REGULASI SITOKROM EKSPRESI P450 2e1 OLEH ETANOL: PERAN STRES

OKSIDATIF YANG DIMEDIASI JALUR PCK/JNK/SP1

ABSTRAK

CYP2E1 yang memetabolisme etanol sehingga terjadi roduksi darireactive oxygen species
(ROS) dan asetaldehida, diketahui tidak hanya menyebabkan kerusakan hati tetapi juga
memiliki toksisitas terhadap organ lain. Namun, jalur yang terlibat dalam regulasi CYP2E1 oleh
etanol tidak jelas, terutama pada sel-sel ekstrahepatik. Penelitian ini dirancang untuk menguji
peran CYP2E1 dalam stres oksidatif etanol dan sitotoksisitasnya, serta jalur pensinyalan di mana
etanol mengatur CYP2E1 pada sel ekstra-hepatik. Dalam penelitian ini, kami menggunakan garis
sel astrocytic dan monocytic, karena mereka adalah sel-sel penting dalam sistem saraf pusat.
Hasil kami menunjukkan bahwa 100mM etanol secara signifikan menginduksi stres oksidatif,
apoptosis, dan kematian sel pada 24 jam di garis sel astrocytic SVGA, yang diselamatkan oleh
inhibitor selektif CYP2E1, diallyl sulfide (DAS), CYP2E1 siRNA, dan antioksidan (vitamin C
dan E). Lebih lanjut, hasil kami menunjukkan bahwa DAS dan vitamin C menghambat etanol
mediasi (50mM) induksi CYP2E1 pada 6 jam, serta produksi ROS pada 2 jam, dipengaruhi oleh
peran stres oksidatif pada induksi etanol dari CYP2E1. Kami kemudian menyelidiki peran jalur
protein kinase C / c-Jun N-terminal kinase / spesifisitas protein1 (PKC / JNK / SP1) pada stres
oksidatif yang diperantarai induksi CYP2E1 . Hasil kami menunjukkan bahwa staurosporine,
inhibitor spesifik PKC, serta inhibitor spesifik PKCf dan PKCf siRNA, menghapus ekspresi
CYP2E1 yang diinduksi etanol. Selain itu, inhibitor JNK (SP600125) dan SP1 (mithramycin A)
benar-benar menghambat induksi CYP2E1 oleh etanol di astrocytes SVGA. Selanjutnya, kami
menunjukkan bahwa CYP2E1 juga bertanggung jawab untuk stres oksidatif yang dimediasi
etanol-dan kematian sel apoptosis di jalur sel monokitik U937. Akhirnya, hasil kami
menunjukkan bahwa jalur PKC / JNK / SP1 juga terlibat dalam pengaturan CYP2E1 pada sel
U937. Penelitian ini memiliki implikasi klinis sehubungan dengan toksisitas neuroinflammatory
akibat alkohol pada pengonsumsi alcohol.

Enzim sitokrom P450 (CYP) terdiri dari superfamili protein heme, yang memiliki peran utama
dalam fase I pembersihan metabolik dari kebanyakan xenobiotik di hati. Pada tingkat lebih
rendah, mereka juga terlibat dalam metabolisme xenobiotik di organ lain, seperti usus, otak, dan
ginjal. CYP2E1 diketahui memetabolisme etanol dalam hati, terutama pada pengguna alkohol
kronis, 2 namun, penggunaan alkohol yang terus-menerus dan metabolisme alkohol yang
dihasilkan diketahui menyebabkan toksisitas hati. 3 Keracunan hati yang dimediasi oleh
metabolisme alkohol terjadi melalui pembentukan oksigen reaktif spesies (ROS) dan metabolit
reaktif, asetaldehid, yang akhirnya menyebabkan kerusakan DNA dan oksidasi lipid dan protein.

Alkohol level rendah pada pengonsumsi alkohol-ringan sampai sedang, dimetabolisme terutama
oleh alkohol dehidrogenase (ADH), juga menyebabkan toksisitas hati yang dimediasi oleh stres
oksidatif.5 Namun, alkohol yang diinduksi CYP2E1 juga memiliki peran penting dalam
metabolisme alkohol dan menyebabkan kerusakan hati di antara berbagai peminum alkohol. 2
Meskipun peran CYP2E1 pada alkohol menyebabkan toksisitas hati sudah diketahui, ada studi
serupa yang penelitiannya terbatas pada sel ekstra-hati, terutama sel-sel dari CNS. Hasil dari
penelitian tesebut menunjuakan bahwa dalam neuron dan monosit / makrofag, keterlibatan
CYP2E1 dalam metabolisme alkohol lebih besar daripada ADH, karena ADH hadir pada tingkat
yang sangat rendah dalam sel-sel ini.6,7 Hipotesis ini lebih lanjut diperkuat oleh fakta bahwa
ADH diinduksi jauh lebih sedikit daripada CYP2E1 oleh alkohol di hati maupun di organ lain.8
Induksi CYP2E1 oleh alkohol tampaknya melalui translasi, pasca-translasi (stabilisasi protein),
dan mekanisme transkripsi. Konsentrasi rendah alkohol, CYP2E1 menunjukkan peningkatan
aktivitas dan peningkatan stabilitas protein. Namun, pada konsentrasi tinggi alkohol, baik mRNA
dan tingkat ekspresi protein CYP2E1 diinduksi. Meskipun stabilisasi pasca-translasi protein
CYP2E1 dan peningkatan aktivitas oleh alkohol telah dijelaskan, 9 mekanisme di mana ekspresi
CYP2E1 diatur pada tingkat transcription yang kurang dipahami.

HASIL

Di otak, CYP2E1 adalah satu-satunya enzim yang terlibat dalam oksidasi non-katalase etanol
dan produksi ROS.10 Induksinya mengarah pada peningkatan peroksidasi lipid dan apoptosis,
yang mengakibatkan peningkatan permeabilitas blood–brain barrier dan neurodegenerasi.11
Namun, pada peran CYP2E1 dalam efek etanol-mediated pada astrosit manusia, yang merupakan
jenis sel utama di otak dan peran utamanya adalah untuk melindungi integritas saraf.12,13
astrosit aktif, terutama melalui peningkatan stres oksidatif oleh alkohol, dapat menyebabkan
kerusakan saraf. Demikian pula, informasi terbatas tersedia pada monosit berkaitan dengan
alkohol / CYP2E1. Monosit menyusup ke otak dan berdiferensiasi menjadi mikroglia dan
makrofag perivaskular, yang juga merupakan jenis sel utama di otak. Studi ini telah dirancang
untuk menguji peran CYP2E1 dalam efek etanol-mediasi pada astrosit dan monosit. Oleh karena
itu, dalam penelitian ini, kami menggunakan SVGA astrocytic dan U937 jalur sel monocytic
manusia untuk menyelidiki peran CYP2E1 dalam stres oksidatif etanol-mediated, apoptosis,
kematian sel, dan mekanisme dimanaetanol mengatur ekspresi CYP2E1.

Peran CYP2E1 dalam apoptosis yang dimediasi oleh stres oksidatif dan kematian sel oleh
etanol pada astrocytes SVGA. Seperti yang sebelumnya ditunjukkan pada sel monokitik U937,
15 kami menguji apakah etanol juga menginduksi ROS dalam astrosit SVGA pada 100mM
etanol (mendekati konsentrasi fisiologis pada peminum pesta) pada 12-36 jam. Perlakuan
tunggal dari 100mM etanol menginduksi produksi ROS sebesar 420% pada 24 dan 36 jam
(Gambar 1a). Lebih lanjut, untuk memeriksa apakah CYP2E1 bertanggung jawab untuk
pembangkitan ROS, kami menghambat ekspresi CYP2E1 melalui transfeksi menggunakan 10
nM CYP2E1 siRNA yang telah didesain sebelumnya dan 10 nM scrambled siRNA sebagai
kontrol. Secara keseluruhan, 10 nM CYP2E1 siRNA secara efektif mengurangi ekspresi protein
CYP2E1 (Gambar 1b, panel kanan), yang secara signifikan mengurangi efek etanol yang
menginduksi pembentukan ROS pada 24 jam (Gambar 1b, sisi kiri). Meskipun tidak signifikan,
CYP2E1 siRNA sendiri sedikit meningkatkan tingkat ROS dibandingkan dengan siRNA acak.
Hasil ini menunjukkan peran CYP2E1 dalam produksi ROS yang diinduksi etanol pada
astrocytes SVGA.

Pembelahan caspase-3 adalah penanda awal apoptosis, kami memeriksa aktivitas pembelahan
caspase-3 pada pengobatan etanol 100mM selama 24 jam pada astrocytes SVGA. Hasil
penelitian menunjukkan bahwa etanol meningkatkan aktivitas pembelahan caspase-3 lebih dari
dua kali lipat dibandingkan dengan kontrol. Selain itu, menjatuhkan ekspresi CYP2E1 melalui
CYP2E1 siRNA hampir sepenuhnya menghilangkan efek etanol pada pembelahan caspase-3
(Gambar 1c). Selanjutnya, diallyl sulfide (DAS), penghambat kimia selektif CYP2E1, yang juga
merupakan aditif makanan dan memiliki efek protektif pada sel-sel kekebalan tubuh, 16
menghilangkan apoptosis yang diinduksi etanol (Gambar 1d). Selain itu, 100 mM vitamin C,
serta vitamin E, memblokir efek etanol pada induksi aktivitas pembelahan caspase-3 (Angka 1e
dan f), menunjukkan bahwa apoptosis diinduksi etanol-dimediasi melalui produksi ROS.
Vitamin C sendiri juga menunjukkan penurunan aktivitas pembelahan caspase-3 dibandingkan
dengan kontrol, dan tampaknya lebih efektif daripada vitamin E. Namun, anti-oksidan lainnya
yang diuji, N-acetyl cysteine (NAC) dan butylated hydroxyltoluene (BHT), tidak mengurangi
apoptosis yang diinduksi etanol, tetapi lebih lanjut menyebabkan aktivitas pembelahan caspase-3
dalam kombinasi dengan etanol (Gambar Tambahan S1). Oleh karena itu, kami menggunakan
vitamin C sebagai antioksidan dalam eksperimen berikutnya.

Untuk lebih mengkonfirmasi efek etanol, serta peran CYP2E1 dan stres oksidatif pada apoptosis,
terminaldeoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling (TUNEL) assay dilakukan pada
astrocytes SVGA. Hasil penelitian menunjukkan bahwa 24 jam perlakuan etanol pada 100 mM
secara signifikan meningkatkan pembentukan fragmen DNA (Gambar 1g). Meskipun DAS
sendiri menunjukkan beberapa fragmentasi DNA, baik DAS dan vitamin C secara efektif
mengurangi fragmentasi DNA terinduksi etanol pada astrocytes SVGA (Gambar 1g). Akhirnya,
kami menguji apakah DAS dan anti oksidan menyelamatkan kematian sel diinduksi etanol
menggunakan MTT assay. Etanol menunjukkan waktu- (12-48 jam) dan efek dosis terikat (100-
200mM) pada kematian sel astrocytes SVGA (Tambahan Angka S2A dan B). Lebih lanjut,
100mM etanol menunjukkan kematian sel 27%, yang diselamatkan oleh DAS dan vitamin C
(Gambar 1h). Serupa dengan TUNEL assay, DAS sendiri menyebabkan kematian sel B15%
dibandingkan dengan kontrol. Meskipun DAS memiliki efek perlindungan, 16 juga diketahui
menyebabkan toksisitas pada konsentrasi tinggi dan ketika digunakan untuk waktu yang lebih
lama.17 Oleh karena itu, kami melakukan percobaan berikutnya menggunakan CYP2E1 siRNA
untuk menilai spesifisitas DAS. Mirip dengan peningkatan stres oksidatif oleh CYP2E1 siRNA
saja (Gambar 1b), itu juga menyebabkan kematian sel yang signifikan (Tambahan Gambar S2C),
menunjukkan bahwa tingkat basal CYP2E1 diperlukan untuk kelangsungan hidup sel. Bahkan,
peran fisiologis CYP2E1 didokumentasikan dalam metabolisme dopamin dan faktor-2 terkait
faktor 2-induksi nuklir dalam sel-sel otak.18-20 Namun, seperti yang diharapkan, CYP2E1
siRNA menghapuskan kematian sel yang diakibatkan etanol (Supplementary Figure S2C).
Secara keseluruhan, hasil kami jelas menunjukkan peran CYP2E1 dan ROS dalam apoptosis dan
kematian sel etanol yang diinduksi di astrosit SVGA.
Upregulation dari ekspresi CYP2E1 oleh stres oksidatif etanol di astrocytes SVGA. Tingkat
basal ekspresi mRNA enzim CYP sebelumnya terdeteksi pada astrocytes SVGA. Dibandingkan
dengan dua enzim CYP yang paling melimpah, CYP2A6 (56%) dan CYP1A1 (43%), CYP2E1
menunjukkan ekspresi mRNA yang relatif rendah (3%). Namun, tingkat relatifnya dalam
astrocytes SVGA dibandingkan dengan CYPs lainnya mirip dengan yang ada di hati.22
Selanjutnya, seperti yang sebelumnya ditunjukkan pada sel monocytic U937, 15 kami
menyelidiki apakah etanol menginduksi CYP2E1 di astrocytes SVGA. Hasil awal menunjukkan
bahwa 50mM etanol optimal untuk menginduksi CYP2E1 hingga 24 jam (data tidak
ditampilkan). Konsentrasi etanol pada Z100mM menyebabkan kematian sel yang signifikan pada
astrocytes SVGA (Tambahan Angka S2A dan B). Oleh karena itu, kami menggunakan 100mM
etanol untuk stress oksidatif, apoptosis, dan percobaan kematian sel pada 24 jam (Gambar 1),
sementara kami menggunakan 50mM etanol untuk memeriksa induksi CYP2E1 pada astrocytes
SVGA (Gambar 2). Profil kinetik ekspresi CYP2E1 menunjukkan bahwa 50mM etanol
menghasilkan upregulasi signifikan CYP2E1 mRNA pada 3 jam (4150%) dan 6 jam (o150%)
dibandingkan dengan kontrol (Gambar 2a). Etanol juga menunjukkan 150% peningkatan
ekspresi protein CYP2E1 pada 6 jam, dibandingkan dengan kontrol (Gambar 2b). Baik mRNA
dan tingkat ekspresi protein CYP2E1 menurun ke tingkat kontrol pada Z12 jam.
Gambar 1. Peran CYP2E1 dalam apoptosis yang dimediasi oleh stres oksidatif dan kematian sel oleh etanol pada
astrocytes SVGA. (A) Pengaruh etanol 100mM pada produksi ROS dalam 12-36 jam. (B) Pengaruh CYP2E1 kecil
mengganggu RNA (siRNA) pada produksi ROS dimediasi etanol pada 24 jam. (c) Pengaruh CYP2E1 siRNA pada
aktivitas pembelahan caspase-3 pada 24 jam. (D) Pengaruh DAS 100 mM pada aktivitas pembelahan caspase-3 pada
24 jam. (e) Pengaruh vitamin C pada aktivitas pembelahan caspase-3 pada 24 jam. (f) Pengaruh vitamin E pada
aktivitas pembelahan caspase-3 pada 24 jam. (G) Pengaruh DAS dan vitamin C pada fragmentasi DNA
menggunakan TUNEL assay pada 24 jam. (H) Pengaruh DAS dan vitamin C pada kematian sel menggunakan MTT
(3- [4,5 dimethylthiazol-2-yl] -2,5-diphenyltetrazolium bromide) assay pada 24 jam. Astrocytes SVGA diinkubasi
dengan 100mM etanol setelah CYP2E1 siRNA atau pengacakan siRNA transfection atau dalam ketiadaan dan
keberadaan DAS, vitamin C, atau pengukuran vitamin E. ROS, aktivitas pembelahan caspase-3, uji TUNEL, uji
MTT, dan transfeksi SiRNA dijelaskan. dalam Bahan dan Metode. ROS disajikan sebagai persentase intensitas
fluoresensi rata-rata (% MFI), dengan 100% (1000 MFI) dinormalkan untuk setiap kontrol. LKM untuk kontrol pada
titik waktu yang berbeda tidak berbeda secara signifikan. Kematian sel juga dinormalisasi sebagai 100% untuk
kontrol (tanpa perawatan). Kegiatan caspase-3 disajikan dalam unit absolut. Warna hijau dalam TUNEL assay
mewakili fragmentasi DNA. Nilai Pr0.05 (*) dihitung dengan perbandingan perlakuan etanol dengan kontrol
masing-masing seperti yang disajikan. Berarti ± SD dihitung dari setidaknya tiga percobaan dan signifikansi
ditentukan menggunakan analisis satu arah varians.

Untuk menguji apakah induksi CYP2E1 dikaitkan dengan metabolisme etanol yang dimediasi
produksi ROS, kami mengukur produksi ROS pada titik waktu awal hingga 4 jam dalam ada
tidaknya etanol 50mM dalam astrosit SVGA (Gambar 2c). Data menunjukkan bahwa produksi
ROS meningkat pada 2 jam (430%) oleh perlakuan etanol. Hasil ini konsisten dengan
pengamatan lain, di mana pengobatan nikotin juga menghasilkan ROS pada titik-titik awal (30
menit –2 jam) di astrocytes SVGA.21 Untuk melengkapi temuan di Gambar 1a, kami
menggunakan 100mM etanol pada 1 dan 2 jam, yang menunjukkan peningkatan yang lebih
tinggi dalam ROS (Gambar Tambahan S3) daripada ROS yang dihasilkan pada 50mM etanol
(Angka 2c dan d). Seperti yang diharapkan, inhibitor selektif CYP2E1, DAS, secara signifikan
menurunkan stres oksidatif yang diinduksi etanol pada 2 jam (Gambar 2d), menunjukkan peran
CYP2E1 dalam produksi ROS oleh metabolisme etanol. Selanjutnya, untuk menentukan apakah
metabolisme etanol dimediasi CYP2E1 dan produksi ROS berikutnya bertanggung jawab untuk
induksi CYP2E1, astrosit SVGA yang sebelumnya menggunakan DAS 100 mM dan vitamin C
diikuti dengan pengobatan etanol selama 6 jam. DAS secara signifikan mengurangi etanol yang
menyebabkan induksi CYP2E1 pada mRNA dan level protein (Gambar 2e dan f). Demikian
pula, 100mM vitamin C juga menghapuskan induksi etanol dari mRNA CYP2E1 serta protein
(Gambar 2g dan h). DAS dan vitamin C saja tidak mengubah ekspresi CYP2E1 secara
signifikan. Untuk mengetahui bahwa CYP2E1 adalah enzim utama yang bertanggung jawab
untuk metabolisme etanol di astrocytes SVGA, kami mengukur ADH mRNA di astrocytes.
Namun, tingkat ADH di astrocytes SVGA tidak terdeteksi. Hasil ini menunjukkan bahwa
ekspresi CYP2E1 diinduksi etanol melalui metabolismenya dan produksi ROS selanjutnya.

Regulasi ekspresi CYP2E1 oleh etanol melalui jalur PKC / JNK / SP1 pada astrocytes SVGA.
Untuk menentukan mekanisme yang mendasari induksi CYP2E1 yang dimediasi oleh etanol,
astrosit SVGA diberi pretreatment dengan staurosporine, inhibitor protein kinase C (PKC), serta
pengahambat dari inhibitor c-Jun N-terminal kinase (JNK) (SP600125) dan Inhibitor mitogen-
activated protein kinase kinase (MEK) (U0126). Staurosporine menghambat induksi etanol dari
CYP2E1 mRNA dan protein (Gambar 3a dan b). Selain itu, sementara inhibitor JNK
menghambat induksi etanol yang merangsang CYP2E1 (Angka 3c dan d), inhibitor MEK tidak
menunjukkan efek (Gambar Tambahan S4A). Selanjutnya, karena PKCz adalah subtipe utama
pada family PKC yang memediasi aktivasi JNK, 23 kami menguji apakah inhibitor selektif
PKCz (PKCz pseudo-substratinhibitor (PPSI)), serta PKCz siRNA, membatalkan ekspresi
CYP2E1 ethanolmediated di astrocytes SVGA. Seperti yang diharapkan, 10 mM PPSI secara
signifikan mengurangi ekspresi mRNA CYP2E1 yang diinduksi oleh etanol (Gambar 3e) dan 10
nM PKCz siRNA sepenuhnya memblokir ekspresi mRNA CYP2E1 yang diinduksi etanol
(Gambar 3f). Secara keseluruhan, hasil ini menunjukkan bahwa ekspresi CYP2E1 diatur oleh
aktivasi jalur PKC / JNK.
Untuk pemeriksaan lebih lanjut faktor transkripsi yang terlibat dalam induksi CYP2E1 yang
dimediasi etanol, 10 mM pomalidomide, penghambat selektif CCAAT / protein pengikat
penguat-b (C / EBP-b), dan mithrimycin A 200nM, inhibitor selektif yang selektif protein 1
(SP1), digunakan dalam astrocytes SVGA, diikuti oleh pengobatan dengan 50mM etanol.
Meskipun mithrimycin A sendiri sedikit menurunkan pengaturan ekspresi mRNA CYP2E1,
kerjanya benar-benar menghilangkan induksi etanol dari CYP2E1 (Gambar 4a). Sebaliknya,
meskipun pomalidomide sendiri juga mengurangi ekspresi CYP2E1, itu tidak mengubah etanol
yang merangsang induksi CYP2E1 (Gambar 4b), terlepas dari fakta bahwa pomalidomide
mengurangi ekspresi protein C / EBP-b (Gambar 4c). Dengan demikian, hasil kami menunjukkan
bahwa SP1 tidak bertanggung jawab atas pengaturan CYP2E1.
Gambar 2. Upregulation ekspresi CYP2E1 oleh stres oksidatif etanol-dimediasi di astrocytes SVGA. Efek etanol
50mM pada CYP2E1 (a) mRNA dan (b) Pengaruh etanol 50mM pada produksi ROS pada 1–4 jam. (c) ekspresi
protein pada 1–24 jam. (D) Pengaruh DAS dalam produksi ROS yang dimediasi etanol pada 2 jam. Pengaruh DAS
pada etanol yang diinduksi CYP2E1 (e) mRNA dan (f) ekspresi protein. Pengaruh vitamin C pada etanol-diinduksi
CYP2E1 (g) mRNA dan (h) ekspresi protein. Tingkat ekspresi mRNA dan protein dievaluasi pada 3 dan 6 jam,
masing-masing, dan disajikan dalam persentase, dengan ekspresi 100% dinormalisasi untuk sel yang tidak diobati
pada setiap titik waktu. Ekspresi setiap gen dinormalisasi menggunakan GAPDH (gliseraldehid 3-fosfat
dehidrogenase), sedangkan b-tubulin digunakan sebagai kontrol internal untuk ekspresi protein. ROS disajikan
sebagai persentase intensitas fluoresensi rata-rata (% MFI), dengan 100% (1000 MFI) dinormalkan untuk setiap
kontrol. LKM untuk kontrol pada titik waktu yang berbeda tidak bervariasi secara signifikan. Nilai Pr0.05 (*) untuk
setiap perbandingan disajikan. Berarti ± SD dihitung dari setidaknya tiga percobaan dan signifikansi ditentukan
dengan menggunakan analisis oneway varian.

Gambar 3. Peran jalur PKCz / JNK pada etanol dimediasi CYP2E1 induksi di astrocytes SVGA. Pengaruh
staurosporine (PKC inhibitor) pada etanol-diinduksi CYP2E1 (a) mRNA dan (b) ekspresi protein. Pengaruh
SP600125 (inhibitor JNK) pada etanol-diinduksi CYP2E1 (c) mRNA dan (d) ekspresi protein. Pengaruh (e) PPSI
(PKCz inhibitor), dan (f) PKCz kecil mengganggu RNA (siRNA) pada ekspresi mRNA CYP2E1. mRNA dan
ekspresi protein dievaluasi pada 3 dan 6 jam, masing-masing, di hadapan 100mM etanol (/ þ inhibitor atau
siRNA). Perlakuan inhibitor dan transfusi siRNA dijelaskan dalam Bahan dan Metode. Tingkat ekspresi mRNA dan
protein disajikan dalam persentase, dengan ekspresi 100% dinormalkan untuk sel yang tidak diobati. Ekspresi setiap
gen dinormalisasi menggunakan glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH), sedangkan b-tubulin atau
GAPDH digunakan sebagai kontrol internal untuk ekspresi protein. Nilai Pr0.05 (*) untuk setiap perbandingan
disajikan. Mean ± SD dihitung dari setidaknya tiga.

Peran CYP2E1 dalam kematian sel yang diperantarai oleh stress oksidatif oleh etanol pada
monosit U937. Seperti ditunjukkan pada astrocytes SVGA (Angka 1c-g), kami memeriksa peran
CYP2E1 dan vitamin C pada apoptosis dalam monocyte U937 menggunakan uji annexin V
dalam kondisi yang berbeda sehubungan dengan waktu perawatan dan konsentrasi etanol. Etanol
menunjukkan peningkatan kecil dalam apoptosis, yang sampai batas tertentu, diselamatkan oleh
DAS, vitamin C, dan vitamin E (Gambar Tambahan S5). Namun, perubahan dalam hasil ini tidak
konklusif. Selanjutnya, kami melakukan uji kematian sel menggunakan etanol 200mM pada 48
jam (kondisi optimal), yang menunjukkan 415% kematian sel (Gambar 5). Seperti yang
diharapkan 100 mM DAS serta 100 mM antioksidan (vitamin C dan E) keduanya
menyelamatkan kematian sel yang disebabkan oleh 100mM etanol (Gambar 5). Tidak seperti
astrocytes SVGA (Gambar 1), DAS tidak menyebabkan kematian sel yang signifikan dalam
monosit U937 (Gambar 5). Namun, mirip dengan astrocytes SVGA, vitamin C relatif lebih
efektif daripada vitamin E pada monosit U937.

Pengaturan ekspresi CYP2E1 oleh etanol melalui jalur PKC / JNK / SP1 yang diperantarai
stres oksidatif pada monosit U937. Seperti pada astrocytes SVGA, kami menyelidiki
mekanisme yang dimana CYP2E1 diatur oleh etanol dalam monosit U937. Hasil penelitian
menunjukkan bahwa DAS dan vitamin C menghambat ekspresi mRNA CYP2E1 yang diinduksi
etanol (Gambar 6a dan b). Perawatan sel U937 dengan DAS atau vitamin C juga sedikit
meningkatkan ekspresi CYP2E1. Demikian pula, inhibitor PKC (staurosporine), inhibitor JNK
(SP600125), dan penghambat SP1 (Mithramycin A), menghilangkan ekspresi etanol yang
diinduksi etanol CYP2E1 (Angka 7c-e). Inhibitor ini tidak menunjukkan efek apa pun pada
tingkat basal dari ekspresi CYP2E1. Mirip dengan astrocytes SVGA, MEK inhibitor (U0126)
(Tambahan Gambar S4B) dan C / EBP-b inhibitor (pomalidomide) (Gambar 4b), inhibitor ini
tidak mengubah induksi ekspresi mRNA CYP2E1 oleh etanol dalam monosit U937 (Gambar 6f).
Dengan demikian, ekspresi CYP2E1 juga diatur oleh aktivasi dari jalur PKC / JNK / SP1 yang
diinduksi oleh stres oksidatif dalam monosit U937.

DISKUSI
Beberapa penelitian in vitro dan in vivo yang telah dilaporkan sebelumnya telah menunjukkan
bahwa konsumsi alkohol akut dan kronis meningkatkan ekspresi CYP2E1, yang menyebabkan
toksisitas hati.2,8,24–28 Meskipun induksi CYP2E1 bermediasi etanol, serta kerusakan oksidatif
yang diperantarai CYP2E1 melalui Metabolisme etanol di hati, 2,8,29 jalur mekanik dalam
induksi CYP2E1 etanol terkait di hati serta sel ekstra hati tetap tidak jelas. Ini adalah laporan
pertama yang memberikan bukti kuat keterlibatan jalur PKC / JNK / SP1 dalam pengaturan
CYP2E1yang dimediasi etanol di astrocytes dan monocytes (Gambar 7). Ini juga merupakan
laporan pertama yang menunjukkan peran CYP2E1 dalam kematian sel apoptosis stres oksidatif
pada sel ekstra-hati ini.

Gambar 4. Peran faktor transkripsi SP1 pada etanol yang memediasi induksi CYP2E1 di astrocytes SVGA.
Pengaruh (a) mithrimycin A (inhibitor SP1) dan (b) pomalidomide (inhibitor C / EBP b) pada ekspresi mRNA
CYP2E1 yang diinduksi etanol. (c) Pengaruh pomalidomide pada ekspresi protein C / EBP-b. Tingkat ekspresi
mRNA dievaluasi pada 3 jam di hadapan 50mM etanol (/ þ mithrimycin A atau pomalidomide). Hasilnya
disediakan dalam persentase, di mana ekspresi 100% dinormalkan untuk kontrol. Nilai Pr0.05 (*) untuk setiap
perbandingan disajikan. Mean ± SD dihitung dari setidaknya tiga percobaan dan signifikansi ditentukan
menggunakan analisis satu arah varians.
Gambar 5. Peran CYP2E1 dalam kematian sel yang diperantarai stres oksidatif oleh etanol dalam monosit U937.
Grafik batang menunjukkan persentase kematian sel menggunakan MTT (3- [4,5-dimethylthiazol-2-yl] -2,5-
diphenyltetrazolium bromide) assay. Perlakuan etanol 200mM dilakukan dalam ada tidaknya DAS, vitamin C, atau
vitamin E, diikuti dengan pengukuran kematian sel (MTT assay) setelah 48 jam. Tes MTT dijelaskan dalam Bahan
dan Metode. Nilai Pr0.05 (*) untuk setiap perbandingan disajikan. Berarti ± SD dihitung dari setidaknya tiga
percobaan dan signifikansi ditentukan menggunakan analisis satu arah varians
Gambar 6. Peran jalur PKC / JNK / SP1 pada etanol dimediasi CYP2E1 induksi pada monosit U937. Pengaruh (a)
DAS, (b) vitamin C, (c) staurosporine, (d) SP60012, (e) mithrimycin A, dan (f) pomalidomide pada ekspresi mRNA
CYP2E1 yang diinduksi etanol. Data ini dievaluasi pada 12 jam di hadapan 100mM etanol. Hasilnya disediakan
dalam persentase, di mana ekspresi 100% dinormalkan untuk kontrol. Nilai Pr0.05 (*) untuk setiap perbandingan
disajikan. Mean ± SD dihitung dari setidaknya tiga percobaan dan signifikansi ditentukan menggunakan analisis satu
arah varians
Gambar 7. Representasi skematik dari CYP2E1 memediasi produksi ROS oleh etanol, diikuti oleh aktivasi jalur
PKCz / JNK / SP1 untuk ekspresi CYP2E1 (merah). Inhibitor yang menghambat jalur spesifik ekspresi CYP2E1
disajikan dalam warna biru. ADALAH, elemen respons anti-oksidan; Nrf2, faktor-2 terkait faktor-2 nuklir; SMAF,
faktor aktivasi molekul kecil

CYP2E1 telah diketahui menjadi enzim penghasil alkohol utama di otak, dan ini dikaitkan
dengan kerusakan oksidatif di otak.10,30 CYP2E1 juga telah terbukti memiliki peran penting
dalam peroksidasi lipase yang dimediasi etanol di otak, yang menyebabkan peningkatan
permeabilitas BBB dan disfungsi mitokondria.10,11 Konsisten dengan pengamatan ini,
penelitian kami sebelumnya telah menunjukkan bahwa etanol meningkatkan regulasi CYP2E1
pada jalur sel U937 dan ekspresinya dikaitkan dengan peningkatan stres oksidatif.15 Karena
tingkat ADH tidak terdeteksi di Sel U937, CYP2E1 telah disarankan untuk menjadi enzim utama
yang bertanggung jawab dalam stres oksidatif etanol-dimediasi dalam monosit. Demikian pula,
dalam penelitian ini, kami mendemonstrasikan peningkatan regulasi CYP2E1 oleh etanol pada
astrocytes SVGA. Selanjutnya, kami menunjukkan bahwa CYP2E1 bertanggung jawab untuk
produksi ROS yang dimediasi etanol dan kematian sel apoptosis pada astrocytes SVGA serta
monocytes U937.

Pengamatan kami bahwa pengobatan etanol akut menginduksi ekspresi CYP2E1 sekitar 1,5 kali
lipat dalam astrosit SVGA adalah signifikan dan konsisten dengan pengamatan kami sebelumnya
pada sel U937, 15 serta dengan observasi dari penelitian lain.31,32 Namun, pada monosit primer
alkohol kronis pengguna, ekspresi mRNA CYP2E1 menunjukkan induksi B10 (intubasi yang
tidak dipublikasikan) dibandingkan dengan individu yang sehat, yang konsisten dengan induksi
CYP2E1 hati pada pengguna alkohol kronis.27,33 Persistensi induksi CYP2E1 oleh konsumsi
alkohol pada pengguna kronis diketahui untuk meningkatkan pembentukan ROS, yang
menghambat dehidrogenase asetaldehida yang menghasilkan akumulasi asetaldehida. Selain
ROS, yang diketahui merusak DNA dan protein, asetaldehida berhubungan dengan penurunan
perbaikan DNA, gangguan pemanfaatan oksigen hati, dan peningkatan deplesi glutathione.
Akumulasi acetaldehyde diketahui memiliki peran kunci dalam kerusakan otak yang diinduksi
etanol. Karena ADH tidak terlibat dalam metabolisme alkohol di otak, 10 CYP2E1 tampaknya
memiliki peran dominan dalam kerusakan otak yang dimediasi etanol. Hasil kami dari astrocytes
dan monocytes, yang merupakan jenis sel utama yang diperlukan untuk fungsi otak, memberikan
dukungan lebih lanjut untuk hipotesis ini.

Meningkatnya stres oksidatif oleh induksi CYP2E1 diketahui sebagai konsekuensi utama
toksisitas hati yang dimediasi etanol. Satu dosis tunggal etanol ditemukan untuk menginduksi
superoksida dismutase, katalase, dan glutathione S-transferase sebagai hasil dari produksi ROS,
yang melindungi terhadap stres oksidatif. Namun, paparan alkohol kronis menyebabkan
penurunan ekspresi superoksida dismutase dan katalase, 35,36 sementara induksi CYP2E1 yang
diperantarai alkohol dan metabolisme alkohol selanjutnya menyebabkan peningkatan lebih lanjut
dalam produksi ROS dan asetaldehida, terutama di mitokondria. 37 Pengamatan kami
menunjukkan bahwa etanol menginduksi produksi ROS (melalui metabolisme etanol dimediasi
CYP2E1), yang mengarah ke induksi CYP2E1, yang selanjutnya menghasilkan ROS,
menyebabkan apoptosis sel dan kematian. Hasil kami pada efek vitamin C dan E konsisten
dengan pengamatan bahwa penggunaan suplemen antioksidan, seperti vitamin C dan E,
memberikan efek terapeutik dengan mengurangi stres oksidatif pada penyakit hati yang
diinduksi alkohol. 38 Dalam penelitian kami, vitamin C dan E keduanya membatalkan apoptosis
yang dimediasi etanol dan kematian sel di astrocytes dan monocytes. Dengan demikian,
penelitian kami juga mendukung penggunaan antioksidan, terutama vitamin C, dalam mencegah
toksisitas sel yang dimediasi alkohol.
stress oksidasi yang diperantarai oleh alkohol telah ditunjukkan untuk menginduksi enzim
antioksidan melalui jalur pensinyalan PKC untuk meniadakan efek stres oksidatif.39,40 Namun,
penggunaan alkohol yang konsisten juga diketahui menyebabkan toksisitas yang diinduksi
alkohol dan kerusakan hati melalui jalur PKC. 0,41 Hasil kami konsisten dengan pengamatan
bahwa stres oksidatif etanol-mediasi menginduksi CYP2E1 melalui jalur PKC, yang selanjutnya
memetabolisme etanol dan menghasilkan ROS (Gambar 7). Aktivasi PKC oleh peningkatan stres
oksidatif mengarah ke fosforilasi protein hilir dan induksi kaskade sinyal hilir.39-41 Penelitian
sebelumnya telah menunjukkan bahwa etanol dapat menginduksi beberapa kaskade sinyal dan
faktor-faktor transkripsi, seperti mitogen-associated protein kinase dan nuclear factor kappa-
light-chain-enhancer dari sel B aktif (NF-kB), yang memiliki peran penting dalam pelepasan
sitokin dan induksi inflamasi. 42 Penelitian lain telah menunjukkan bahwa lipopolisakarida-
dimediasi induksi CYP2E1 di astrocytes dikaitkan dengan aktivasi MEK3 dan C / EBP-b, 43
sementara di hepatosit baik SP1 dan NF-kB terlibat dalam pengaturan CYP2E1.44 Namun,
penelitian kami jelas menunjukkan peran PKC / JNK / Jalur SP1 dalam regulasi etanol-dimediasi
ekspresi CYP2E1 (Gambar 7).

Staurosporin diketahui untuk mengikat PKC, yang mengarah ke penghambatan fosforilasi

protein MEK dan JNK.41,45 Hasil kami menggunakan staurosporine dan SP600125 (inhibitor
JNK) jelas menunjukkan bahwa fosforilasi JNK, tetapi tidak MEK, mengatur induksi CYP2E1
bermediasikan etanol di U937 monosit dan astrocytes SVGA. Konsisten dengan pengamatan
sebelumnya, 23 temuan kami juga menunjukkan bahwa PKCz adalah subtipe utama keluarga
PKC yang memediasi aktivasi JNK. Berkenaan dengan keterlibatan faktor transkripsi dalam
induksi CYP2E1, c-Jun telah dilaporkan sebelumnya mengikat C / EBP-b dan bertindak sebagai
aktivator transkripsi.46 C / EBP-b juga diketahui terlibat dalam kedua interleukin ( IL) -4-
mediated CYP2E1 regulasi dan apoptosis sel.47,48 Selanjutnya, SP1 transactivation, yang juga
dikenal untuk berinteraksi dengan c-Jun, telah terbukti mengikat promotor CYP2E1,44 serta
terlibat dalam etanol induksi segera protein heat-shock 70,49 Konsisten dengan pengamatan ini,
hasil kami jelas menunjukkan bahwa SP1, tetapi tidak C / EBP-b, terlibat dalam PKC / JNK
memediasi regulasi ekspresi CYP2E1 di astrocytes dan monocytes. Temuan kami dari asosiasi
JNK dengan etanol CYP2E1 induksi memiliki implikasi dalam penargetan jalur JNK / SP1 untuk
intervensi terapeutik baru untuk pengobatan neurotoksisitas pada pengguna alcohol.

Selain CYP2E1 (penelitian kami), pro-inflamatory cytokines, seperti IL-1b dan tumor necrosis
factor-a, juga diinduksi oleh alkohol.50,51 Alkohol yang meningkatkan regulasi sitokin
proinflamatory terjadi melalui jalur MAP kinase (ERK1 / 2, p-38, dan JNK), yang memicu
aktivasi hilir faktor transkripsi sensitif-oksidan NF-kB dan AP-1.50 Jalur-jalur ini terkait dengan
peningkatan apoptosis pada tikus yang diberi etanol (korteks serebri) dan pada astrosit yang
difermentasi etanol , menunjukkan bahwa pengobatan etanol kronis menstimulasi sel glia dengan
meningkatkan regulasi sitokin proinflamasi melalui jalur pensinyalan yang terlibat dalam
kematian sel.50,51 Penelitian sebelumnya telah menunjukkan bahwa sitokin anti-inflamatori IL-
4 dapat menginduksi CYP2E1 pada sel hati melalui jalur PKC. dengan demikian dapatt
disimpulkan bahwa ada hubungan antara CYP2E1 dan sitokin dalam toksisitas neuronal yang
dimediasi alkohol. Temuan ini memiliki implikasi penting untuk peradangan di kedua perifer dan
CNS dalam kasus paparan simultan terhadap alkohol dan infeksi dengan bakteri atau virus
patogen. Oleh karena itu, diseksi lebih lanjut dari jalur pensinyalan yang bertanggung jawab
untuk induksi CYP2E1 dan pelepasan sitokin sangat penting untuk memajukan pemahaman kita
tentang etanol yang dimediasi toksisitas dalam monosit dan astrosit.

Penelitian ini menunjukkan bahwa peningkatan stres oksidatif oleh etanol bukan hanya
konsekuensi, tetapi juga mediator, induksi CYP2E1 pada astrosit dan monosit. Selanjutnya,
ekspresi CYP2E1 yang meningkat dan stres oksidatif yang dihasilkan menyebabkan kematian sel
pada sel-sel ini, dan menunjukkan bahwa CYP2E1, selain menyebabkan stres oksidatif, juga
merupakan salah satu pemain kunci untuk menargetkan toksisitas otak yang dimediasi alkohol.
Atenuasi CYP2E1-mediated apoptosis tergantung kematian sel monosit, limfosit, dan neuron
diharapkan dapat membantu mengurangi penekanan kekebalan dan neurotoksisitas yang
dimediasi oleh alkohol. DAS, inhibitor selektif CYP2E1, adalah aditif makanan, dan telah
terbukti melindungi sel imun, 16 dapat menjadi target potensial untuk penekanan kekebalan dan
neurotoksisitas yang diinduksi oleh alkohol. Namun, DAS juga dapat beracun, 17 derivatif
kimia baru dengan toksisitas yang relatif lebih rendah daripada DAS dapat disintesis untuk
menggunakannya sebagai terapi.

Bahan dan metode

Bahan. cell line monositik U937 diperoleh dari ATCC (Manassas, VA, USA). cell line astrocyte
SVGA diberikan oleh Dr. Avindra Nath, NIH / NIDA. Vitamin DAS, vitamin C, vitamin E,
staurosporin, U0126, SP600125, pomalidomide, dan protease inhibitor, NAC dan BHT dibeli
dari Sigma-Aldrich, St. Louse, MO, USA. Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 dan
media Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) dibeli dari Mediatech Inc., Manassas, VA,
USA. Kit Qiagen RNeasy diperoleh dari Qiagen, Valencia, CA, USA. Perangkat ekspresi gen
dan probe primer diperoleh dari Applied Biosystems (Carlsbad, CA, USA). Uji proliferasi MTT
dan mithramycin A berasal dari sistem R & D, Inc. (Minneapolis, MN, USA). Apoptosis
TUNEL dan kit apoptosis Annexin V / PE masing-masing berasal dari Genscript Inc.
(Piscataway, NJ, USA) dan BD Biosciences (San Jose, CA, USA). Paket pengujian protein BCA
dibeli dari Thermo Scientific (Rockford, IL, USA). Dichlorofluoroscein diacetate (DCFDA)
dibeli dari Invitrogen (Grand Island, NY, USA). Radioimunoprecipitation assay buffer dan
protease inhibitor cocktail dibeli dari Boston Bioproducts (Ashland, MA, USA). Antibodi primer
dan sekunder dibeli dari Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA, USA). Scramble,
CYP2E1 yang telah didesain sebelumnya, dan PKCz siRNA, serta lipofectamine, dibeli dari Life
Technologies (Grand Island, NY, USA). PPSI diperoleh dari Santa Cruz Biotechnology, Inc.
Perangkat uji kolorimetri Caspase-3 berasal dari Clontech Laboratories, Inc. (Mountain View,
CA, USA).

Kultur sel dan perawatan. Sel U937 ditumbuhkan dalam media RPMI 1640 dengan 1%
gentamisin pada 37 1C dalam inkubator yang dilembabkan yang mengandung 5% CO2. Sel
SVGA ditanam di DMEM, mengandung 1% gentamisin. Perlakuan eatanol pada monosit
dilakukan seperti yang dijelaskan, 52 dan sampel yang diolah pada konsentrasi etanol 100mM
selama 12 jam dipilih untuk studi inhibitor. Perlakuan etanol astrocytes dilakukan 12 jam setelah
sel-sel penyemaian di plate enam sumur. Wadah desiccator-like mengandung 150 ml 100mM
etanol yang diinkubasi selama 1 jam untuk saturasi etanol. Kemudian, 50mM etanol
ditambahkan ke masing-masing dengan baik, dan lempeng dalam wadah etanol-jenuh diinkubasi
dalam inkubator. Konsentrasi etanol (10-50mM) dan waktu (1–24 jam) dioptimalkan untuk
induksi CYP2E1 yang dimediasi etanol. Dosis etanol 50mM pada 3 jam ditemukan menjadi
optimal untuk percobaan lebih lanjut dalam kasus astrosit. Perawatan dengan vitamin C, vitamin
E, NAC, BHT, staurosporine, U0126, SP600125, pomalidomide, dan mithrimycin dimulai 1 jam
sebelum pengobatan etanol. Namun, sel-sel yang diobati dengan DAS diberi pra-perawatan
selama 15 menit, sebelum pengobatan etanol sesuai dengan protokol sebelumnya.53 Kami
menggunakan kontrol untuk setiap titik waktu dengan atau tanpa agen-agen ini.

Pengukuran ROS dengan flow cytometry. Produksi ROS diukur dengan aliran cytometry
menggunakan DCFDA seperti yang dijelaskan sebelumnya.24 Secara singkat, astrocytes diberi
perlakuan dengan alkohol, baik dengan atau tanpa inhibitor, menggunakan medium serumfree
pada waktu yang berbeda di plate enam sumur diikuti dengan penambahan 10 mM DCFDA .
Sel-sel kemudian dipanen dan dilarutkan dalam 1ml PBS untuk mengukur emisi DCF pada 525 ±
20 nm oleh aliran cytometry dan intensitas fluoresensi rata-rata diukur dan dianalisis.

Uji apoptosis. Aktivitas pembelahan Caspase 3 diukur sesuai dengan protokol pabriknya.
Secara singkat, 2106 sel dikumpulkan dan diresuspensi dalam 50 ml buffer sel lysate selama 10
menit di atas es dan kemudian disentrifugasi pada kecepatan maksimum selama 10 menit pada 4
1C. Selanjutnya, reagen reaksi 50 ml, termasuk 1% DTT, kemudian ditambahkan ke setiap
supernatan dan dicampur dengan benar. Setelah menambahkan 5 ml caspase 3 substrat secara
terpisah, sampel disimpan dalam bak air pada 37 1C selama 1 jam. Sampel kemudian diukur
menggunakan pembaca lempeng pada 405 nm.

Uji apoptosis TUNEL diterapkan pada astrocytes SVGA, untuk mengukur apoptosis seluler yang
diinduksi oleh perawatan. Sel-sel di masing-masing sumur dikultur pada slip penutup. Setelah
penghentian perawatan, sel-sel tetap dalam formaldehida 4% segar selama 30 menit dan
kemudian diinkubasi dengan etanol 70% selama 30 menit untuk meningkatkan permeabilitas
membran. Setelah inkubasi dengan larutan permeabilisasi pada es selama 2 menit, sel diberi label
melalui inkubasi dengan larutan pelabelan (mengandung 2% FITC-12-dUTP) selama 1 jam
dalam gelap. Setelah dicuci, sel-sel dipasang pada slide dan fluoresensi dideteksi menggunakan
mikroskop confocal dengan panjang gelombang emisi 515 nm.

Deteksi Annexin V dilakukan pada monosit U937 untuk mengukur efek etanol dan inhibitor
pada apoptosis dan kematian sel. Secara singkat, media dihilangkan dan sel-sel dari masing-
masing sumur diskors dalam larutan pengikat pada konsentrasi akhir 1106 sel per ml, 100 ml
yang ditransfer ke dalam tabung 5-ml. Secara keseluruhan, 5 ml PE, sebagai indikator apoptosis
awal, dan 5 ml 7-AAD ditambahkan ke 100 ml sel solusi, diikuti oleh 15 menit inkubasi pada
suhu kamar dalam gelap. Setelah inkubasi, larutan pengikat 400 ml ditambahkan ke masing-
masing tabung dan fluoresensidideteksi menggunakan flow cytometer (BD Biosciences). nilai
mean intensitas fluoresensi telah diukur dan dianalisis.

MTT assay. Uji viabilitas sel dilakukan pada pelat enam-sumur, menggunakan uji MTT. Media
dihilangkan dari setiap sumur untuk mengakhiri perawatan sel. Setelah mencuci dua kali dengan
PBS, sel-sel dari masing-masing sumur diinkubasi selama 4 jam dengan campuran 200 ml 0,5
mg / ml larutan MTT dalam PBS dan 300 ml media segar. Media ini kemudian diganti dengan
500 ml campuran 400 ml DMSO dan 100 ml buffer glycine Sorenson. Absorbansi diperoleh
pada panjang gelombang emisi 570 nm di pembaca plat mikro. Jumlah total sel yang tersisa
hidup di setiap sumur dihitung menggunakan kurva standar.

Ekstraksi RNA dan qRT – PCR. Total RNA diekstraksi menggunakan Qiagen RNeasy kit
berdasarkan protokol pabrik. Untuk setiap reaksi, RNA (100 ng) dari sampel ditranskripsikan
terbalik ke dalam cDNA menggunakan High-capacity cDNA Reverse Transcription Kit. qRT
PCR dilakukan menggunakan cDNA yang dihasilkan dari transkripsi balik RNA sesuai dengan
instruksi pabrik (TaqMan Gene Expression Kit, Applied Biosystems). Reaksi PCR dilakukan
pada sistem iCycler iQ. (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA). Ekspresi gen relatif
dihitung menggunakan GAPDH sebagai kontrol endogen.

Western blotting. Total lisat sel disiapkan menggunakan buffer penunjang

radioimmunoprecipitation, mengandung 1 Protease inhibitor cocktail. Konsentrasi protein diukur
menggunakan BCA assay kit protein. Western blotting dilakukan pada dasarnya seperti yang
dijelaskan. 24 Singkatnya, 20 mg protein total dijalankan pada SDS-PAGE dan kemudian
ditransfer ke membran polyvinylidene fluoride. Blot yang ditransfer diblokir dalam 5% susu
kering tanpa lemak diikuti dengan inkubasi semalam dengan antibodi primer (1: 1000) dan
inkubasi 2 jam dengan antibodi sekunder yang sesuai (1: 1500). Protein dideteksi oleh substrat
HRP barat LuminataTM crescendo (Millipore korporasi, Billerica, MA, USA), menggunakan
sistem dokumentasi gel Alpha Innotech FluorChem HD2 (Alpha Innotech, San Leandro, CA,
USA). Data densitometri dianalisis menggunakan perangkat lunak AlphaEase FC StandAlone
(versi 6.0.0.14; Alpha Innotech). b-Tubulin atau GAPDH berfungsi sebagai kontrol pemuatan
internal untuk menormalkan ekspresi protein.

Transfeksi siRNA. Astrocytes SVGA ditransfeksikan dengan CYR2E1 SiRNA manusia yang
telah dirancang sebelumnya atau pengacakan siRNA (10 nM) di piring enam-baik selama 24 jam
dengan reagen transfeksi lipofektamin dalam media bebas serum dan antibiotik bebas. Media
transfeksi kemudian dibuang, dan astrocytes SVGA diinkubasi semalam dengan media lengkap
(mengandung 10% FBS dan 1% gentamisin), diikuti oleh 24 jam etanol pada 100mM.Analisis
statistik.

Analisis statistik untuk qRT-PCR, western blotting, pengukuran ROS, aktivitas pembelahan
caspase-3, dan pengujian MTT dilakukan untuk menentukan mean ± SD. One-way ANOVA
diterapkan untuk menentukan nilai P. Nilai P dari r0.05 dianggap signifikan.

Konflik
Para penulis menyatakan tidak ada konflik.