LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI

PEWARNAAN GRAM DIFERENSIAL

Disusun oleh

1. Wilma Arsiska U. K. P1337431217055

2. Retno Putri Kinasih P1337431217060

3. Novemi Hardiyana P1337431217087

4. Rohmah Dewi Minasta P1337431217088

DIV GIZI REGULER B

POLTEKKES KEMENKES SEMARANG

2018
 BAB 1

PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

Pewarnaan Gram atau Metode Gram adalah salah satu teknik pewarnaan yang
paling penting dan luas yang digunakan untuk mengidentifikasi bakteri. Dalam proses ini,
olesan bakteri yang sudah terfiksasi dikenai larutan-larutan berikut : zat pewarna kristal
violet, larutan yodium, larutan alkohol (bahan pemucat), dan zat pewarna tandingannya
berupa zat warna safranin atau air fuchsin. Metode ini diberi nama berdasarkan
penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian Gram (1853–1938) yang
mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk membedakan
antara Pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumoniae. Bakteri yang terwarnai dengan
metode ini dibagi menjadi dua kelompok, yaitu bakteri Gram Positif dan Bakteri Gram
Negatif. Bakteri Gram positif akan mempertahankan zat pewarna kristal violet dan
karenanya akan tampak berwarna ungu tua di bawah mikroskop.
Adapun bakteri gram negatif akan kehilangan zat pewarna kristal violet setelah
dicuci dengan alkohol, dan sewaktu diberi zat pewarna tandingannya yaitu dengan zat
pewarna air fuchsin atau safranin akan tampak berwarna merah. Perbedaan warna ini
disebabkan oleh perbedaan dalam struktur kimiawi dinding selnya. Pewarnaan ini
mungkin merupakan salah satu prosedur yang amat penting dan paling banyak digunakan
dalam klasifikasi bakteri. Dengan metode ini, bakteri dapat dipisahkan secara umum
menjadi dua kelompok besar yaitu 1)organisme yang dapat menahan kompleks pewarna
primer ungu kristal iodium sampai pada akhir prosedur (sel-sel tampak biru gelap atau
ungu), disebut Gram positive; 2) organisme yang kehilangan kompleks warna ungu
kristal pada waktu pembilasan dengan alkohol namun kemudian terwarnai oleh pewarna
tandingan, safranin (sel-sel tampak merah muda), disebut Gram negative
(Hadieotomo,1988).
B. Tujuan praktikum
 Agar mahasiswa mengetahui tentang cara pewarnaan gram pada bakteri
Salmonella Thyposa dan Klebsiella Pneumoniae.
 Agar mahasiswa mengetahui perbedaan antara bakteri melalui pewarnaan gram
diferensial.

BAB II
 PEMBAHASAN

A. Alat dan bahan

1. Alat
 Bunsen
 Objek glass
 Pipet tetes
 Kapas
 Mikroskop
 Penjepit
2. Bahan
 Aquades
 Alkohol
 Suspensi Klebsiella Pneumonia
 Suspensi Salmonella Thyposa
 Kristal violet
 Mordant (lugol’s iodine)
 Ethanol
 Counterstain (safranin)
 Tisu

B. Cara Kerja
 Pewarnaan Gram dengan Suspensi Salmonella Thyposa dan Klebsiella
Pneumoniae
1. Menyiapkan peralatan dan bahan yang dibutuhkan.
2. Membersihkan objek glass dengan menggunakan kapas dan alkohol,
agar lemak dalam objek glass hilang.
3. Membuat preparat ulas (smear) yang telah difiksasi dan bakteri gram
positif yaitu Salmonella Thyposa dan gram negative yaitu Klebsiella
Pneumoniae.
4. Meneteskan Kristal violet sebagai pewarna utama pada kedua preparat,
usahakan semua ulasan terwarnai, lalu tunggu selama ± 1 menit.
5. Lalu, cuci dengan akuades mengalir.
6. Meneteskan mordant (lugol’s iodine) lalu tunggu ± 1 menit.
7. Kemudian, cuci kembali menggunakan akuades mengalir.
8. Memberikan larutan pemucat (ethanol 96%/ aseton) setetes demi
setetes hingga etanol yang jatuh berwarna jernih. Jangan sampai terlalu
banyak (overdecolorize).
9. Lalu, cuci dengan akuades mengalir.
10. Meneteskan counterstain (safranin) dan tunggu selama ± 45 detik.
11. Kemudian, cuci kembali menggunakan akuades mengalir.
 12. Mengeringkan preparat dengan kertas tisu yang ditempelkan di sisi
ulasan (jangan sampai merusak ulasan) lalu biarkan mengering di
udara.

 Pengamatan preparat menggunakan mikroskop

1. Menyiapkan bahan dan peralatan yang dibutuhkan.
2. Memanaskan mikroskop cahaya sebelum dipakai.
3. Menaruh preparat Salmonella Thyposa atau Klebsiella Pneumoniae
pada mikroskop.
4. Melakukan pengamatan pada perbesaran

C. Hasil Pengamatan
 Mikroskop

N Bakteri Gambar
o
1 Salmonella Thyposa
 2. Klebsiella Pneumoniae

D. Pembahasan

Menurut Hadioetomo (1988), diketahui bahwa komposisi dinding sel bakteri

Gram positive berbeda dengan bakteri Gram negative. Dinding sel yang lebih yang
tebal pada bakteri Gram positive menyusul oleh perlakuan alkohol karena terjadi
dehidrasi. Sedangkan sel-sel Gram negative mempunyai kandungan lipid yang lebih
tinggi pada dinding selnya dan lipid pada umumnya larut dalam alkohol dan aseton.
Contoh dari Gram negatif adalah Salmonella Thyposa dan Klebsiella Pneumoniae.
Perbedaan struktur dinding sel bakteri Gram positive dan Gram negative sehingga
menyebabkan perbedaan reaksi dalam permeabilitas zat warna dan penambahan
larutan pemucat. Sebagian besar dinding sel bakteri Gram positive terdiri dari
peptidoglikan, sedangkan dinding sel bakteri Gram negative mempunyai kandungan
lipida yang tinggi dibandingkan dinding sel bakteri Gram negative (Lay, 1994).
Pewarnaan gram diferensial merupakan salah satu prosedur yang amat penting
dan paling banyak digunakan dalam klasifikasi bakteri. Dengan metode ini, bakteri
dapat dipisahkan secara umum menjadi dua kelompok besar yaitu 1) organisme yang
dapat menahan kompleks pewarna primer ungu kristal iodium sampai pada akhir
prosedur (sel-sel tampak biru gelap atau ungu), disebut Gram positive; 2) organisme
yang kehilangan kompleks warna ungu kristal pada waktu pembilasan dengan alkohol
 namun kemudian terwarnai oleh pewarna tandingan, safranin (sel-sel tampak merah
muda), disebut Gram negative (Hadieotomo,1988).

BAB III
PENUTUP

A. Kesimpulan
Pewarnaan gram diferensial adalah pewarnaan yang sangat berguna dan paling
banyak digunakan dalam laboratorium mikrobiologi karena merupakan tahapan penting
dalam langkah awal identifikasi. Pewarnaan ini didasarkan pada tebal atau tipisnya
lapisan peptidoglikan di dinding sel dan banyak sedikitnya lapisan lemak pada membrane
sel bakteri. Jenis bakteri berdasarkan pewarnaan gram dibagi menjadi dua yaitu gram
positif dan gram negative. Bakteri gram positif memiliki dinding sel yang tebal dan
membran sel selapis. Sedangkan bakteri garam negative mempunyai dinding sel tipis
yang berada di antara dua lapis membran sel.
Hasil Praktikum mikrobiologi mengenai pewarnaan gram diferensial dengan
menggunakan suspense bakteri Salmonella Thyposa dan Klebsiella Pneumoniae, kami
dapat menyimpulkan bahwa pewarnaan gram dapat membuktikan bahwa bakteri
Salmonella Thyposa merupakan bakteri gram negatif dengan munculnya warna merah
menunjukkan bahwa Salmonella Thyposa merupakan bakteri gram negative, begitu pula
pada bakteri Klebsiella Pneumoniae

B. Saran
 1. Setiap meneteskan larutan atau pewarna pada preparat diperlukan kehati-hatian dan
ketelitian agar suspense tidak hilang.
2. Pada pembacaan mikroskop diperlukan kesabaran dan ketelatenan untuk bisa cepat
menemukan gambar pengamatan bakteri yang diinginkan.

DAFTAR REFERENSI

Wijaningsih, Wiwik, dkk. 2017. Pedoman Praktikum Mikrobiologi Pangan. Semarang :

Politeknik Kesehatan Kemenkes Semarang.

https://id.wikipedia.org/wiki/Pewarnaan_Gram