Cara pengumpulan data

Urin porsi tengah (midstream) sejumlah + 10 mL diambil dari sukarelawan dengan

menggunakan pot urin steril. Sampel urin kemudian dibawa secepatnya ke laboratorium untuk
dianalisis. Sampel urin yang diperoleh, diukur pHnya sebelum dianalisis lebih lanjut. Satu atau
dua tetes urin dimasukkan dalam medium EMJH atau Korthof dengan penambahan 5
fluorouracil atau STAFF, dan dinkubasi pada suhu 30o C, serta diamati adanya pertumbuhan
Leptospira dengan menggunakan mikroskop lapang gelap selama 1 bulan.
Sisa sampel urin disentrifugasi dengan kecepatan 1,000 rpm selama 5 menit. Supernatan
kemudian disentrifugasi kembali 13,000 xg selama 10 menit. DNA kemudian diisolasi dari pelet
dengan Purelink Genomic DNA isolation kit (Invitrogen, US) menurut manual produk. Tiga jenis
PCR dilakukan, yaitu yang mentargetkan gen flaB (793 bp) serta LipL32 (241 bp) yang keduanya
spesifik untuk Leptospira patogen (Kawabata et.al, 2001; Koizumi et.al, 2008; Munoz-Zanzi
et.al, 2014), dan gen rrl atau 23S rDNA (482 bp), spesifik untuk genus Leptospira (Leon,et.al,
2006). Primer yang digunakan dalam eksperimen ini adalah primer spesifik gen flaB untuk PCR-
flaB tahap 1 (L-flaB-F1 5’TCTCACCGTTCTCTAAAGTTCAAC-3’, L-flaB-R1
5’CTGAATTCGGTTTCATATTTGCC-3’) (Kawabata et.al, 2001) dan PCR-flaB tahap 2 (L-
FlaB-F2 5’ TGTGCACAAGACGATGAAAGC-3’ dan L-FlaB-R2 5’
AACATTGCCGTACCACTCTG-3’) (Koizumi et.al, 2008), kemudian primer yang spesifik
untuk gen LipL32 (LipL32F 5’AAGCATTACCGCTTGTGGTG-3’, LipL32R:
5’GAACTCCCATTTCAGCGATT-3’) (Munoz-Zanzi et.al, 2014), serta primer spesifik untuk
gen rrl (rrlF 5’GACCCGAAGCCTGTCGAG-3’, rrlR 5’GCCATGCTTAGTCCCGATTAC-3’)
(Leon et.al, 2006). flaB diamplifikasi dengan metode nested-PCR dengan kondisi PCR tahap 1,
yaitu: 40 cycles denaturing pada 94˚C untuk 20 detik; annealing pada 50˚C untuk 30 detik;
extension pada 72˚C untuk 60 detik. Kondisi PCR tahap 2 sesuai dengan literatur (Koizumi et.al,
2008). Kondisi PCR untuk amplifikasi gen LipL32 mengikuti kondisi di literatur (Munoz-Zanzi
et.a;, 2014), sedangkan amplifikasi gen rrl sesuai dengan referensi (Leon,et.al, 2006). PCR
produk dielektroforesis menggunakan 1.5% gel agarose dan divisualisasi menggunakan
SYBR@safe DNA gel stain (Thermo Fisher Scientific)