Petunjuk Praktikum

ISOLASI DAN UJI FAGOSITOSIS MAKROFAG

Oleh :

Dr. dr. Mahardika A Wijayanti, DTM&H., M.Kes.

S2 Ilmu Kedokteran Tropis

Fakultas Kedokteran UGM
Yogyakarta

Kursus Biologi Molekuler & Imunologi, S2 Ilmu Kedokteran Tropis Fakultas Kedokteran UGM
17 - 22 Maret 2014
CARA KERJA
1. Isolasi dan Kultur Sel Makrofag Peritoneum Mencit.
 Mencit dibunuh dengan narkose menggunakan kloroform. Mencit
diletakkan dalam posisi terlentang, kulit bagian perut dibuka dan
dibersihkan selubung peritoneumnya dengan alkohol 70%.

 Suntikkan  10 ml medium RPMI dingin ke dalam rongga peritoneum,

tunggu  3 menit sambil ditekan-tekan secara perlahan.

 Cairan peritoneal diaspirasi dari rongga peritoneum dengan cara menekan

organ dalam dengan 2 jari, cairan diaspirasi dengan spuit injeksi, dipilih
pada bagian yang tidak berlemak dan jauh dari usus. Aspirat yang didapat
ditampung dalam tabung sentrifus dan disentrifus pada 1.200 rpm, 4C
selama 10 menit.

 Supernatan dibuang, kemudian ditambahkan 1 ml medium RPMI komplit

(mengandung FBS 10%) pada pellet yang didapat.

 Jumlah sel yang didapat dihitung dengan menggunakan hemositometer,

kemudian diresuspensikan lagi dengan medium RPMI komplet sehingga
didapat suspensi sel dengan kepadatan 2,5 x 106/ml.

 Suspensi sel yang telah dihitung dikultur pada sumuran microplate 24 yang
telah diberi cover slips bulat, setiap sumuran 200l (5 x 105 sel).

 Inkubasikan dalam inkubator CO2 5%, 37C selama 30 menit. Kemudian

ditambahkan medium RPMI komplit 1 ml/ sumuran dan diinkubasikan lagi
selama 2 jam. Sel dicuci dengan RPMI 2x kemudian ditambahkan medium
komplit 1 ml/ sumuran dan inkubasi dilanjutkan sampai 24 jam.

2. UJI FAGOSITOSIS LATEX

 Cuci makrofag yang sudah di kultur dengan RPMI 2x
 Tambahkan suspensi latex dalam PBS sebanyak 200 L (5x106) atau
kepadatan latex dalam 1 mL = 2,5x107

Kursus Biologi Molekuler & Imunologi, S2 Ilmu Kedokteran Tropis Fakultas Kedokteran UGM
17 - 22 Maret 2014
 Inkubasikan dalam incubator CO2 , 30 menit
 Cuci dengan PBS 3x
 Keringkan pada suhu ruangan
 Fiksasi dengan metanol absolut selama 30 detik
 Buang metanol, tunggu sampai kering
 Cat dengan Giemsa 10% selama 20 menit
 Cuci dengan aquadest
 Angkat dari sumuran kultur dan keringkan pada suhu ruangan
 Periksa dibawah mikroskop cahaya dengan perbesaran 400x.
 Hitung persentase sel makrofag yang memfagosit partikel latex (%) dari
sekitar 300 sel.
 Hitung rerata jumlah partikel latex yang difagosit oleh setiap makrofag.

Macrophage

Latex

3. Isolasi Limfosit Limpa Mencit

 Mencit dibunuh dengan narkose menggunakan kloroform. Mencit

diletakkan dalam posisi terlentang, kulit bagian perut dibuka dan
dibersihkan selubung peritoneumnya dengan alkohol 70%.

 Kulit bagian perut dan selubung peritoneum dibuka, limpa diangkat dan
diletakkan dalam cawan petri diameter 50 mm yang berisi 5 mL medium
RPMI. Limpa dipotong-potong menjadi bagian-bagian kecil. Secara hati-hati
limpa dicabik-cabik dengan menggunakan pinset steril untuk mendapatkan
suspensi sel tunggal.

 Suspensi sel dimasukkan dalam tabung sentrifus 10 mL.

Kursus Biologi Molekuler & Imunologi, S2 Ilmu Kedokteran Tropis Fakultas Kedokteran UGM
17 - 22 Maret 2014
 Untuk mendapatkan pellet, sel disentrifus pada 1.200 rpm 4C selama 10
menit. Pellet yang didapat diresuspensikan dalam 2 mL Tris Buffered
Ammonium Chlorid untuk melisiskan eritrosit.

 Sel dicampur dengan menggunakan pipet dan didiamkan pada suhu

ruangan selama 2 menit.

 Tambahkan 1 mL FBS pada dasar tabung dengan menggunakan pipet.

Suspensi tersebut kemudian disentrifus pada 1.200 rpm 4C selama 5
menit dan supernatannya dibuang.

 Pellet dicuci dengan RPMI dengan cara dipipet berulang-ulang dan

disentrifus 1.200 rpm 4C selama 5 menit.

 Pellet yang didapat diresuspensikan dalam 4 mL medium komplit dan

dikultur dalam cawan petri diameter 50 mm dalam inkubator CO2 5%, 37C
selama 2 jam.

 Supernatan yang berisi sel-sel limfosit diambil dengan menggunakan pipet

dan ditampung dalam tabung sentrifus dan disentrifus pada 1.200 rpm 4C
selama 5 menit.

 Supernatannya dibuang dan sel limfosit diresuspensikan dengan medium

komplit. Sel dihitung dengan hemositometer dan ditentukan viabilitasnya
dengan tryphan blue . (1x106/Ml)

 Selanjutnya sel limfosit siap untuk diuji dan dikultur dalam inkubator CO2,
37C. Selama 72 jam

Sel limfosit dapat diuji untuk : - Kemampuan proliferasi

- Sekresi sitokin

Kursus Biologi Molekuler & Imunologi, S2 Ilmu Kedokteran Tropis Fakultas Kedokteran UGM
17 - 22 Maret 2014
4. UJI TRANSFORMASI BLAST SECARA MTT ASSAY

1) Suspensi limfosit dengan kepadatan 1x106 /ml dikultur pada mikroplate 96,
sebanyak 100 L /sumuran
2) Tambahkan mitogen (PHA) konsentrasi 50 g/mL sebanyak 10 L / sumuran.
3) Dikultur pada inkubator CO2 5%, 37C, selama 72 jam
4) Tambahkan MTT pada masing-masing sumuran , dengan konsentrasi 5 mg/ML
sebanyak 10 L
5) Inkubasikan selama 4 jam.
6) Stop reaksi dengan HCI Isopropanol 0,04 M sebanyak 100 L/ sumuran
7) Baca dengan ELISA reader pada 550 dengan referensi 620

MEDIUM KULTUR

Ada banyak medium kultur yang ditawarkan di pasaran, yang semuanya

didesain untuk menjadi media pertumbuhan yang optimal bagi sel. Bentuk
sediaan yang dipasarkan adalah cair, konsentrasi 1x atau 10x, atau dalam
bentuk powder.
Medium yang paling sering digunakan dalam kultur sel myeloma atau
hibridoma adalah RPMI 1640. Media ini mengandung garam-garam yang
diperlukan, asam amino, dan vitamin yang diperlukan untuk pertumbuhan
sel.Ada yang dilengkapi dengan glutamin maupun tidak serta phenol red
sebagai PH indikator. RPMI yang mengandung Glutamin biasanya hanya pada
yang bentuk powder karena bersifat tidak stabil dalam cairan, tetapi
diperlukan untuk pertumbuhan sel, sehingga sering ditambahkan pada
medium sesaat sebelum digunakan.

CARA MEMBUAT MEDIUM KULTUR

Bahan :
a) Botol steril 1L.
b) Aquadest 1L
c) RPMI Powder 1 sachet (10,4g)
d) NaHCO3 sol. ( 7,5%) 27mL per liter medium atau 2g/L
e) Hepes 2,86g
f) 50mM Mercapto Ethanol (ME) 1 mL
g) Filter 0,2m
Kursus Biologi Molekuler & Imunologi, S2 Ilmu Kedokteran Tropis Fakultas Kedokteran UGM
17 - 22 Maret 2014
Cara Membuat :
a) RPMI powder ditambahkan dalam 800 mL aquadest steril.
b) Tambahkan NaHCO3 cair atau powder, Hepes dan ME
c) Tambahkan aquadest hingga 1L
d) Campur homogen dengan cara distirer
e) Ukur PH pada 7,4 dengan penambahan 1M NaOH atau 1M HCl.
f) Sterilkan dengan cara difilter menggunakan filter 0,2m di dalam hood.
g) Beri label pada botol: nama medium, tanggal dan pemakai serta
disimpan pada suhu 4C
Bahan Tambahan :
1. Esensial
a. Bikarbonat/ Hepes : berfungsi untuk mempertahankan PH pada
medium kultur dengan keseimbangan antara bikarbonat terlarut dan
konsentrasi CO2.
b. Glutamin : konsentrasi 2mM perlu ditambahkan pada medium cair,
karena sifatnya yang tidak stabil dan mempunyai waktu paruh 3
minggu pada 4C dan 1 minggu pada 37C.
c. Serum : FBS dengan konsentrasi 10-20%.

2. Tidak esensial
a. Antibiotik: penisilin 100 g/mL dan steptomycin 100 g/mL.
b. 2-Mercapto Ethanol (50mM) : untuk meningkatkan sintesa antibody oleh
sel limpa.

MEDIUM KOMPLIT :
Medium RPMI : 100 mL
FBS : 10 mL
Pen-strep : 1 mL
Fungizone : 0.5 mL

Kursus Biologi Molekuler & Imunologi, S2 Ilmu Kedokteran Tropis Fakultas Kedokteran UGM
17 - 22 Maret 2014
PBS
- NaCl :8g
- KH2PO4 : 0,2 g
- Na2HPO4-12 H2O : 2,9 g
- KCl : 0,2 g
- Aquadest :1L
Semua bahan dicampur dengan stirer magnetic dan disterilkan dengan cara
autoclave, simpan pada 4C

Latex beats (Sigma L-30, 1x1 mL)

Diencerkan sesuai dengan kepadatan yang diperlukan sesaat sebelum
digunakan.

Round Cover slips :

Nunc TC Coverslips 174950 Thermanox  :13 mm

-0-

Kursus Biologi Molekuler & Imunologi, S2 Ilmu Kedokteran Tropis Fakultas Kedokteran UGM
17 - 22 Maret 2014