PENDAHULUAN
1.1.Tujuan
Struktur asam amino yang terdapat dalam protein ditemukan dalam bentuk
ionik. Warna hitam menunjukkan bagian yang umum pada semua asam -amino
pada protein (kecuali prolin). Struktur ke-20 asam amino dibagi menjadi 4 golongan,
yaitu: (1) golongan dengan gugus R nonpolar atau hidrofobik, (2) golongan dengan
gugus R polar, tetapi tidak bermuatan, (3) golongan dengan gugus R bermuatan
negatif, (4) golongan dengan gugus R bermuatan positif. Gugus R di dalam golongan
ini merupakan hidrokarbon. Lima asam amino dengan gugus R alifatik (alanin, valin,
leusin, isoleusin, dan prolin), dua dengan lingkaran aromatik (fenilalanin dan
triptofan), dan satu yang mengandung sulfur (metionin) (Sumardjo, 2006).
Gugus R dari asam amino polar lebih larut dalam air, atau lebih hidrofilik,
dibandingkan dengan asam amino nonpolar, karena golongan ini mengandung gugus
fungsionil yang membentuk ikatan hidrogen dengan air. Golongan ini meliputi glisin,
serin, treonin, sistein, tirosin, asparagin, dan glutamin (Sumardjo, 2006).
Golongan Asam Amino yang Mempunyai Gugus R yang Bermuatan Negatif (Asam)
Golongan asam amino ini mengandung gugus R yang bermuatan total negatif
pada pH 7,0. asam amino ini meliputi asam aspartat dan asam glutamat, yang
masing-masing memiliki tambahan gugus karboksil (Sumardjo, 2006).
Golongan asam amino ini mempunyai gugus R dengan muatan total positif
pada pH 7,0. asam amino ini meliputi lisin, arginin, dan histidin (Sumardjo, 2006).
Reaksi Xantoprotein
Larutan asam nitrat pekat ditambahkan dengan hati-hati ke dalam larutan
protein. Setelah dicampur terjadi endapan putih yang dapat berubah menjadi kuning
apabila dipanaskan. Reaksi yang terjadi ialah nitrasi pada inti benzena yang terdapat
pada molekul protein. Reaksi ini positif untuk protein yang mengandung tirosin,
fenilalanin dan triptofan.
Reaksi Hopkins-Cole
Larutan protein yang mengandung triptofan dapat direaksikan dengan pereaksi
Hopkins-Cole yang mengandung asam glioksilat. Pereaksi ini dibuat dari asam oksalat
dengan serbuk magnesium dalam air. Setelah dicampur dengan pereaksi Hopkins-
Cole, asam sulfat dituangkan perlahan-lahan sehingga membentuk lapisan di bawah
larutan protein. Beberapa saat kemudian akan terjadi cincin ungu pada batas antara
kedua lapisan tersebut (Whitford, 2005).
Reaksi Millon
Pereaksi Millon adalah larutan merkuro dan merkuri nitrat dalam asam nitrat.
Apabila pereaksi ini ditambahkan pada larutan protein, akan menghasilkan endapan
putih yang dapat berubah menjadi merah oleh pemanasan. Pada dasarnya reaksi ini
positif untuk fenol-fenol, karena terbentuknya senyawa merkuri dengan gugus
hidroksifenil yang berwarna (Whitford, 2005).
Reaksi Natriumnitroprusida
Natriumnitroprusida dalam larutan amoniak akan menghasilkan warna merah
dengan protein yang mempunyai gugus –SH bebas. Jadi protein yang mengandung
sistein dapat memberikan hasil positif (Yuwono, 2010).
Reaksi Ninhidrin
Reaksi ninhidrin dapat dipakai untuk penentuan kuantitatif asam amino.
Dengan memanaskan campuran asam amino dan ninhidrin, terjadilah larutan
berwarna ungu yang identitasnya dapat ditentukan dengan cara spektrometri. Semua
asam amino dan peptide yang mengandung gugus α amino bebas memberikan reaksi
ninhidrin yang positif. Prolin dan hidroksiprolin yang gugus aminonya tersubtitusi,
memberikan hasil reaksi lain yang berwarna kuning (Yuwono, 2010).
1.3.Tinjauan Bahan
1.3.1. NaOH
NaOH bersifat tidak mudah terbakar. Bentuknya berupa padatan dan tidak berbau.
Berat molekul NaOH adalah 40 g/mol. Berwarna putih dan mudah larut dalam air.
Memiliki titik didih 1380C (Anonim1, 2012).
1.3.2. HCl
Asam klorida merupakan bahan kimia yang tidak mudah terbakar. Wujudnya berupa
cairan berwarna bening. HCl bersifat asam dan memiliki titik didih terendah 1000C
(Anonim2, 2012).
1.3.3. Asam Glutamat
Asam glutamat mempunyai rumus kimia C5H8NO4Na.H2O dan berbentuk padat.
Asam glutamat mudah larut dalam air dingin dan bersifat stabil. Berbahaya jika
terkena mata, pernafasan, dan tertelan (Anonim3, 2012).
1.3.4. Glisin
Glisin salah satu asam amino yang berbentuk padat, berwarna putih, tidak mempunyai
bau, pH glisin 5,9 -6,4. Glisin adalah oksidator kuat dan bersifat basa. Glisin adalah
salah satu asam amino non esensial (Anonim4, 2012).
1.3.5. Lisin
Lisin mempunyai rumus kimia C6H14N2O2.HCl. Produk ini mudah larut dalam air
dingin. Lisin bersifat tidak korosif dan tidak akan mengalami polimerisasi. Berat
molekul lisin adalah 182,68 g/mol (Anonim5, 2012).
1.3.6. Alanin
Alanin mempunyai rumus kimia CH3CH(NH2).COOH. Alanin berbentuk padatan dan
baunya tidak menyengat. Produk ini mempunyai berat molekul 89,09 g/mol. Alanin
mudah larut dalam air dan bersifat stabil. Titik leburnya pada suhu 2100C (Anonim6,
2012).
1.3.7. Reagen Ninhidrin
Reagen ninhidrin berwujud cairan, stabil dan mudah larut dalam air dingin, air panas,
dietil eter, maupun aseton. Tidak bersifat korosif dan reaktif terhadap agen
pengoksidasi , agen pereduksi, dan akali maupun asam (Anonim7, 2012).
1.3.8. Tirosin
Tirosin mempunyai rumus kimia C9H11NO3. Tirosin berbentuk padatan dan tidak
berbau. Tirosin mudah larut dalam air dan tidak mudah larut dalam dietil eter, aseton
dan alkohol. Titik leburnya 3440C (Anonim8, 2012).
1.3.9. Pepton
Pepton berbentuk padatan, bersifat non korosif dan merupakan produk yang stabil.
Pepton tidak dapat mengalami polimerisasi (Anonim9, 2012).
1.3.10. Kasein
Kasein berbentuk padatan dan berwarna kecoklatan. Kasein dapat bereaksi dengan
agen pengoksidasi dan polimerisasinya tidak akan terjadi (Anonim10, 2010).
1.3.11. Gelatin
Gelatin berwujud padat dan tidak berbau. Gelatin berwarna putih dan memiliki titik
didih lebih besar dari 1000C. Gelatin mudah terbakar jika diletakkan pada suhu yang
tinggi. Gelatin merupakan zat yang sangat stabil, sangat mudah larut dalam air panas
namun tidak dapat larut dalam air dingin (Anonim11, 2012).
1.3.12. Reagen Biuret
Komposisi dari reagen ini adalah tembaga, sulfat pentahidrat, natrium tartart dihidrat,
natrium hidroksida, kalium iodida dan air. Reagen ini biasa digunakan untuk uji
makanan. Reagen biuret tidak mudah terbakar dan mudah larut dalam air dingin dan
air panas (Anonim12, 2012).
1.3.13. Albumin
Albumin bersifat nonkorosif dan stabil. Albumin tidak dapat mengalami polimerisasi.
Zat ini berbentuk padatan, penyimpanannya harus ditempat yang sejuk dan terhindar
dari panas dengan ventilasi udara yang baik (Anonim13, 2012).
1.3.14. Eter
Eter mempunyai rumus kimia (C2H5)O2 dengan nama dietil eter. Zat ini mudah
terbakar dan mudah menguap. Eter memiliki berat molekul 74,12 g/mol, berwarna
bening dan larut dalam aseton dan sebagian larut dalam air dingin (Anonim14, 2012).
1.3.15. Fenol
Fenol mempunyai rumus kimia C6H5OH. Bentuknya berupa padatandan berwarna
bening kemerah mudaan. Fenol mempunyai berat molekul 94,41 g/mol. Titik didihnya
1820C dan titik leburnya 420C. Mudah larut dalam metanol, dietil eter, alkohol,
gliserol, kloroform dan petroleum (Anonim15, 2012).
1.3.16. Asam Nitrat
Asam nitrat mempunyai rumus kimia HNO3. Bersifat stabil dan sangat rekatif terhadap
alkali (basa). Bentuknya cair dan berwarna putih kekuningan. Mudah larut dalam air
panas, air dingin dan dietil eter (Anonim16, 2012).
BAB II
METODOLOGI
2.1. Alat
Alat-alat yang digunakan dalam praktikum ini adalah tabung reaksi, pipet, penangas
air, pH meter, buret, gelas kimia, labu ukur, termometer 1000C, labu, corong buchner,
kertas saring, gelas arloji, timbangan, dan spektronik 20.
2.2. Bahan
Bahan-bahan yang digunakan dalam praktikum ini adalah HCl 0,1 N, NaOH 0,1 N,
etanol, kloroform, asam amino (glisin, asam glutamat, lisin, alanin), larutan ninhidrin,
asam amino 1g/L (glisin, tyrosin, tryptofan, asam glutamat, prolin, kasein), fenol, HNO3
pekat, NaOH 10 M, asam amino 1 g/L (glisin, tyrosin, triptofan dan fenil alanin), HCl 0,2
N, NaOH 0,2 N, asam amino 0,1 M (glisin, histidin, lisin, asam glutamat), CuSO4.5H2O 10
g/L, NaOH 10 N, protein 5 g/L (albumin, kasein, gelatin dan pepton), HCl 1N, NaOH 1N,
HNO3 pekat, logam-logam berat 0,1 M (CuSO4; Pb(CH3COO)2; Hg(NO3)2, reagen asam
( asam sulfosalisilat 20%, asam pikrat jenuh, asam tannat, asam trikloroasetat 20%), ragen
biuret, kalium natrium tartart, susu, larutan buffer natrium asetat 0,2 M pH 4,6, etanol 95%,
dan eter.
Asam-asam amino
- Ditimbang 0,2 gram
- Dimasukkan dalam tabung reaksi
- Diperiksa kelarutannya dengan pelarut
(air, asam encer, etanol, kloroform)
Hasil
Asam-asam amino
- Diambil 1 mL
- Dimasukkan dalam tabung reaksi
- Dinetralkan
- Ditambah 5 tetes latutan ninhidrin
- Dimasukkan dalam penangas air 2 menit
Hasil
2.3.1.3 Reaksi Xanthoprotein
Asam-asam amino
- Diambil 0,5 mL
- Dimasukkan dalam tabung reaksi
- Ditambah 0,5 asam nitrat pekat
- Didinginkan dan diamati perubahannya
- Ditambahkan NaOH
- Diamati dan dibandingkan dengan uji larutan fenol
Hasil
Asam-asam amino
Hasil
2.3 Protein
2.3.1 Uji Biuret
Protein
Hasil
2.3.2 Denaturasi Protein Oleh Panas Dan pH Ekstrim
Protein
- Dimasukkan dalam tabung reaksi 5 mL
- Ditambahkan 0,5 mL HCl pada tabung 1
- Ditambahkan 0,5 mL NaOH pada tabung 2
- Ditambahkan 0,5 mL HNO3 pekat pada tabung 3
- Diletakkan dalam penangas air 10 menit
- Didinginkan dan dinetralkan
- Ditambah 2 mL HNO3 pekat yang berisi 2 mL protein
- Diamati
Hasil
Protein
Hasil
Protein
Hasil
2.3.5 Penentuan Kadar Protein Secara Biuret
Protein
Hasil
Susu
Hasil
-
BAB III
HASIL PENGAMATAN
No Perlakuan Pengamatan
Gilisin Asam glutamat Alanin
1. Asam amino diambil Serbuk kristal, Serbuk kristal, Serbuk kristal,
0,1 g warna putih, warna putih warna putih
2. Dimasukkan ke dalam Asam amino Asam amino Asam amino
tabung reaksi berada pada berada pada berada pada
tabung tabung tabung
3. Diperiksa kelarutannya
dengan air, asam
encer, basa encer,
etanol dan kloroform
Tabel Kelarutan
No Asam Amino Pelarut
Air Asam encer Basa Etanol Kloroform
encer
1. Glisin Tidak + + - -
dilakukan
2. Asam + + + _ -
glutamat
3. Alanin Tidak + + - -
dilakukan
3.1.2. Protein
No Perlakuan Pengamatan
Kasein Gelatin Pepton
1. Dipipet 5 ml larutan Larutan keruh, Larutan keruh, Larutan keruh,
protein dan tidak berwarna tidak berwarna tidak berwarna
dimasukkan kedalam 3
tabung reaksi
2. Tabung 1 ditambah 0,5 Tidak terjadi Menjadi bening Tidak terjadi
ml NaOH 1N perubahan perubahan
3. Tabung 2 ditambah 0,5 Tidak terjadi Menjadi bening Tidak terjadi
ml HCl 0,2N perubahan perubahan
4. Tabung 3 ditambah 0,5 Tidak terjadi Tidak terjadi Tidak terjadi
ml HNO3 pekat perubahan perubahan perubahan
5. Tabung 1 setelah Larutan Tidak terjadi Larutan
dipanaskan 10 menit berwarna kuning perubahan berwarna kuning
6. Tabung 2 setelah Tidak terjadi Tidak terjadi Larutan
dipanaskan 10 menit perubahan perubahan berwarna kuning
keruh
7. Tabung 3 setelah Larutan Larutan Larutan
dipanaskan 10 menit berwarna kuning berwarnakuning berwarna jingga
keruh muda
No Perlakuan Pengamatan
Kasein Gelatin Pepton
1. Dipipet 2ml larutan Larutan keruh, Larutan keruh, Larutan keruh,
protein dan tidak berwarna tidak berwarna tidak berwarna
dimasukkan ke dalam
3 tabung reaksi
2. Ditambahkan 2ml Terbentuk 2 Menjadi bening Tidak terjadi
HNO3 pekat lapisan. Lapisan perubahan
atas kuning dan
lapisan bawah
bening
3.1.2.3. Pengendapan Protein Dengan Logam Berat
No Perlakuan Pengamatan
Gelatin Hasil Pepton Hasil Kasein Hasil
Uji Uji Uji
1 Protein Bening, Keruh, Keruh,
dimasukkan tidak ada terdapat terdapat
dalam endapan endapan endapan
tabung reaksi
2 mL
2 Ditambah Biru muda Biru muda Biru bening
CuSO4 5 bening
tetes
Ditambah Tetap biru Tetap biru + Biru muda +
CuSO4 10 muda bening muda dan keruh
tetes keruh
3 Ditambah Keruh, + Keruh, + Putih keruh, +
HgNO3 5 terdapat terdapat terdapat
tetes sedikit endapan endapan
endapan
Ditambah Semakin + Keruh, + Endapan +
HgNO3 10 keruh, lebih terdapat makin
tetes banyak endapan banyak
endapan
4 Ditambah Pb Larutan tetap Putih keruh + Putih keruh +
asetat 5 tetes bening
Ditambah Pb Larutan tetap Putih keruh, + Putih kental +
asetat 10 bening terdapat
tetes endapan
No Perlakuan Pengamatan
Gelatin Hasil Pepton Hasil Kasein Hasil
Uji Uji Uji
1 Protein Bening, tidak Keruh, Bening, tidak
dimasukka ada endapan terdapat ada endapan
n dalam endapan
tabung
reaksi 2
mL
2 Ditambah Tidak terjadi Tidak terjadi Keruh
asam perubahan perubahan
sulfosalisil
at 3 tetes
Ditambah Tidak terjadi Tidak terjadi + Semakin +
asam perubahan perubahan keruh
sulfosalisil
at 6 tetes
Ditambah Tidak terjadi Endapan Terbentuk
NaOH perubahan menjadi endapan
sedikit
3 Ditambah Kuning Kuning Kuning
asam pikrat bening bening keruh,
3 tetes terdapat
endapan
Ditambah Kuning Kuning, Endapan
asam pikrat keruh, terdapat makin banyak
6 tetes terdapat sedikit
endapan endapan
Ditambah Endapan Tidak ada Kuning
NaOH hilang endapan jernih, tidak
ada endapan
4 Ditambah Tidak terjadi Tidak terjadi Terbentuk
asam perubahan perubahan endapan
trikloro
asetat 3
tetes
Ditambah Tidak terjadi + Tidak terjadi + Makin keruh +
asam perubahan perubahan
trikloro
asetat 6
tetes
Ditambah Terbentuk Terbentuk Tetap
NaOH endapan endapan terdapat
endapan
No Perlakuan Pengamatan
1 Albumin dari putih telur, larutan Albumin, kasein, pepton dan gelatin
kasein, larutan pepton dan larutan berada di dalam tabung reaksi
gelatin dipipet sebanyak 1 ml dan Albumin berwarna ku ing bening
dimasukkan ke dalam tabung reaksi Kasein bening dan tidak berwarna
Pepton berwarna kuning keruh
Gelatin bening dan tidak berwarna
2 Ditambah dengan 4 ml reagen Reagen biuret berwarna biru
biuret Albumin + biuret menghasilkan larutan
berwarna ungu tua
Kasein + biuret menghasilkan larutan
berwarna ungu muda
Pepton + biuret menghasilkan larutan
berwarna ungu sangat muda
Gelatin + biuret menghasilkan larutan
berwarna ungu muda
3 Didiamkan selama 30 menit Albumin + biuret tetap berwarna ungu tua
Kasein + biuret tetap berwarna ungu muda
Pepton + biuret tetap berwarna ungu
sangat muda
Gelatin + biuret tetap berwarna ungu
muda
4 Diukur serapannya pada panjang Larutan blanko : 0,000 A
gelombang 540 nm Larutan albumin : 0,577 A
Larutan kasein : 0,206 A
Larutan pepton : 0,291 A
Larutan gelatin :0,378 A
No Perlakuan Pengamatan
1 100 ml susu murni dituang dalam Susu murni di dalam gelas kimia
gelas kimia 250 ml
2 Susu murni dipanaskan pada suhu 40 Susu murni menjadi panas
°C
3 Ditambah 100 ml buffer asetat secara Susu berbusa, pH susu 4,8
perlahan sambil diaduk
4 Susu didiamkan selama 5 menit Susu menggumpal, terbentuk 2 lapisan.
Lapisan bawah : gumpalan putih
Lapisan atas : putih keruh
5 Susu didekantasi Endapan dan larutan terpisah
6 Disuspensi dengan etanol Susu menggumpal
7 Suspensi susu disaring menggunakan Endapan tersaring pada kertas saring
kertas saring
8 Dicuci dengan eter : etanol (1:1) Residu lebih kering menyerupai tepung
9 Dicuci dengan eter Terdapat cairan kuning dalam endapan
10 Dikeringkan dalam oven Corong dingin, endotermis
11 Ditimbang i. 2,0 gram (kasein + kertas)
ii. 3,2 gram (kasein + kertas)
Total : 5,2 gram – 1,4 gram
= 3,8 gram
3.2. Perhitungan
3.2.1 Kurva Titrasi Asam Amino
4
3 y = -0.048x + 4.1268
2 R² = 0.3702
1
0
0 5 10 15 20 25 30 35
volume penambahan
y1 = y2
-1,835x + 6,895 = -0,048x + 4,126
-1,787x = -2,769
x = 0,645
pKa1 = 0,645
Kurva Titrasi Alanin dengan NaOH 0,2 N
14
12
10 y = 0.0289x + 11.212
8 y = 0.882x + 7.748 R² = 0.8298
pH
R² = 0.7168
6
4
2
0
0 10 20 30 40 50
volme penambahan
y1 = y2
0,882x + 7,748 = 0,028x + 11,21
0,854x = 3,462
x = 4,054
pKa2 = 4,054
1
pI = 2 (pKa1 + pKa2)
1
= 2 (0,645 + 4,054)
= 2,395
0
0 5 10 15 20 25 30
volume penambahan
y1 = y2
-0,372x + 4,178 = -0,013x + 3,164
-0,359x = -1,014
x = 2,825
Kurva Titrasi Asam Glutamat dengan NaOH 0,2 N
15
10 y = 0.0372x + 11.23
pH
R² = 0.9424
5 y = 1.673x + 5.768
R² = 0.6791
0
0 5 10 15 20 25 30 35 40
volme penambahan
y1 = y2
1,673x + 5,768 = 0,037x + 11,23
1,636x = 5,462
x = 3,339
pKa2 = 3,339
1
pI = 2 (pKa1 + pKa2)
1
= 2 (2,825 + 3,339)
= 3,082
R² = 0.6028 R² = 0.8924
4
0
0 5 10 15 20 25 30 35
volume penambahan
y1 = y2
-1,427x + 6,893 = -0,024x + 3,478
-1,403x = -3,415
x = 2,434
pKa1 = 2,434
Kurva Titrasi Glisin dengan NaOH 0,2 N
14
12
10 y = 0.0292x + 11.586
8 R² = 0.8363
pH
y = 1.149x + 8.514
6 R² = 0.7077
4
2
0
0 5 10 15 20 25 30 35
volme penambahan
y1 = y2
1,149x + 8,514 = 0,029x + 11,58
1,12x = 3,066
x = 2,738
pKa1 = 2,738
1
pI = 2 (pKa1 + pKa2)
1
= 2 (2,434 + 2,738)
= 2,586
0.378
0.4 Kasein
0.291
0.3 0.206 Pepton
0.2 Gelatin
0.1 Albumin
0
0 2000 4000 6000 8000 10000 12000
Konsentrasi (ppm)
0.3
0.25 Kurva Larutan
0.2 Standar
0.15 Linear (Kurva
0.1 Larutan Standar)
0.05
0
0 2000 4000 6000 8000 10000
Konsentrasi (ppm)
y ax
x. y 9184
a 5,1022 10 5
x 2
1,8 10 8
a. Kadar Kasein
A 0,206
Konsentrasi = 4037,47 ppm
a 5,1022 10 5
w asam amino = [(x)] ppm . 10-3 L
= 4037,47 ppm . 10-3 L
= 4,03747 mg
w asam a min o
w protein = 100%
w sampel
4,03747mg
= 100%
1000mg
= 0,4%
b. Kadar Albumin
A 0,577
Konsentrasi = 11308,85 ppm
a 5,1022 10 5
w asam amino = [(x)] ppm . 10-3 L
= 11308,85 ppm . 10-3 L
= 11,309 mg
w asam a min o
w protein = 100%
w sampel
11,309mg
= 100%
1000mg
= 1,13%
c. Kadar Pepton
A 0,291
Konsentrasi = 5703,42 ppm
a 5,1022 10 5
w asam amino = [(x)] ppm . 10-3 L
= 5703,42 ppm . 10-3 L
= 5,703 mg
w asam a min o
w protein = 100%
w sampel
5,703mg
= 100%
1000mg
= 0,57%
d. Kadar Gelatin
A 0,378
Konsentrasi = 7408,57 ppm
a 5,1022 10 5
w asam amino = [(x)] ppm . 10-3 L
= 7408,57 ppm . 10-3 L
= 7,408 mg
w asam a min o
w protein = 100%
w sampel
7,408mg
= 100%
1000mg
= 0,74%
PEMBAHASAN
Untuk mengetahui kelarutan asam amino dengan pelarut maka hal yang
dilakukan adalah menimbang asam amino (glisin, asam glutamat dan alanin) sebanyak
0.1 gram sebagai bahan yang akan diuji, selanjutnya dimasukkan dalam tabung reaksi.
Masing-masing asam amino seperti: glisin, asam glutamat dan alanin diperiksa
kelarutannya dengan menggunakan pelarut-pelarut sebagai berikut : HCl 0.1N, NaOH
0.1N, air, etanol dan kloroform.
Uji kelarutan merupakan uji untuk mengetahui ada atau tidaknya noda dan larut
atau tidaknya suatu sampel untuk mngetahui termasuk larutan non polar atau polar.
Hasil yang diperoleh dari uji kelarutan tersebut adalah glisin, asam glutamat, dan alanin
memberikan reaksi positif (larut) terhadap asam encer, basa encer dan memberikan
reaksi negatif (tidak larut) pada etanol dan kloroform. Asam glutamat juga memberikan
reaksi positif dengan air. Glisin dapat larut karena glisin merupakan asam amino yang
mudah menyesuaikan diri dengan berbagai situasi karena strukturnya sederhana. Asam
amino mudah larut dalam asam maupun basa kuat karena asam amino mengandung dua
gugus yang berlawanan sifatnya yaitu –COOH yang bersifat asam (karena dapat
melepaskan ion H+) dan gugus -NH2 yang bersifat basa (karena dapat menerima proton).
Oleh sebab itu asam amino bersifat amfoter. Selain itu berdasarkan larut atau tidaknya
asam amino, asam amino itu dibedakan menjadi dua yaitu asam amino polar (larut
dalam air) dan asam aino non polar (tidak larut dalam air) (Sumardjo, 2006). Yang
termasuk amino polar adalah asam glutamat dan asam amino non polar adalah glisin
dan alanin.
Reaksi ninhidrin dapat dipakai untuk penentuan kuantitatif asam amino. Hal
yang dilakukan adalah memasukkan larutan asam amino (glisin, tyrosin, tryptofan,
asam glutamat dan kasein) kedalam tabung reaksi sebanyak 1ml. Kemudian
dinetralkan dengan NaOH. Selanjutnya ditambahkan 5 tetes larutan ninhidrin sebagai
reagen pengoksidasi. Dan dimasukkan dalam penangas air selama 2 menit untuk
mempercepat laju reaksi ketika dehidrasi dan kondensasi pembentukan senyawa
kompleks berwarna.
Dari hasil percobaan reaksi antara asam amino dengan ninhidrin menghasilkan
uji positif yaitu pada tyrosin, tryptofan, asam glutamat dan kasein dengan
menghasilkan warna kuning. Sedangkan pada glisin menghasilkan uji negatif (warna
larutan bening). Namun pada literatur uji postif terjadi pada semua asam amino yang
bereaksi dengan ninhidrin karena ninhidrin merupakan senyawa oksidator kuat
sehingga akan bereaksi dengan semua gugus α-amino yang menghasilkan warna ungu.
Kompleks warna ungu tersebut dihasilkan dari senyawa ninhidrin dengan atom
nitrogen pada asam amino. Sedangkan pada glisin yang merupakan asam amino bebas
akan bereaksi dengan ninhidrin menghasilkan warna biru-ungu. Perbedaan ini terjadi
karena alat yang digunakan belum bersih dari kontaminan dan ninhidrin yang
digunakan sudah tereduksi sehingga sulit bereaksi dengan asam amino.
Uji xantroprotein merupakan uji kualitatif pada protein yang digunakan untuk
menunjukkan adanya gugus benzena. Asam amino yang menunjukkan reaksi positif
adalah tyrosin,phenilalanin, dan tryptofan. Reaksi postif uji xantroprotein adalah
munculnya gumpalan atau cincin warna kuning. Pada uji ini digunakan larutan HNO3
yang berfungsi memecah protein menjadi gugus benzene. Uji xantroprotein akan
menghasilkan warna orange pada reaksi yang menghasilkan turunan benzena dengan
penambahan basa (Yuwono, 2010).
Dari hasil percobaan dapat diketahui bahwa asam-asam amino seperti glisin,
tryptofan dan tyrosin menghasilkan larutan bening dan hangat setelah penambahan
dengan HNO3 pekat, dan memberikan hasil postif setelah penambahan fenol terjadi
perubahan warna menjadi kuning. Sedangkan pada penambahan NaOH tidak terjadi
perubahan dengan menghasilkan uji negatif. Berdasarkan (Yuwono, 2010)
menyatakan bahwa uji xantroprotein akan memberikan warna kuning ketika asam
amino seperti glisin, tryrosin dan tryptofan ditambahkan HNO3 pekat karena HNO3
pekat berfungsi memecah protein menjadi gugus benzena. Ketika ditambahkan
dengan fenol akan menghasilkan warna orange pekat sedangkan pada NaOH akan
menghasilkan warna jingga karena NaOH merupakan basa kuat.
Penentuan kurva tirasi asam- asam amino dapat dilakukan dengan memipet
larutan asam amino (alanin, asam glutamat, dan glisin). Kemudian dimasukkan dalam
gelas kimia 100ml. Ph meter yang digunakan untuk mengukur pH asam distandarkan
atau dikalibrasi terlebih dahulu agar data yang diperoleh akurat. Selanjutnya larutan
HCl 0.1 N dimasukkan dalam buret. Kemudian dititrasi dengan larutan asam asam
amino hingga Ph asam mencapai 1,3. Ph meter yang telah digunakan kemudian
dikalibrasi kembali dengan mencuci elektoda dengan akuades. Sebagai perbandingan
maka buret yang tadinya berisi HCl maka diganti dengan NaOH untuk mengetahui
reaksi kesetimbangan yang terjadi ketika suatu asam asam amino dititrasi dengan basa
kuat. Titrasi dilakukan hingga mencapai Ph larutan menjadi 12,5.
Dari percobaan titrasi alanin dengan HCl 0.1 N, didapatkan kurva titrasi yang
memiliki nilai Pka1 sebesar 0,645. Sedangkan alanin dengan NaOH menghasilkan
pKa2 adalah 4,054. Dari kedua harga pKa tersebut maka diperoleh titik isoelektrik
dengan nilai 2,395. Pada tirasi asam glutamat dengan HCl diperoleh pKa 1 2,825 dan
pKa2 3,339 dengan nilai titik isoelektrik sebesar 3,082. Titrasi antara glisin dengan
HCl diperoleh pKa1 sebesar 2,434 dan pKa2 2,738 dengan nilai titik isoelektrik sebesar
2,586.
Berdasarkan data diatas nilai PI atau titik isoelektrik pada alanin adalah 2,395
sedangkan pada literatur nilai titik isoelektri alanin adalah 6,02. Pada pH diatas titik
isoelektrik, alanin mempunyai muatan negatif, dan karenanya akan bergerak ke arah
elektode positif (anoda) jika ditempatkan pada suatu medan listrik. Pada setiap pH di
bawah titik isoelektrik, alanin mempunyai muatan positif dan akan bergerak menuju
elektroda negatif katoda. Semakin jauh pH larutan alanin dari titik isoelektriknya,
semakin besar muatan listrik total populasi molekul alanin. Untuk glisin dan asam
glutamat memiliki titik isoelektrik sebesar 6-7. Karena alanin, glisin, dan asam
glutamat merupakan asam-asam amino netral yang bersifat non polar. Asam amino
netral non polar umumnya adalah yang paling sukar larut dalam air dari seluruh 20
asam amino ini. Pada pH 6-7 mereka berada sebagai ion dipolar yang netral. Tak
satupun dari asam amino ini yang gugus fungsional rantai cabangnya dapat
membentuk ikatan hidrogen dengan air (nitrogen heterosiklik dari triptofan tak
membentuk ikatan hidrogen dengan air karena pasangan elektronnya adalah sebagian
dari awan elektron π. Gugus sulfida dalam metionin tak polar sehingga tak
membentuk ikatan hidrogen dengan air.
4.2. Protein
4.2.1. Uji biuret (tidak dilakukan)
Denaturasi protein terjadi bila susunan ruang atau rantai polipeptida suatu
molekul protein berubah. Sebagian besar protein globuer mudah mengalami denaturasi.
Jika ikatan-ikatan yang membentuk konfigurasi molekul tersebut rusak, molekul akan
mengembang. Denaturasi protein dapat dilakukan dengan cara yaitu oleh panas dan Ph
ekstrim. Pada denaturasi oleh panas dapat dilakukan dengan menggunakan larutan
HNO3 pekat karena bersifat eksoterm. Pada Ph ekstrim dilakukan dengan menggunakan
larutan HCl, NaOH, dan HNO3 yang ditambahkan pada larutan protein seperti kasein,
gelatin, dan pepton.
Denaturasi protein oleh panas dan ph ekstrim dapat dilakukan dengan memipet
5 ml larutan protein (gelatin, kasein dn pepton) kedalam 3 tabung reaksi. Pada tabung
reaksi I ditambahkan larutan 0,5 ml NaOH 1N, tabung reaksi ke II ditambahkan 0,5
ml HCl 0,2N, dan tabung reaksi ke III ditambahkan larutan 0,5 ml HNO3 pekat.
Kemudian ketiga tabung reaksi tersebut dimasukkan ke dalam penangas air untuk
mempercepat laju reaksi ketika dehidrasi dan kondensasi pembentukan senyawa
kompleks berwarna. Kemudian dipipet lagi larutan protein dan dimasukkan kedalam
tabung reaksi dan ditambahkan HNO3 pekat untuk merubah protein menjadi derivat
nitro karena HNO3 bersifat eksoterm. Selanjutnya dilakukan pengamatan pada setiap
ujinya.
Dari hasil percobaan denaturasi protein terjadi pada kasein ketika ditambahkan
HNO3 pekat yaitu terbentuk dua lapisan dimana lapisan atas berupa endapan kuning
dan lapisan bawah bening. Protein yang terdenaturasi berkurang kelarutannya.
Lapisan molekul protein bagian dalam yang bersifat hidrofobik berbalik ke luar,
sedangakan bagian luar yang bersifat hidrofil terlipat ke dalam. Pelipatan atau
pembalikan terjadi khususnya bila larutan protein telah mendekati pH isoelektrik, dan
akhirnya protein akan menggumpal dan mengendap. Viskositas akan bertambah
karena molekul mengembang dan menjadi asimetrik, demikian jua sudut putaran optik
larutan protein akan meningkat. Enzim-enzim yang gugus prostetiknya terdiri dari
protein akan kehilangan aktivitasnya sehingga tidak berfungsi lagi sebagai enzim yang
aktif.
Pada percobaan penentuan kadar protein secara biuret ini, penentuan kadar
protein didasarkan pada pengukuran serapan cahaya oleh ikatan kompleks yang
berwarna ungu. Hal ini terjadi apabila protein bereaksi dengan tembaga dalam
lingkungan alkali. Sampel yang digunakan untuk menetapkan kadar protein secara
biuret adalah larutan gelatin, pepton, kasein dan albumin dari putih telur. Larutan
tersebut dipipet sebanyak 1ml, ditambahkan 4 ml reagen biuret dan didiamkan selama
30 menit. Ini bertujuan agar proses pembentukan senyawa kompleks berwarna dapat
berlangsung dengan benar-benar sempurna. Perlakuan yang sama juga di lakukan
untuk sampel putih telur. Untuk sampel putih telur dibuat 5 larutan dengan konsentrasi
yang berbeda.
Prinsip percobaan yaitu, untuk mengisolasi kasein dari susu, dalam percobaan
ini digunakan susu murni. Isolasi kasein dapat dilakukan dengan pengasaman. Serta,
percobaan yang dilakukan dengan cara pegasaman dengan menambahkan buffer asetat
pH 4,6.
Hal pertama yang dilakukan, semua peralatan dicuci dan dikeringkan. Setelah
itu dimasukkan 100 ml susu ke dalam gelas kimia (berfungsi sebagai tempat atau wadah
untuk larutan). Lalu dipanaskan hingga suhu 40 oC dalam penangas air. Kemudian
ditambahkan buffer asetat sebanyak 100 ml, didiamkan selama 5 menit, kertas saring
ditimbang untuk mengetahui massanya. Kemudian dilakukan dekantasi yang terdapat
sisa gumpalan – gumpalan, lalu ditambahkan sedikit air di dekantasi kembali. Setelah
itu ditambahkan 20 ml etanol (digunakan untuk menghilangkan lemak yang tidak
diinginkan dalam preparasi). Disaring dengan kertas saring untuk memisahkan endapan
dan larutan. Ditambahkan larutan campuran etanol : eter (1:1) sebanyak 20 ml
digunakan untuk memurnikan kasein dari komponen susu yang lain. Kemudian dicuci
dengan eter sebanyak 15 ml, gelas arloji ditimbang. Filtratnya tadi dikeringkan dalam
oven pada suhu 50 oC. barulah diperoleh kasein dan ditimbang dengan timbangan
analitik (untuk mengetahui massa kasein). Serta, penambahan buffer asetat pada pH 4,6
ini yang merupakan titik isoelektriknya. Dimana, titik isoelektrik yang dimiliki kasein
ini dapat digunaka sebagai prinsip mengisolasi kasein yaitu dengan menurunkan pH
larutan yang mengandung kasein menjadi 4,6 sehingga melalui penyaringan dan
diproleh endapan kasein.
Berat kasein yang didapatkan dalam percobaan ini adalah 3,8 g dan massa jenis
kasein 1,032 g/ml, sehingga berat susu dengan 100ml adalah 1,032 g. Hasil randemen
kasein yang didapatkan yaitu sebesar 3,7%. Hasil randemen yang didapat sesuai dengan
literatur yang mengatakan bahwa protein kasein pada susu berkisar antara 2,0% sampai
4,0%. Dimana protein dalam susu mencapai sekitar 3,25 % struktur primer dari rantai
polipeptida dari asam – asam amino yang disatukan dengan ikatan – ikatan peptida.
Protein juga memiliki isoelektrik tertentu. Pada pH tersebut protein tidak bermuatan
positif atau negatif sehingga dapat membentuk gumpalan – gumpalan dan mengendap.
BAB V
PENUTUP
5.1. Kesimpulan
Dari kegiatan praktikum biokimia ini dapat disimpulkan bahwa asam amino merupakan
asam karboksilat yang mempunyai gugus amino. Asam amino yang terdapat sebagai
komponen protein mempunyai gugus –NH2 pada atom karbon alfa dari posisi gugus –COOH.
Sedangkan protein merupakan senyawa organic kompleks molekul tinggi yang merupakan
polimer dari monomer – monomer asam amino yang dihubungkan satu sama lain dengan
ikatan peptida. Pengujian asam amino dan protein ada 10 macam yang dilaksanakan pada
praktikum ini yaitu kelarutan asam-asam amino, reaksi ninhidrin, reaksi xanthoprotein, kurva
titrasi asam amino, uji biuret, denaturasi protein oleh logam berat, pengendapan protein
dengan logam berat, pengendapan protein oleh asam, penentuan kadar secara biuret, dan
isolasi kasein dari susu. Serta hasil dari masing – masing uji tersebut berbeda (dilihat dari
perubahan warna, dan lain-lain).
5.2. Saran
Bagi praktikan untuk selanjutnya diharapkan lebih bersungguh – sunggu dalam
melaksanakan praktikum dan lebih meningkatkan ketelitian dalam bekerja, serta dapat
meningkatkan kekompakan dalam kelompoknya. Karena, dengan demikian mudah –
mudahan praktikum akan berlangsung sesuai dengan apa yang diharapkan dan mendapatkan
hasil yang maksimal.
DAFTAR PUSTAKA
Kuchel, Philip dan Gregory B Ralston. 2002. Schaum’s Easy Outlines Biochemistry. USA :
McGraw-Hill Companies.
Mandle, Ari Kumar., Pranita Jain., Shailendra K.S. 2012. Protein Structure Prediction Using
Support Vector Machine. International Journal on Soft Computing ( IJSC ) Vol.3,
No.1
Sumardjo, Damin. 2006. Buku Panduan Kuliah Mahasiswa Kedokteran dan Progam Srata 1
Bioeksakta. Jakarta : Buku Kedokteran EGC
Whitford, David. 2005. Protein Structure and Function. England : John Willey and Sons.
A. REAKSI
1. KELARUTAN ASAM AMINO
a. Glisin
O O
H2N + H2O +
H3N
OH
O-
glycine
O
O
H2N + H Cl +
OH H2N
glycine OH
Cl
O
O
H2N + Na OH H2N
OH -+
O Na
glycine
O
O
H2N + C2H5OH H2N
OH
OC2H5
glycine
H2N + CHCl3
OH
glycine
b. Asam Glutamat
NH2
NH3+
HO OH
+ H2O -
O OH
O O
O O
glutamic acid
glutamic acid
NH2 Cl NH2+
HO OH HO OH
+ H Cl
O O O O
glutamic acid glutamic acid
NH2
NH2
Na+ -O OH
HO OH +
Na OH
O O
O O
glutamic acid
glutamic acid
NH2 NH2
HO OH C2H5O OH
+ C2H5OH
O O O O
glutamic acid glutamic acid
NH2
HO OH
+ CHCl3
O O
glutamic acid
2. REAKSI NINHIDRIN
a. Glisin
O O
C OH
H2N +
OH
glycine C OH
O
b. Tyrosin
HO NH2
O O
C OH C OH
O
O OH + + HO
C OH C H
O OH
O
tyrosine + CO2 + NH3
O O O
C C OH C
OH
+ CH N + 3H2O
C H C OH C
O O O
c. Asam Glutamat
NH2 O
O
C OH C OH
HO OH
+ + CO2 + NH3 + CHO(CH2)2COOH
C OH C H
O O
O O
glutamic acid
O O O
C OH C C
OH
+ CH N + 3H2O
C H C OH C
O O O
d. Triptofan
O
O O
OH C OH C OH
+ + CO2 + NH3
NH2 OH H
C C
N O O
H
+
tryptophan O
OH
N
H
O O O
C OH C OH C
+ CH N + 3H2O
C H C OH C
O O O
e. Kasein
O
O O C OH
H H
N N +
N OH
H C
O
O
Kasein
3. REAKSI XANTHOPROTEIN
a. Glisin
O O
+
H2N + HNO3 H3N
OH OH
glycine
OH
O O
+ + + H2O
H3N +
H3N
OH O
fenol
b. Tirosin
c. Tryptofan
b. Dengan Pb(CH3COO)2
c. Dengan Hg(NO3)2
6.Pengendapan Protein Oleh Asam
1. Asam glutamat: pKa1 = 2,825 dan pKa2 = 3,339. Pada alanin didapatkan pKa1 =
0,645 dan pKa2 = 4,054. Pada glisin nilai pKa1= 2,434 dan pKa2= 2,738. Nilai pKa
yang didapatkan pada percobaan kali ini kurang sesuai dengan literatur hal ini
dimungkinkan karena proses pendinginan yang kurang optimal.
2. Titik Elektrik pada alanin = 2,385, pada asam glutamat =3,082 dan pada glisin= 2,586.
0.3
Absorbansi
0.25
Kurva Larutan Standar
0.2
0.15 Linear (Kurva Larutan
Standar)
0.1
0.05
0
0 2000 4000 6000 8000 10000
Konsentrasi (ppm)
y ax
x. y 9184
a 5,1022 10 5
x 2
1,8 10 8
2. Kadar Kasein
A 0,206
Konsentrasi = 4037,47 ppm
a 5,1022 10 5
w asam amino = [(x)] ppm . 10-3 L
= 4037,47 ppm . 10-3 L
= 4,03747 mg
w asam a min o
w protein = 100%
w sampel
4,03747mg
= 100%
1000mg
= 0,4%
3. Kadar Albumin
A 0,577
Konsentrasi = 11308,85 ppm
a 5,1022 10 5
w asam amino = [(x)] ppm . 10-3 L
= 11308,85 ppm . 10-3 L
= 11,309 mg
w asam a min o
w protein = 100%
w sampel
11,309mg
= 100%
1000mg
= 1,13%
4. Kadar Pepton
A 0,291
Konsentrasi = 5703,42 ppm
a 5,1022 10 5
w asam amino = [(x)] ppm . 10-3 L
= 5703,42 ppm . 10-3 L
= 5,703 mg
w asam a min o
w protein = 100%
w sampel
5,703mg
= 100%
1000mg
= 0,57%
5. Kadar Gelatin
A 0,378
Konsentrasi = 7408,57 ppm
a 5,1022 10 5
w asam amino = [(x)] ppm . 10-3 L
= 7408,57 ppm . 10-3 L
= 7,408 mg
w asam a min o
w protein = 100%
w sampel
7,408mg
= 100%
1000mg
= 0,74%
3. Senyawa yang tidak memiliki ikatan peptida atau asam amino tunggal.
4. Iya, cara menentukan kadar proteinnya dengan menambahkan larutan pembentuk
kompleks dengan asam amino dan pemberi suasana basa pada asam amino.