.E., Elam, J.M., Durband, A.C, dan Agus (2005) : The First Hominid Fossil
Recovered from West Java, Indonesia, Journal of Human Evolution, 48, 661-
667.

Kumai,H., Itihara, M., Sudijono, Shibasaki, T., Aziz, F., Yoshikawa, S., Akahane,
S.,Soeradi, T., Hayashi, T., dan Furuyama, K. (1985) : Geology and Stratigraphy
of the Mojokerto Area, 55-61 dalam Watanabe, N., dan Kadar,D., Eds,
Quaternary Geology of the Hominid Fossil Bearing Formations in Java, 378 p.,
Geological Research and Development Centre, Bandung-Indonesia.

Stark, H. (1998) : The dynamics of surface adsorption, Proceedings of the International

Congress on Current Aspects of Quantum Chemistry, London, U.K., Carbo R.,
Editor, Prentice Hall, 24 – 36.

Wijaya, R. (1996) : Diagnosis Penyakit Tipus dengan Metode PCR, Disertasi

Program Doktor, Institut Teknologi Bandung, 25 – 29.

Pustaka dari Situs Internet :

Dillmann, T. dan Ruβ, J. (2001): Implicit Options in Life Insurance Contracts, the case of
lump sum options in differed annuity contracts,
http://www.actuaries.org/members/en/AFIR/colloquia/Tokyo/Dillman_
Ruβ.pdf,179-193, Download(diturunkan/diunduh) pada 5 September 2006.

Hardin, J. dan Rocke, D.M. (2002): The Distribution of Robust Distance,

http://www.cipic.ucdavis.edu/~dmrocke/preprints.html.,
download(diturunkan/diunduh) pada 25 Desember 2006.

Jorion, P. (1997): In Defense of VaR, http://www.gsm.uci.edu/jorion/oc/ntalib2.html,

Download (diturunkan/diunduh) pada 20 Desember 2006.

Wang, S. (2001): A Risk Measure that Goes Beyond Coherence,

http://www.stats.uwaterloo.ca/Stats_Dept/IIPR/2001-reports/IIPR-01-18.pdf.
Download (diturunkan/diunduh) pada 20 Desember 2006.

33
Catatan :

Seluruh pustaka yang ada pada daftar ini harus disebut/disitasi pada body text skripsi.

34
 LAMPIRAN

Lampiran A Contoh Halaman Lampiran

35
Lampiran B Contoh Halaman Lampiran Contoh Halaman Lampiran Contoh
Halaman Lampiran

36