BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Pemicu

Dewi dan teman-teman sekelompoknya berdiskusi tentang peranan gen

dalam penentuan jenis kelamin sejak masa embrional. Mereka belajar bahwa
jenis kelamin ditentukan oleh gen SRY. Mereka menyimpulkan bahwa molekul
DNA membawa informasi genetik, yang selanjutnya diekspresikan secara
spesifik dalam sel. Untuk mengidentifikasi DNA dan ekspresinya dapat
dilakukan dengan beberapa teknik di laboratorium biologi molekuler.

1.2 Klarifikasi dan Definisi

1. Gen : segmen molekul DNA yang mengandung semua informasi yang
diperlukan untuk menyintesis suatu produk ( rantai polipeptida atau molekul
RNA ) dan merupakan unit biologis dari keturunan, sanggup
memperbanyak diri sendiri, dan ditransisikan dari orang tua ke
keturunannya, serta memiliki posisi tertentu ( lokus ) dalam genom.
2. Molekul : bagian terkecil senyawa dari kumpulan atom yang terikat secara
kimia.
3. Embrional : tahap awal perkembangan makhluk hidup, tahap melalui
pembelahanan mitosis sampai dengan proses organelgenesis.
4. DNA : polimer yang terdiri dari satuan-satuan berulang yang disebut
nukleotida.
5. Gen SRY : gen yang berperan penting dalam penentuan jenis kelamin laki-
laki dan perkodean suatu gen untuk merangsang pembentukan testis.
6. Biologi Molekuler : cabang ilmu pengetahuan yang memperlajari jaringan
antara struktur dan fungsi molekul-molekul hayati

1
1.3 Kata Kunci
1. Gen
2. Jenis kelamin
3. Informasi genetik
4. Identifikasi DNA
5. Ekspresi gen
6. Masa embrional
7. Biologi molekuler

1.4 Rumusan Masalah

Bagaimana peranan biologi molekuler dalam mengidentifikasi DNA
dan ekspresi gen ?

1.5 Analisis Masalah

Biologi Molekuler

DNA

Gen

Identifikasi Ekspresi Masa Menentukan

Gen SRY Jenis
DNA Gen Embional
Kelamin

Teknik

Biologi Molekuler

2
1.6 Hipotesis
Biologi molekuler berperan dalam identifikasi DNA dan ekspresi gen
melalui beberapa teknik.

1.7 Pertanyaan Diskusi

1. DNA
a. Definisi
b. Fungsi
c. Komponen
d. Struktur
2. Biologi Molekuler
a. Definisi
b. Lipid
c. Karbohidrat
d. Asam nukleat
e. Protein
3. Teknik-teknik ekspresi gen
a. Mekanisme gen SRY dalan menentukan jenis kelamin
b. Transkripsi
c. Translasi
d. Sequencing DNA
e. Southern Blot
f. Northern Blot
g. Western Blot
4. Teknik-teknik apa saja yang digunakan dalam identifikasi DNA ?
5. Teknik-teknik apa saja yang digunakan dalam identifikasi RNA ?
6. Teknik-teknik apa saja yang digunakan dalam identifikasi protein ?
7. Aspek fisika dalam biomol
a. Hukum stoke
b. Elektroforensis
c. Kromatografi

3
8. Definisi
a. mRNA
b. tRNA
c. rRNA
9. Informasi genetik dikemas dalam sel

4
 BAB II
PEMBAHASAN

2.1 DNA
2.1.1 Definisi
Deoxyribonucleic acid ( DNA ) adalah suatu materi yang
terdapat pada tubuh manusia dan semua makhluk hidup yang diwarisi
secara turun temurun. Semua sel pada tubuh memiliki DNA yang sama
dan sebagian besar terdapat pada nukleus. DNA juga dapat ditemukan
pada mitokondria.1
DNA juga merupakan makromolekul berupa benang sangat
panjang yang terbentuk dari sejumlah besar deoksiribonukleotida, yang
masing-masing tersusun dari satu basa, satu gula, dan satu gugus
fosfat. Basa pada molekul DNA membawa informasi genetik,
sedangkan gula dan gugus fosfat mempunyai peranan struktural.2

2.1.2 Fungsi
Fungsi DNA adalah untuk bereplikasi dan mensintesis protein.
Replikasi diperlukan untuk memberikan informasi yang sama pada tiap
sel baru ketika terjadi pembelahan. Dalam proses sintesis protein, DNA
menyediakan informasi genetik yang diperlukan oleh sel untuk dapat
berfungsi secara fungsional dan struktural. Informasi dari DNA
diturunkan dari generasi ke generasi dan merupakan kombinasi dari
ayah dan ibu.3
Informasi genetik yang tersimpan dalam sekuens nukleotida
DNA memiliki dua fungsi. Pertama, sebagai sumber informasi bagi
sintesis semua molekul protein sel dan organisme. Kedua, sebagai
informasi yang diwariskan ke keturunan atau sel anak. Kedua fungsi ini
memerlukan molekul DNA untuk berfungsi sebagai cetakan, pada kasus
pertama untuk transkripsi informasi ke dalam RNA dan pada kasus
kedua untuk replikasi informasi ke molekul DNA anak.4

5
 DNA juga memiliki peran penting dalam hal hereditas. Paket
semua informasi genetik dan dibagikan pada generasi berikutnya. Dasar
untuk ini terletak pada kenyataan bahwa DNA membuat gen dan gen
membuat kromosom. Manusia memiliki 23 pasang kromosom ( total 46
kromosom ). Dua puluh dua dari pasangan ini, yang disebut autosom,
terlihat sama pada laki-laki dan perempuan. 23 pasang kromosom
disebut kromosom seks dan berbeda antara pria dan wanita. Wanita
memiliki dua salinan dari kromosom X atau XX, sedangkan pria
memiliki satu X dan satu kromosom Y.5
Fungsi khusus DNA adalah untuk mengidentifikasi individu
karena urutan DNA setiap orang adalah unik, dapat dicocokkan pada
setiap individu seperti sidik jari. Ilmuwan forensik menggunakan bukti
DNA untuk mengidentifikasi orang dalam kasus pidana dan paternitas.
Bukti DNA tidak selalu mengidentifikasi tersangka atau pria sebagai
ayah dari seorang anak, kadang-kadang bukti forensik exonerates
tersangka atau menentukan bahwa manusia bukanlah ayah dari seorang
anak. Bukti DNA juga dapat digunakan untuk mengidentifikasi korban
bencana, seperti bencana alam atau serangan teroris.5

2.1.3 Komponen
Pada tahun 1953, Frances Crick dan James Watson menemukan
model molekul DNA sebagai suatu struktur heliks beruntai ganda, atau
yang lebih dikenal dengan heliks ganda Watson- Crick. DNA
merupakan makromolekul polinukleotida yang tersusun atas polimer
nukleotida yang berulang-ulang, tersusun rangkap, membentuk DNA
haliks ganda dan berpilin ke kanan.Setiap nukleotida terdiri dari gula
dan basa nitrogen.6
Struktur dari DNA terdiri dari gugus fosfat, gula deoksiribosa
dan basa nitrogen. Informasi yang dibawa oleh DNA bergantung pada
urutan basa nitrogen yang terdiri dari Adenin (A), Timin (T), Guanin (G)

6
dan Sitosin (C). Basa pada DNA selalu berpasangan yaitu A-T dan G-
C.6
Masing-masing pasangan basa melekat pada molekul gula
(deoksiribosa) dan fosfat membentuk unit nukleotida. Nukleotida
tersusun berpasangan pada baris panjang yang berbentuk spiral yang
sering disebut double helix.7
Secara kimia DNA mengandung karakteristik/sifat sebagai
berikut8 :
1. Memiliki gugus gula deoksiribosa.
2. Basa nitrogennya guanin (G), sitosin (C), timin (T) dan adenin (A).
3. Memiliki rantai heliks ganda anti paralel
4. Kandungan basa nitrogen antara kedua rantai sama banyak dan
berpasangan spesifik satu dengan lain. Guanin selalu berpasangan
dengan sitosin (G - C), dan adenidan adenin berpasangan dengan
timin (A - T), sehingga jumlah guanin selalu sama dengan jumlah
sitosin. Demikian pula adenin dan timin memiliki jumlah selalu
sama.

7
 2.1.4 Struktur
Struktur dari DNA terdiri dari gugus fosfat, gula deoksiribosa
dan basa nitrogen. Informasi yang dibawa oleh DNA bergantung
pada urutan basa nitrogen yang terdiri dari Adenin (A), Timin (T),
Guanin (G) dan Sitosin (C). Basa pada DNA selalu berpasangan yaitu
A-T dan G-C.9

2.2 Biologi Molekuler

2.2.1 Definisi

Biologi molekuler dan sel adalah ilmu-ilmu yang mempelajari

semua proses kehidupan di dalam sel pada tingkat molekuler. Untuk
melakukan hal itu, ilmu-ilmu ini memanfaatkan pengetahuan dari
sejumlah disiplin ilmu, diantaranya biokimia, sitologi, genetika,
mikrobiologi, embriologi, dan evolusi.6

Pengertian biologi molekular pada saat ini merupakan ilmu yang

mempelajari fungsi dan organisasi jasad hidup (organisme) ditinjau dari
struktur dan regulasi molekular unsur atau komponen penyusunnya.

8
 Biologi molekuler merupakan cabang ilmu biologi yang berkecimpung
dalam biomolekul seperti DNA, RNA, dan protein.10

2.2.2 Lipid

2.2.2.1 Definisi

Lipid adalah sekelompok senyawa heterogen,

meliputi lemak, minyak, steroid, malam (wax), dan
senyawa-senyawa lain yang terkait. Sifat umum lipid antara
lain tidak larut dalam air dan larut dalam pelarut non polar
seperti misalnya eter dan kloroform. Lipid merupakan salah
satu zat yang kaya akan energi yang penting dan
dipergunakan dalam metabolisme tubuh.11

Lipid adalah sekelompok senyawa non heterogen

yang meliputi asam lemak dan turunannya, lemak netral
(trigliserida), fosfolipid serta steroid.12

2.2.2.2 Struktur

Asam lemak yang sering di jumpai rantai karbon

yang panjang dan memiliki ikatan karbotksilat di ujungnya
memiliki struktur sebagai berikut12 :

9
2.2.2.3 Klasifikasi

Lipid dapat dibedakan dalam tiga kelompok besar, yaitu12 :

1. Lipid sederhana (simple lipids), Lipid sederhana

merupakan ester gugus asam lemak (sering disebut juga
sebagai gugus asil) dengan molekul alkohol gliserol.
Lipid sederhana dapat berbentuk monogliserida,
digliserida atau trigliserida (triasilgliserol). Trigliserida
merupakan lipid yang tersimpan dalam sitoplasma sel-sel
adiposa.
2. Lipid kompleks (complex lipids) lipid kompleks,
merupakan ester gugus asam lemak dengan molekul
alkohol, lipid kompleks juga berikatan dengan molekul
yang lain, seperti asam fosfat dan senyawa nitrogen
tertentu. Asam lemak tidak hanya mengalami proses
esterisasi menjadi molekul lipid yang lebih kompleks,
tapi juga dapat mengalami poses transformasi metabolik
menjadi senyawa-senyawa baru yang disebut sebagai
turunan lipid.
3. Turunan lipid (derived lipids). Turunan lipid dapat
dikelompokkan menjadi beberapa kelompok besar,
seperti eikosanoid, isoprenoid, badan keton (keton
bodies), dan sebagainya.

2.2.2.4 Fungsi

Lipid mempunyai fungsi sebagai sumber energi,

pembentukan sel, penghemat protein, penghasil panas tubuh,
pembentukan dari dinding sel, pelindung organ tubuh,
sumber asam lemak esensial, transporter vitamin larut lemak,
dan sebagai pelumas. Lemak yang beredar dalam tubuh

10
 diperoleh dari dua sumber yaitu dari makanan dan hasil
produksi organ hati. Lemak disimpan di dalam jaringan
adiposa, yang berfungsi sebagai insulator panas di jaringan
subkutan. Lipid diklasifikasikan menjadi dua yaitu lipid
sederhana dan lipid kompleks. Lipid sederhana meliputi
ester asam lemak dengan berbagai alkohol. Contoh lipid
sederhana antara lain11 :

1. Lemak (fat) merupakan ester asam lemak dengan gliserol.

2. Minyak (oil) adalah lemak dalam keadaan cair
3. Wax (malam) merupakan ester asam lemak dengan
alkohol monohidrat yang berat molekulnya tinggi
Berbeda dengan lipid sederhana, lipid kompleks
merupakan ester asam lemak yang mengandung gugus-
gugus selain alkohol dan asam lemak, seperti fosfolipid dan
glikolipid. Fosfolipid adalah lipid yang mengandung suatu
residu asam fosfor, selain asam lemak dan alkohol,
sedangkan glikolipid adalah lipid yang mengandung asam
lemak, sfingosin, dan karbohidrat. Lipid kompleks lain juga
meliputi sulfolipid, aminolipid, dan lipoprotein.4

2.2.3 Karbohidrat
2.2.3.1 Definisi
Karbohidrat yaitu senyawa organik terdiri dari unsur
karbon (C), hidrogen (H), dan oksigen (O) dengan
perbandingan 1 atom C, 2 atom H, 1 atom O. Karbohidrat
banyak terdapat pada tumbuhan dan binatang yang berperan
struktural & metabolik. Sedangkan pada tumbuhan untuk
sintesis CO2 + H2O yang akan menghasilkan
amilum/selulosa, melalui proses fotosintesis. Sedangkan
binatang tidak dapat menghasilkan karbohidrat sehingga

11
 tergantung tumbuhan. Karbohidrat merupakan sumber
energi dan cadangan energi, yang melalui proses
metabolisme. Rumus umum karbohidrat yaitu Cn(H2O)n,
sedangkan yang paling banyak kita kenal yaitu glukosa :
C6H12O6, sukrosa : C12H22O11, sellulosa : (C6H10O5)n.4
Karbohidrat merupakan salah satu dari sekelompok
turunan aldehida atau keton dari alkohol polihidrat,
dinamakan demikian karena hidrogen dan oksigen biasanya
membentuk air dalam proporsi tertentu Cn(H2O); yang
paling penting karbohidrat terdiri atas tepung , gula, glikogen,
selulosa dan gum. Karbohidrat tersebar luas dalam tumbuhan
dan hewan, seyawa ini memiliki peran struktural dan
metabolik yang penting.13
Glukosa adalah karbohidrat terpenting, kebanyakan
karbohidarat dalam makanan diserap ke dalam aliran darah
sebagai glukosa, dan gula lin diubah menjadi glukosa di hati.
Glukosa adalah bahan bakar metabolik utama pada mamalia
(kecuali pemamah biak)dan bahan bakar universal bagi
janin.13

2.2.3.2 Struktur
Struktur karbohidrat terdiri dari karbon, hidrogen dan
oksigen.4

12
 Strutur Glukosa dapat digambarkan dalam tiga
bentuk sebagai berikut:
1. Struktur rantai lurus

2. Struktur siklik

3. Struktur kursi

2.2.3.3 Klasifikasi

Klasifikasi karbohidrat yaitu4 :

1. Monosakarida : terdiri atas 3-6 atom C dan zat ini tidak

dapat lagi dihidrolisis oleh larutan asam dalam air
menjadi karbohidrat yang lebih sederhana. berikut
macam-macam monosakarida : dengan ciri utamanya
memiliki jumlah atom C berbeda-beda : triosa (C3),
tetrosa (C4), pentosa (C5), heksosa (C6), heptosa (C7).

13
 2. Disakarida : senyawanya terbentuk dari 2 molekul
monosakarida yg sejenis atau tidak. Disakarida dapat
dihidrolisis oleh larutan asam dalam air sehingga terurai
menjadi 2 molekul monosakarida.
3. Oligosakarida : senyawa yang terdiri dari gabungan
molekul 2 monosakarida yang banyak gabungan dari 3-
6 monosakarida, misalnya maltotriosa.
4. Polisakarida : senyawa yang terdiri dari gabungan
molekul-molekul monosakarida yang banyak jumlahnya,
senyawa ini bisa dihidrolisis menjadi banyak molekul
monosakarida. Polisakarida merupakan jenis karbohidrat
yang terdiri dari lebih 6 monosakarida dengan rantai
lurus/cabang.

2.2.3.4 Fungsi

Karbohidrat mempunyai beberapa fungsi penting,

diantaranya sebagai berikut4:
1. Sebagai komponen utama penyusun membran sel.
2. Sebagai sumber energi utama. Pada beberapa organ
tubuh seperti otak, lensa mata, dan sel saraf, sumber
energinya sangat bergantung kepada glukosa dan tidak
dapat digantikan oleh sumber energi lainnya. Setiap 1
gram glukosa menghasilkan 4,1 kkal.
3. Berperan penting dalam metabolisme, menjaga
keseimbangan asam dan basa, pembentuk struktur sel,
jaringan, dan organ tubuh.
4. Membantu proses pencernaan makanan dalam saluran
pencernaan, misalnya selulosa.
5. Membantu penyerapan kalsium, misalnya laktosa.

14
 6. Merupakan bahan pembentuk senyawa lain, misalnya
protein dan lemak.
7. Karbohidrat beratom C lima buah, yaitu ribosa
merupakan komponen asam inti yang amat penting
dalam pewarisan sifat.
8. Sumber energi dalam proses respirasi.

2.2.4 Asam Nukleat

2.2.4.1 Definisi

Asam nukleat merupakan polimer besar tersusun dari

monomer nukleotida dari gugus fosfat, basa nitrogen dan
gula pentosa. Basa nitrogen berasal dari kolompok purin dan
pirimidin. Purin utama asam nukleat adalah adenin dan
guanin, sedangkan pirimidinnya adalah sitosin, timin dan
urasil.14

Asam nukleat merupakan senyawa yang tersusun

dari basa nitrogen, gula, dan gugus fosfat yang disebut
nukleotida. Asam nukleat terbagi menjadi DNA dan RNA.
DNA terdiri dari empat basa yaitu adenine, guanine, timin
dan sitosin yang disatukan dalam rangkaian linear oleh
ikatan fosfodiester melalui posisi 3’ dan 5’ gugus-gugus
deoksiribosa yang berdekatan.4

2.2.4.2 Struktur

Rangkaian nukleotida pada DNA dan RNA

dihubungkan dengan jembatan gugus tat (ikatan
fosfodiester). Jembatan tersebut menghubungkan gugus
hidroksi C-5 (5’) pentosa suatu nukleotida dengan gugus

15
 hidroksi pada C-3 (3’) pentosa nukleotida yang lain. Aturan
menuliskan rantai tunggal asam nukleat dimulai dari gugus
akhir 5’ di sebelah kiri dan gugus akhir 3’ disebelah kanan.4
Contoh : 5’-ACTGTAAATGCC-3’

2.2.4.3 Klasifikasi

Asam nukleat dalam sel ada dua jenis yaitu DNA

(deoxyribonucleic acid) atau asam deoksiribonukleat dan
RNA (ribonucleic acid) atau asam ribonukleat. Baik DNA
maupun RNA berupa anion dan pada umumnya terikat oleh
protein dan bersifat basa. Misalnya DNA dalam inti sel
terikat pada histon. Senyawa gabungan antara protein
danasam nukleat disebut nucleoprotein. Molekul asam
nukleat merupakan polimer sepertiprotein tetapi unit
penyusunnya adalah nukleotida. Salah satu contoh

16
 nukleutida asam nukleat bebas adalah ATP yang berfungsi
sebagai pembawa energi.4

2.2.4.4 Fungsi

DNA tersusun menjadi dua untai oleh pembentukan

pasangan basa adenin ke timin dan guanin ke sitosin pada
untai komplementer. Untai-untai ini membentuk heliks
ganda di sekeliling satu sumbu sentral. DNA berperan
sebagai cetakan untuk replikasinya sendiri dan karena itu
berfungsi untuk mempertahankan genotipenya dan untuk
transkripsi sekitar 25.000 gen manusia pengode protein serta
sejumlah besar RNA regulatorik yang tidak mengode
protein.4

Sedangkan RNA terdapat dalam beberapa struktur

untai tunggal yang berbeda, sebagian besar secara langsung
atau tak langsung berperan dalam sintesis protein atau
regulasinya. Rangkaian linear nukleotida pada RNA terdiri
dari adenin, guanine, sitosin, dan urasil, dan gugus gulanya
adalah ribose.4

Bentuk-bentuk utama RNA mencakup mRNA,

rRNA, tRNA, dan snRNA (miRNA). Molekul RNA tertentu
berfungsi sebagai katalis (ribozim).4

2.2.5 Protein

2.2.5.1 Definisi

Protein adalah suatu senyawa organik yang

mempunyai berat molekul besar antara ribuan hingga jutaan
satuan (g/mol). Protein tersusun dari atom-atom C,H,O dan

17
 N ditambah beberapa unsur lainnya seperti P dan S. Atom-
atom itu membentuk unit-unit asam amino. Urutan asam
amino dalam protein maupun hubungan antara asam amino
satu dengan yang lain, menentukan sifat biologis suatu
protein.15

Protein merupakan makromolekul yang menyusun

lebih dari separuh bagian dari sel. Protein menentukan
ukuran dan struktur sel, komponen utama dari sistem
komunikasi antar sel serta sebagai katalis berbagai reaksi
biokimia di dalam sel. Karena itulah sebagian besar aktivitas
penelitian biokimia tertuju pada protein khususnya hormon,
antibodi dan enzim.16

2.2.5.2 Struktur

Pada protein terdapat 4 tingkat struktur yang berbeda

yaitu9 :
a) Struktur Primer
Susunan linier asam amino dalam protein merupakan
struktur primer. Susunan tersebut merupakan suatu

rangkaian unik dari asam amino yang menentukan sifat

18
 dasar dari berbagai protein dan secara umum
menentukan bentuk struktur sekunder dan tersier.

b) Struktur Sekunder
Kekuatan di antara asam amino dalam rangkaian protein
menyebabkan struktur utama membelit, melingkar, dan
melipat diri sendiri. Bentuk-bentuk yang dihasilkan
dapat spriral, heliks, dan lembaran. Bentuk ini
dinamakan struktur sekunder. Dalam kenyataannya
struktur protein biasanya merupakan polipeptida yang
terlipat-lipat dalam bentuk tiga dimensi dengan cabang-
cabang rantai polipeptidanya tersusun saling berdekatan.
Di dalam struktur sekunder protein terdapat heliks-α dan
lembar-β.
a. Heliks- α
Pada suatu heliks- α, terbentuk ikana hidrogen antara
masing-masing atom oksigen karbonil pada sebuah
ikatan peptida dengan hidrogen yang melekat pada
atom nitrogen amida pada suatu ikatan peptida 4
residu asam amino di sepanjang rantai polipeptida.
Dengan demikian, terbnetuk struktur kumparan (ulir)
reguler dimana masing-masing ikatan peptida
dihubungkan oleh ikatan hidrogen ke ikatan peptida
4 residu asam amino di depannya dan 4 asam amino
di belakangnya dalam ururan polimer.
b. Lembar- β
Berbeda dengan kumparan heliks- α, lembar- β
terbentuk melalui ikatan hidrogen antara daerah
linear rantai polipeptida. Ikatan hidrogen ini terjadi
antara oksigen karbonil suatu ikatan peptida dan
nitrogen dari ikatan peptida lainnya.

19
c) Struktur Tersier
Struktur tersier suatu protein adalah konformasi tiga
dimensi keseluruhannya. Bentuk protein globular
melibatkan interaksi antara residu asam amino yag
mungkin terletak sangat jauh satu sama lain pada urutan
primer rantai polipeptida dan melibatkan heliks-α dan
lembar-β. Interaksi nonkovalen antara rantai sisi residu
asam amino penting untuk menstabilkan struktur tersier
dan terdiri dari interaksi hidrofobik dan elektrostatik
serta ikatan hidrogen.

20
 d) Struktur Kuartener
Struktur kuartener adalah stuktur tiga dimensi suatu
protein yang terdiri dari subunit. Subunit tersebut
disatukan oleh jenis interaksi nonkavalen yang sama
yang berperan pada struktur tersier, yaitu interaksi
elektrostatik dan hidrofobik serta ikatan hidrogen.

2.2.5.3 Klasifikasi

1. Berdasarkan Fungsi Biologisnya17

a. Protein Enzim
Golongan protein ini berperan pada biokatalisator
dan pada umumnya mempunyai bentuk globular.
Protein enzim ini mempunyai sifat yang khas, karena
hanya bekerja pada substrat tertentu. Yang termasuk
golongan ini antara lain:
1) Peroksidase yang mengkatalase peruraian
hidrogen peroksida.
2) Pepsin yang mengkatalisa pemutusan ikatan
peptida.
3) Polinukleotidase yang mengkatalisa hidrolisa
polinukleotida.

21
 b. Protein Pengangkut
Protein pengangkut mempunyai kemampuan
membawa ion atau molekul tertentu dari satu organ
ke organ lain melalui aliran darah. Yang termasuk
golongan ini antara lain:
1) Hemoglobin pengangkut oksigen.
2) Lipoprotein pengangkut lipid.
c. Protein Struktural
Peranan protein struktural adalah sebagai pembentuk
struktural sel jaringan dan memberi kekuatan pada
jaringan. Yang termasuk golongan ini adalah elastin,
fibrin, dan keratin.
d. Protein Hormon
Adalah hormon yang dihasilkan oleh kelenjar
endokrin membantu mengatur aktifitas metabolisme
didalam tubuh.
e. Protein Pelindung
Protein pada umumnya terdapat pada darah,
melindungi organisme dengan cara melawan
serangan zat asing yang masuk dalam tubuh.
f. Protein Kontraktil
Golongan ini berperan dalam proses gerak, memberi
kemampuan pada sel untuk berkontraksi atau
mengubah bentuk. Yang termasuk golongan ini
adalah miosin dan aktin.
g. Protein Cadangan
Protein cadangan atau protein simpanan adalah
protein yang disimpan dan dicadangan untuk
beberapa proses metabolisme.
2. Berdasarkan Struktur Susunan Molekul17
a. Protein Fibriler/Skleroprotein

22
 Protein ini berbentuk serabut, tidak larut dalam
pelarut-pelarut encer, baik larutan garam, asam, basa,
ataupun alkohol. Berat molekulnya yang besar belum
dapat ditentukan dengan pasti dan sukar dimurnikan.
Susunan molekulnya terdiri dari rantai molekul yang
panjang sejajar dengan rantai utama, tidak
membentuk kristal dan bila rantai ditarik memanjang,
dapat kembali pada keadaan semula. Kegunaan
protein ini terutama hanya untuk membentuk struktur
bahan dan jaringan. Contoh protein fibriler adalah
kolagen yang terdapat pada tulang, rawan, miosin
pada otot, keratin pada rambut, dan fibrin pada
gumpalan darah.
b. Protein Globuler/Sferoprotein
Protein ini berbentuk bola, banyak terdapat pada
bahan pangan seperti susu, telur, dan daging. Protein
ini larut dalam larutan garam dan asam encer, juga
lebih mudah berubah dibawah pengaruh suhu,
konsentrasi garam, pelarut asam, dan basa jika
dibandingkan dengan protein fibriler. Protein ini
mudah terdenaurasi, yaitu susunan molekulnya
berubah yang diikuti dengan perubahan sifat fisik
dan fisiologiknya seperti yang dialami oleh enzim
dan hormon.

23
3. Berdasarkan Komponen Penyusunan17
a. Protein Sederhana
Protein sederhana tersusun oleh asam amino saja,
oleh karena itu pada hidrolisisnya hanya diperoleh
asam-asam amino penyusunnya saja. Contoh protein
ini antara lain, albumin, globulin, histon, dan
prolamin.
b. Protein Majemuk
Protein ini tersusun oleh protein sederhana dan zat
lain yang bukan protein. Zat lain yang bukan protein
disebut radikal protestik. Yang termasuk dalam
protein ini adalah:
1) Phosprotein dengan radikal prostetik asam
phostat.
2) Nukleoprotein dengan radikal prostetik asam
nukleat.
3) Mukoprotein dengan radikal prostetik
karbohidrat.
4. Berdasarkan Asam Amino Penyusunnya17
a. Protein yang tersusun oleh asam amino esensial
Asam amino esensial adalah asam amino yang
dibutuhkan oleh tubuh, tetapi tubuh tidak dapat
mensintesanya sendiri sehingga harus didapat atau
diperoleh dari protein makanan. Ada 10 jenis asam
esensial yaitu isoleusin (ile), leusin (leu), lisin (lys),
metionin (met), sistein (cys), valin (val), triptifan
(tryp), tirosina (tyr), fenilalanina (phe), dan treonina
(tre).
b. Protein yang tersusun oleh asam amino non esensial
Asam amino non esensial adalah asam amino yang
ibutuhkan oleh tubuh dan tubuh dapat mensintesa

24
 sendiri melalui reaksiaminasi reduktif asam keton
atau melaui transaminasi. Yang termasuk dalam
protein ini adalah alanin, aspartat, glutamat,
glutamine.
5. Berdasarkan Sumbernya17
a. Protein Hewani
Yaitu protein dalam bahan makanan yang berasal
dari hewan, seperti protein daging, ikan, ayam, telur,
dan susu.
b. Protein Nabati
Yaitu protein yang berasal dari bahan makanan
tumbuhan, seperti protein jagung, kacang panjang,
gandum, kedelai, dan sayuran
6. Berdasarkan Tingkat Degradasi17
a. Protein alami adalah protein dalam keadaan seperti
protein dalam sel.
b. Turunan protein yang merupakan hasil degradasi
protein pada tingkat permulaan denaturasi. Dapat
dibedakan sebagai protein turunan primer (protean,
metaprotein) dan protein turunan sekunder (proteosa,
pepton, dan peptida).

2.2.5.4 Fungsi

1. Sebagai Enzim18
Hampir semua reaksi biologis dipercepat atau di bantu
oleh suatu senyawa makromolekul spesifik yang disebut
enzim, dari reaksi yang sangat sederhana seperti reaksi
transportasi karbondioksida yang sangat rumit seperti
replikasi kromosom. Protein besar peranannya terhadap
perubahan-perubahan kimia dalam sistem biologis.

25
2. Alat Pengangkut dan Penyimpanan18
Banyak molekul dengan MB kecil serta beberapa ion
dapat diangkut atau dipindahkan oleh protein-protein
tertentu. Misalnya hemoglobin mengangkut oksigen
dalam eritrosit, sedangkan mioglobin mengangkut
oksigen dalam otot.
3. Pengatur Pergerakan18
Protein merupakan komponen utama daging, gerakan
otot terjadi karena adanya dua molekul protein yang
saling bergeseran.
4. Penunjang Mekanik18
Kekuatan dan daya tahan robek kulit dan tulang
disebebkan adanya kolagen, suatu protein berbentuk
bulat panjang dan mudah membentuk serabut
5. Pertahanan Tubuh atau Imunisasi18
Pertahanan tubuh biasanya dalam bentuk antibody, yaitu
suatu protein khusus yang dapat mengenal dan
menempel atau mengikat benda-benda asing yang masuk
ke dalam tubuh seperti virus, bakteri, dan sel-sel asing
lain.
6. Media Perambatan Impuls Saraf18
Protein yang mempunyai fungsi ini biasanya berbentuk
reseptor, misalnya rodopsin, suatu protein yang
bertindak sebagai reseptor penerima warna atau cahaya
pada sel-sel mata
7. Pengendalian Pertumbuhan18

26
 Protein ini bekerja sebagai reseptor (dalam bakteri) yang
dapat mempengaruhi fungsi bagian-bagian DNA yang
mengatur sifat dan karakter bahan.

2.3 Teknik-Teknik Ekspresi Gen

2.3.1 Mekanisme gen SRY dalam menentukan jenis kelamin
Embrio awal dari laki-laki dan perempuan - melalui minggu
keenam dari pertumbuhan dan perkembangan manusia - memiliki
genitalia yang identik dan belum terdiferensiasi. Kejadiannya,
kromosom Y mengandung sebuah gen, testes-determining factor (TDF),
yang menginduksi diferensiasi testis, yang dimana pada sekresi
hormonalnya, meningkatkan perkembangan dan pertumbuhan laki-laki.
Kromosom ini juga disebut sebagai gen SRY (Sex-determining Region
of Y) yang mengkode 80 residu dari motif ikatan DNA.4
Penentuan jenis kelamin pada manusia di atur oleh kromosom Y
yang menentukan jenis kelamin pria. Pada kromosom ini terdapat gen
SRY (sex determining of Y chromosome). Apabila gen SRY ini di
ekspresikan pada saat perkembangan, maka protein yang dihasilkan
akan memicu sel sertoli untuk berdiferensiasi menjadi jaringan gonad
pada minggu ke-7. Perkembangan sel sertoli ini akan mensekresikan
hormone Mullerian-inhibiting hormone (MIH) yang akan menyebabkan
duktus paramesonefros mengalami apoptosis. Maka dari itu, duktus ini
tidak ikut berkontribusi pada system reproduksi laki-laki. Stimulasi dari
hCG (Human Chorionic gonadotropin) akan menyebabkan sel-sel
Leydig pada jaringan gonad mensekresikan testosterone pada minggu
ke-8. Testosterone akan menstimulus perkembangan duktus
mesonephros menjadi epididimis, vas deferen, duktus ejakulatorius,
vesikel seminularis. Testis akan berhubungan dengan duktus
mesonephros melalui serangkaian tubulus yang berasal dari tubulus
seminiferus. Kelenjar prostat dan bulbouretral merupakan bagian
endodermal dari uretra.19

27
2.3.2 Transkripsi
Transkripsi merupakan sintesis RNA berdasarkan template
DNA. Kedua asam nukleat menggunakan bahasa yang sama dan
informasinya tinggal ditranskripsi (disalin) dari satu molekul ke molekul
yang lain. Persis sebagai mana saat proses replikasi, untai DNA
menyediakan suatu cetakan (template) untuk sintesis untai komplemen
terbaru, pada transkripsi juga disediakan template untuk menyusun
RNA.20

Transkripsi adalah proses penyalinan kode-kode genetik yang

ada pada urutan DNA menjadi molekul RNA. Transkripsi (sintesis RNA)
dilakukan melalui beberapa tahapan yaitu20 :

1. Faktor-faktor pengendali transkripsi menempel di bagian promoter,

misalnya RNA polimerase (Inisiasi).
2. Pembentukan kompleks promotor terbuka (open promoter complex).
Tidak seperti replikasi di mana DNA benar-benar dibuka, pada
transkripsi pilinan DNA dibuka namun masih tetap di dalam RNA
polimerase.
3. RNA polimerase membaca DNA cetakan (template) dan mulai
melakukan pengikatan nukleotida yang komplementer (Elongasi).
4. Setelah pemanjangan untaian RNA, diikuti dengan terminasi yang
ditandai dengan lepasnya RNA polimerase dari DNA yang
ditranskripsi (Terminasi).

Walaupun tahapan-tahapan yang terjadi sama antara eukariot

maupun prokariot, namun ada perbedaan fundamental dalam hal
struktur gen, faktor-faktor pengendali, mekanisme serta regulasi.
Meskipun ada perbedaan, namun secara umum pola mekanisme sintesis
RNA serupa. Baik pada eukariot maupun prokariot, prinsip yang harus
dipegang yaitu20 :

28
 1. Prekursor untuk sintesis RNA ada 4 macam ribonukleotida: 5′-

trifosfat ATP, GTP, CTP, dan UTP (tidak ada timin pada RNA).
2. Reaksi polimerisasi atau pemanjangan RNA sama dengan replikasi

DNA yaitu dengan arah 5′3′ (5′-PO4 ke 3′-OH).

3. Urutan nukleotida RNA hasil sintesis ditentukan oleh urutan DNA

template (Gambar 5).
4. Untai DNA yang berperan sebagai cetakan hanya salah satu untai.
5. Hasil transkripsi berupa molekul RNA untai tunggal.

RNA polimerase bekerja dengan membaca template dengan arah

3′ → 5′, namun sintesis mRNA adalah dari 5′ → 3’

2.3.3 Translasi

Translasi adalah proses penerjemahan kode genetik oleh tRNA

ke dalam urutan asam amino. Translasi menjadi tiga tahap (sama seperti
pada transkripsi) yaitu inisiasi, elongasi, dan terminasi. Semua tahapan
ini memerlukan faktor-faktor protein yang membantu mRNA, tRNA,
dan ribosom selama proses translasi. Inisiasi dan elongasi rantai
polipeptida juga membutuhkan sejumlah energi. Energi ini disediakan

29
oleh GTP (guanosin triphosphat), suatu molekul yang mirip dengan
ATP.4

1. Inisiasi
Tahap inisiasi terjadi karena adanya tiga komponen yaitu mRNA,
sebuah tRNA yang memuat asam amino pertama dari polipeptida,
dan dua sub unit ribosom.
mRNA yang keluar dari nukleus menuju sitoplasma
didatangi oleh ribosom, kemudian mRNA masuk ke dalam “celah”
ribosom. Ketika mRNA masuk ke ribosom, ribosom “membaca”
kodon yang masuk. Pembacaan dilakukan untuk setiap 3 urutan basa
hingga selesai seluruhnya. Sebagai catatan ribosom yang datang
untuk mebaca kodon biasanya tidak hanya satu, melainkan beberapa
ribosom yang dikenal sebagai polisom membentuk rangkaian mirip
tusuk satu, di mana tusuknya adalah “mRNA” dan daging adalah
“ribosomnya”. Dengan demikian, proses pembacaan kodon dapat
berlangsung secara berurutan. Ketika kodon I terbaca ribosom
(misal kodonnya AUG), tRNA yang membawa antikodon UAC dan
asam amino metionin datang. tRNA masuk ke celah ribosom.
Ribosom di sini berfungsi untuk memudahkan perlekatan
yang spesifik antara antikodon tRNA dengan kodon mRNA selama
sintesis protein. Sub unit ribosom dibangun oleh protein-protein dan
molekul-molekul RNA ribosomal.
2. Elongasi
Pada tahap elongasi dari translasi, asam amino-asam amino
ditambahkan satu per satu pada asam amino pertama (metionin).
Ribosom terus bergeser agar mRNA lebih masuk, guna membaca
kodon II. Misalnya kodon II UCA, yang segera diterjemahkan oleh
tRNA berarti kodon AGU sambil membawa asam amino serine. Di
dalam ribosom, metionin yang pertama kali masuk dirangkaikan
dengan serine membentuk dipeptida.

30
 Ribosom terus bergeser, membaca kodon III. Misalkan
kodon III GAG, segera diterjemahkan oleh antikodon CUC sambil
membawa asam amino glisin. tRNA tersebut masuk ke ribosom.
Asam amino glisin dirangkaikan dengan dipeptida yang telah
terbentuk sehingga membentuk tripeptida. Demikian seterusnya
proses pembacaan kode genetika itu berlangsung di dalam ribobom,
yang diterjemahkan ke dalam bentuk asam amino guna dirangkai
menjadi polipeptida.
Kodon mRNA pada ribosom membentuk ikatan hidrogen
dengan antikodon molekul tRNA yang baru masuk yang membawa
asam amino yang tepat. Molekul mRNA yang telah melepaskan
asam amino akan kembali ke sitoplasma untuk mengulangi kembali
pengangkutan asam amino. Molekul rRNA dari sub unit ribosom
besar berfungsi sebagai enzim, yaitu mengkatalisis pembentukan
ikatan peptida yang menggabungkan polipeptida yang memanjang
ke asam amino yang baru tiba.
3. Terminasi
Tahap akhir translasi adalah terminasi. Elongasi berlanjut
hingga kodon stop mencapai ribosom. Triplet basa kodon stop
adalah UAA, UAG, dan UGA. Kodon stop tidak mengkode suatu
asam amino melainkan bertindak sinyal untuk menghentikan
translasi. Polipeptida yang dibentuk kemudian “diproses” menjadi
protein.

31
2.3.4 Sequencing DNA

Molekul DNA rekombinan yang memperlihatkan hasil positif

dalam reaksi hibridisasi dengan fragmen pelacak sangat diduga
sebagai molekul yang membawa fragmen sisipan atau bahkan gen
yang diinginkan. Namun, hal ini masih memerlukan analisis lebih
lanjut untuk memastikan bahwa fragmen tersebut benar-benar sesuai
dengan tujuan kloning. Analisis antara lain dapat dilakukan atas
dasar urutan (sekuens) basa fragmen sisipan.21
Sequencing adalah suatu metoda untuk membaca urutan basa-
basa nukleotida dari suatu gen. Penentuan urutan (sekuensing) basa
DNA pada prinsipnya melibatkan produksi seperangkat
molekul/fragmen DNA yang berbeda-beda ukurannya tetapi salah
satu ujungnya selalu sama. Selanjutnya, fragmen-fragmen ini
dimigrasikan/dipisahkan meng-gunakan elektroforesis gel

32
poliakrilamid atau polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) agar
pembacaan sekuens dapat dilakukan. Di bawah ini akan diuraikan
sekilas dua macam metode sekuensing DNA.21
1. Metode Maxam-Gilbert
Metode sekuensing DNA yang pertama dikenal adalah metode
kimia yang dikembangkan oleh A.M. Maxam dan W. Gilbert
pada tahun 1977. Chemical degradation : urutan molekul DNA
untai ganda ditentukan dengan menggunakan bahan kimia yang
memotong molekul DNA pada posisi nukleotida tertentu. Pada
metode ini fragmen-fragmen DNA yang akan disekuens harus
dilabeli pada salah satu ujungnya, biasanya menggunakan fosfat
radioaktif atau suatu nukleotida pada ujung 3’. Metode Maxam-
Gilbert dapat diterapkan baik untuk DNA untai ganda maupun
DNA untai tunggal dan melibatkan pemotongan basa spesifik yang
dilakukan dalam dua tahap.
Molekul DNA terlebih dahulu dipotong-potong secara
parsial menggunakan piperidin. Pengaturan masa inkubasi atau
konsentrasi piperidin akan menghasilkan fragmen-fragmen DNA
yang bermacam-macam ukurannya. Selanjutnya, basa
dimodifikasi menggunakan bahan-bahan kimia tertentu.
Dimetilsulfat (DMS) akan memetilasi basa G, asam format
menyerang A dan G, hidrazin akan menghidrolisis C dan T, tetapi
garam yang tinggi akan menghalangi reaksi T sehingga hanya
bekerja pada C. Dengan demikian, akan dihasilkan empat macam
fragmen, masing-masing dengan ujung G, ujung A atau G, ujung C
atau T, dan ujung C.

33
 Dari hasil PAGE pada gambar diatas dapat diketahui sekuens
fragmen DNA yang dipelajari atas dasar laju migrasi masing-
masing pita. Lajur kedua berisi fragmen-fragmen yang salah satu
ujungnya adalah A atau G. Untuk memastikannya harus dilihat pita-
pita pada lajur pertama. Jika pada lajur kedua terdapat pita-pita
yang posisi migrasinya sama dengan posisi migrasi pada lajur
pertama, maka dapat dipastikan bahwa pita-pita tersebut merupakan
fragmen yang salah satu ujungnya adalah G. Sisanya adalah pita-pita
yang merupakan fragmen dengan basa A pada salah satu
ujungnya. Cara yang sama dapat kita gunakan untuk memastikan
pita-pita pada lajur ketiga, yaitu dengan membandingkannya
dengan pita-pita pada lajur keempat.
Seperti halnya pada elektroforesis gel agarosa, laju
migrasi pita menggambarkan ukuran fragmen. Makin kecil ukuran
fragmen, makin cepat migrasinya. Dengan demikian, ukuran
fragmen pada contoh tersebut di atas dapat diurutkan atas dasar
laju/posisi migrasinya. Jadi, kalau diurutkan dari yang terkecil
hingga yang terbesar, hasilnya adalah fragmen-fragmen dengan
ujung TTGCCCCGCGTGGCGCAAAGG. Inilah sekuens fragmen
DNA yang dipelajari.21

2. Metode Sanger

34
 Dewasa ini metode sekuensing Maxam-Gilbert sudah
sangat jarang digunakan karena ada metode lain yang jauh lebih
praktis, yaitu metode dideoksi yang dikembangkan oleh A. Sanger
dan kawan-kawan pada tahun 1977 juga. Chain termination method
: urutan molekul DNA untai tunggal ditentukan dengan sintesis
rantai polinukleotida komplementer secara enzimatis.

Dewasa ini, hampir semua usaha sekuensing DNA dilakukan

dengan menggunakan metode terminasi rantai yang dikembangkan
oleh Frederick Sanger dan rekan-rekannya. Teknik tersebut
melibatkan terminasi atau penghentian reaksi sintesis DNA in vitro
yang spesifik untuk sekuens tertentu menggunakan substrat
nukleotida yang telah dimodifikasi.

Pada metode terminasi rantai (metode Sanger), perpanjangan

atau ekstensi rantai DNA dimulai pada situs spesifik pada DNA
cetakan dengan menggunakan oligonukleotida pendek yang disebut
primer yang komplementer terhadap DNA pada daerah situs
tersebut. Primer tersebut diperpanjang menggunakan DNA
polimerase, enzim yang mereplikasi DNA. Bersama dengan primer
dan DNA polimerase, diikutsertakan pula empat jenis basa
deoksinukleotida (satuan pembentuk DNA), juga nukleotida
pemutus atau penghenti rantai (terminator rantai) dalam konsentrasi
rendah (biasanya di-deoksinukleotida). Penggabungan nukleotida
pemutus rantai tersebut secara terbatas kepada rantai DNA oleh
polimerase DNA menghasilkan fragmen-fragmen DNA yang
berhenti bertumbuh hanya pada posisi pada DNA tempat nukleotida
tertentu tersebut tergabungkan. Fragmen-fragmen DNA tersebut
lalu dipisahkan menurut ukurannya dengan elektroforesis gel
poliakrilamida, atau sekarang semakin lazim dengan elektroforesis
menggunakan tabung gelas berjari-jari kecil (pipa kapiler) yang diisi
dengan polimer kental. Metode Sanger pada dasarnya

35
memanfaatkan dua sifat salah satu subunit enzim DNA
polimerase yang disebut fragmen klenow. Kedua sifat tersebut
adalah kemampuannya untuk menyintesis DNA dengan adanya
dNTP dan ketidakmampuannya untuk membedakan dNTP dengan
ddNTP. Jika molekul dNTP hanya kehilangan gugus hidroksil
(OH) pada atom C nomor 2 gula pentosa, molekul ddNTP atau
dideoksi nukleotida juga mengalami kehilangan gugus OH pada
atom C nomor 3 sehingga tidak dapat membentuk ikatan
fosfodiester. Artinya, jika ddNTP disambungkan oleh fragmen
klenow dengan suatu molekul DNA, maka polimerisasi lebih
lanjut tidak akan terjadi atau terhenti. Basa yang terdapat pada
ujung molekul DNA ini dengan sendirinya adalah basa yang dibawa
oleh molekul ddNTP. Dengan dasar pemikiran itu sekuensing
DNA menggunakan metode dideoksi dilakukan pada empat
reaksi yang terpisah. Keempat reaksi ini berisi dNTP sehingga
polimerisasi DNA dapat berlangsung. Namun, pada masing-
masing reaksi juga ditambahkan sedikit ddNTP sehingga kadang-
kadang polimerisasi akan terhenti di tempat-tempat tertentu sesuai
dengan ddNTP yang ditambahkan. Jadi, di dalam tiap reaksi akan
dihasilkan sejumlah fragmen DNA yang ukurannya bervariasi
tetapi ujung 3’nya selalu berakhir dengan basa yang sama. Sebagai
contoh, dalam reaksi yang mengandung ddATP akan diperoleh

36
fragmen-fragmen DNA dengan berbagai ukuran yang semuaya
mempunyai basa A pada ujung 3’nya.

Pada Gambar diatas diberikan sebuah contoh sekuensing

sebuah fragmen DNA. Tabung ddATP menghasilkan dua
fragmen dengan ukuran tiga dan tujuh basa; tabung ddCTP
menghasilkan tiga fragmen dengan ukuran satu, dua, dan empat
basa; tabung ddGTP menghasilkan dua fragmen dengan ukuran
lima dan sembilan basa; tabung ddTTP menghasilkan dua fragmen
dengan ukuran enam dan delapan basa. Di depan (arah 5’) tiap
fragmen ini sebenarnya terdapat primer, yang berfungsi sebagai
prekursor reaksi polimerisasi sekaligus untuk kontrol hasil
sekuensing karena urutan basa primer telah diketahui.

37
 Untuk melihat ukuran fragmen-fragmen hasil sekuensing
tersebut dilakukan elektroforesis menggunakan gel poliakrilamid
sehingga akan terjadi perbedaan migrasi sesuai dengan
ukurannya masing-masing. Setelah ukurannya diketahui,
dilakukan pengurutan fragmen mulai dari yang paling pendek
hingga yang paling panjang, yaitu fragmen dengan ujung C (satu
basa) hingga fragmen dengan ujung G (sembilan basa). Dengan
demikian, hasil sekuensing yang diperoleh adalah
CCACGTATG. Urutan basa DNA yang dicari adalah urutan
yang komplementer dengan hasil sekuensing ini, yaitu
GGTGCATAC.21

2.3.5 Southern Blot

Blot Southern merupakan proses perpindahan fragmen DNA
yang terpisah secara elektroforesis dari gel ke membran. Metode ini
diambil dari nama penemunya yaitu Edward M. Southern. Prinsipnya
adalah kapilaritas, dimana bufer yang merupakan fase gerak
diasumsikan akan membawa fragmen DNA dari gel ke
membran.Karena muatan DNA negatif sedangkan muatan membran
positif maka fragmen DNA akan menempel (blot) pada membran.
Membran yang digunakan pada proses blot southern adalah membran.
Tahap awal dari metode Blot Southern adalah pendigestian DNA
dengan enzim restriksi endonuklease sehingga terbentuk fragmen-
fragmen DNA yang lebih kecil. Kemudian DNA dipisahkan sesuai
ukuran dengan elektroforesis agarosa. Setelah DNA terpisah, dilakukan
pemindahan DNA ke membran nitroselulosa, tahap ini disebut dengan
tahap blotting.Membran nitroselulosa diletakkan pada bagian atas dari
gel agarosa. Pada teknik blotting dengan menggunakan vakum,
membran diletakkan pada bagian bawah gel.Tekanan diberikan secara
merata pada gel untuk memastikan terjadi kontak antara gel dengan
membran.Proses transfer berlangsung dengan memanfaatkan daya

38
 kapilaritas.setalah DNA ditransfer ke gel, membran nitroselulosa
dipanaskan dengan suhu tinggi (60oC-100oC) kemudian membran diberi
radiasi UV agar terbentuk ikatan kovalen dan permanen antara pita-pita
DNA dengan membran.Lalu, membran dicampur dengan probe
(pelacak) yang telah dilabel radioaktif, tetapi dapat juga digunakan label
nonradioaktif yang dapat berpendar.Probe yang digunakan adalah DNA
utas tunggal yang memiliki sekuen yang akan dideteksi.Probe
diinkubasi dengan membran agar dapat berhibridisasi dengan DNA
yang ada pada membran. Setelah proses hibridisasi, probe yang tidak
terikat dicuci dari membran sehingga yang tinggal hanya probe yang
hibrid dengan DNA di membran.Pola hibridisasi kemudian dideteksi
dengan visualisasi pada film X-ray melalui autoradiografi.22

2.3.6 Northern Blot

Northern Blot atau RNA Blot dikenalkan pertama kali pada tahun
1977.23 Dua tahun setelah teknik Southern Blot.22 Sebenarnya secara
umum teknik ini mirip dengan Southern Blot. Yang membedakan adalah
sampel yang digunakan, yaitu RNA. Dan yang perlu diingat adalah pada
umumnya RNA lebih mudah terdegradasi, sehingga sebisa mungkin
tangan kita tidak bersentuhan langsung dengan sampel RNA. Maka dari
itulah, saat bekerja Northern Blot diharuskan memakai kaos tangan,
bahkan masker. Teknik ini digunakan untuk melihat ekspresi
(transkripsi) suatu mRNA (gen) pada organ atau jaringan tertentu,
seperti daun, bunga, biji, batang, dan lain sebagainya.23

2.3.7 Western Blot

Western blot adalah teknik untuk mendeteksi suatu protein
spesifik dalam suatu sampel, seperti juga pada tekhnik imunohistokimia
dan ELISA (enzyme-link immunosorbent assay) meskipun terdapat
perbedaan mendasar dalam pelaksanaan dan analisisnya. Dengan
membandingkan kadar protein spesifik yang dicari dengan kadar

39
 rekombinan protein target yang diketahui sebagai suatu standar pada
western blot, kadar absolut protein spesifik tersebut dapat dianalisis
secara densitometri. Sedangkan bila standar yang digunakan adalah
gabungan dari semua protein sampel, atau adalah suatu sampel protein
house-keeping yang telah diketahui kuantitasnya, maka nilai relatif
kadar protein spesifik tersebut dapat dihitung. Banyak faktor dapat
mengurangi kualitas hasil western blot (dan dapat mempengaruhi hasil
densitometrinya).24
Analisis western blot sangat bergantung pada kualitas dari pita
protein target yang dihasilkan. Karena kuantifikasi dilakukan dengan
mengukur baik densitometri atau spektrofotometri pita. kejelasan dan
kekhususan dari pita-pita ini seharusnya tercapai. Teknik-teknik tertentu
dapat memecahkan masalah ini dan dapat membantu meningkatkan
kualitas hasil.24

2.4 Teknik Yang Digunakan Dalam Identifikasi DNA

Beberapa teknik analisis keanekaragaman genetik seperti RAPD, RFLP,
dan DGGE membutuhkan amplifikasi daerah genom tertentu dari suatu
organisme. Amplifikasi ini membutuhkan primer spesifik (sekuen
oligonukelotida khusus) untuk daerah tersebut. Primer biasanya terdiri dari 10-
20 nukleotida dan dirancang berdasarkan daerah konservatif dalam genom
tersebut. Makin panjang primer, makin harus spesifik daerah yang
diamplifikasi. Jika suatu kelompok organisme memang berkerabat dekat, maka
primer dapat digunakan untuk mengamplifikasi daerah tertentu yang sama
dalam genom kelompok tersebut. Beberapa faktor seperti konsentrasi DNA
contoh, ukuran panjang primer, komposisi basa primer, konsentrasi ion Mg, dan
suhu hibridisasi primer harus dikontrol dengan hati-hati agar dapat diperoleh
pita-pita DNA yang utuh dan baik.25
Keberhasilan teknik ini lebih didasarkan kepada kesesuaian primer dan
efisiensi dan optimasi proses PCR. Primer yang tidak spesifik dapat
menyebabkan teramplifikasinya daerah lain dalam genom yang tidak dijadikan

40
sasaran atau sebaliknya tidak ada daerah genom yang teramplifikasi. Optimasi
PCR juga diperlukan untuk menghasilkan karakter yang diinginkan. Optimasi
ini menyangkut suhu denaturasi dan annealing DNA dalam mesin PCR. Suhu
denaturasi yang rendah dapat menyebabkan belum terbukanya DNA utas ganda
sehingga tidak dimungkinkan terjadinya polimerisasi DNA baru. Proses
penempelan primer pada utas DNA yang sudah terbuka memerlukan suhu
optimum, sebab suhu yang terlalu tinggi dapat menyebabkan amplifikasi tidak
terjadi atau sebaliknya suhu yang terlalu rendah menyebabkan primer
menempel pada sisi lain genom yang bukan sisi homolognya; akibatnya dapat
teramplifikasi banyak daerah tidak spesifik dalam genom tersebut. Suhu
penempelan (annealing) ini ditentukan berdasarkan primer yang digunakan
yang dipengaruhi oleh panjang dan komposisi primer. Suhu penemelan ini
sebaiknya sekitar 5ºC di bawah suhu leleh. Secara umum suhu leleh (Tm)
dihitung dengan rumus Tm = 4(G+C) + 2(A+T)ºC.25
Berikut ini disajikan contoh hasil amplifikasi gen 16S-rRNA pada gel
elektroforesis dari bakteri dengan primer domain Bacteria 63f (5’-CAG GCC
TAA CAC ATG CAA GTC) dan 1387r (5’-GGG CGG WGT GTA CAA
GGC).25

1. PCR-RAPD
PCR-RAPD merupakan salah satu teknik molekuler berupa
penggunaan penanda tertentu untuk mempelajari keanekaragaman genetika.
Dasar analisis RAPD adalah menggunakan mesin PCR yang mampu
mengamplifikasi sekuen DNA secara in vitro. Teknik ini melibatkan
penempelan primer tertentu yang dirancang sesuai dengan kebutuhan. Tiap
primer boleh jadi berbeda untuk menelaah keanekaragaman genetik kelompok
yang berbeda.
Penggunaan teknik RAPD memang memungkinkan untuk mendeteksi
polimorfisme fragmen DNA yang diseleksi dengan menggunakan satu primer
arbitrasi, terutama karena amplifikasi DNA secara in vitro dapat dilakukan
dengan baik dan cepat dengan adanya PCR.Penggunaan penanda RAPD

41
relatif sederhana dan mudah dalam hal preparasi. Teknik RAPD memberikan
hasil yang lebih cepat dibandingkan dengan teknik molekuler lainnya. Teknik
ini juga mampu menghasilkan jumlah karakter yang relatif tidak terbatas,
sehingga sangat membantu untuk keperluan analisis keanekaragaman
organisme yang tidak diketahui latar belakang genomnya. Pada tanaman
tahunan RAPD dapat digunakan untuk meningkatkan efisiensi seleksi awal.
Teknik RAPD sering digunakan untuk membedakan organisme
tingkat tinggi (eucaryote). Namun demikian beberapa peneliti menggunakan
teknik ini untuk membedakan organisme tingkat rendah (procaryote) atau
melihat perbedaan organisme tingkat rendah melalui piranti organel sel
seperti mitokondria.

2. PCR-RFLP
Teknik ini mirip dengan RAPD pada prinsip penggunaan primer.
Untuk melihat polimorfisme dalam genom organisme digunakan juga
suatu enzim pemotong tertentu (restriction enzymes). Karena sifatnya
yang spesifik, maka enzim ini akan memotong situs tertentu yang dikenali
oleh enzim ini. Situs enzim pemotong dari genom suatu kelompok
organisme yang kemudian berubah karena mutasi atau berpindah karena
genetic rearrangement dapat menyebabkan situs tersebut tidak lagi
dikenali oleh enzim, atau enzim restriksi akan memotong daerah lain yang
berbeda. Proses ini menyebabkan terbentuknya fragmen-fragmen DNA
yang berbeda ukurannya dari satu organisme ke organisme lainnya.
Polimorfisme ini selanjutnya digunakan untuk membuat pohon
filogeni/dendogram kekerabatan kelompok.
Teknik RFLP sering digunakan untuk mengetahui perbedaan jenis
bakteri misalnya berdasarkan gen ribosomal DNA (contoh 16S-rRNA).
Oleh karenanya teknik ini seringkali pula disebut ARDRA (amplified
ribosomal DNA restriction analysis). Penggunaan teknik PCR-RFLP telah
pula mampu secara mengesankan mengungkap keanekaragaman genetik
mikroba yang tidak dapat dikulturkan di laboratorium. Dengan

42
 menggunakan teknik isolasi DNA dari lingkungan yang kemudian
dilanjutkan dengan amplifikasi dengan menggunakan primer spesifik
untuk 16S-rRNA telah dapat diungkap adanya jenis-jenis mikroba baru.
Dengan menggunakan primer tertentu, teknik ini juga dapat digunakan
untuk gen-gen lain yang ada dalam contoh lingkungan.
Pemilihan DNA ribosom untuk tujuan identifikasi suatu organisme
didasarkan pada:
1) Secara fungsional dan evolusioner memiliki sifat homolog dari
berbagai orgenisme yang berbeda
2) Molekul purba dengan struktur dan sekuen nukelotida sangat
konservatif
3) Sangat banyak di dalam sel
4) Cukup besar untuk memungkinkan uji statistik perbedaan-
perbedaannya satu sama lain
5) Kelihatannya tidak ada artifak perpindahan lateral antar organisme

3. PCR- ANALISIS SEKUEN

Analisis sekuen merupakan suatu teknik yang dianggap paling baik
untuk melihat keanekaragaman hayati suatu kelompok organisme. Teknik
ini berkembang setelah orang menciptakan mesin DNA sequencer. Pada
prinsipnya polimorfisme dilihat dari urutan atau sekuen DNA dari
fragmen tertentu dari suatu genom organisme. Untuk melihat
keanekaragaman jenis dapat dilakukan melalui analisis sekuen gen 16S-
rRNA bagi organisme prokaryota atau 18S-rRNA bagi organisme
eukaryota. Perbandingan sekuen rRNA merupakan alat yang baik untuk
mendeduksi hubungan filogeni dan evolusi di antara organisme bacteria,
archaebacteria, dan eukariot.

4. PCR-DGGE

43
 Teknik analisis ini sebenarnya mirip dengan RAPD ataupun RFLP,
hanya saja primer yang digunakan misalnya primer GC clamp.
Elektroforesis yang dilakukan menggunakan gel poliakrilamida dengan
gradien urea yang ditambah dengan formamida. Pemisahan dilakukan
tanpa enzim restriksi dan sekuen bukan berdasarkan berat molekul.
Teknik ini menggunakan dasar perbedaan stabilitas produk PCR. Dengan
demikian sangat tergantung dari jumlah ikatan hidrogen yang ada dalam
DNA tersebut.

5. MFLP
Pada prinsipnya semua teknik pemisahan DNA, misalnya pada
RFLP dan RAPD, menggunakan suatu teknik elektroforesis medan listrik
tetap dan satu arah (konfigurasi horizontal) dengan media agarose atau
akrilamid. Gel agarose memiliki kapasitas pemisahan yang lebih rendah
dibandingkan dengan gel akrilamid, tetapi memilik spektrum pemisahan
yang lebih besar. Teknik elektroforesis gel agarose konvensional ini
biasanya digunakan untuk memisahkan fragmen DNA dengan ukuran
relatif kecil dengan ukuran sekitar 200 bp sampai kira-kira 50 kb. Fragmen
dengan ukuran di atas 50 kb tidak lagi dapat dipisahkan dengan baik
dengan menggunakan teknik ini. Fragmen-fragmen ini akan bergerak
dalam kecepatan yang sama dalam gel agarosa. Batas kemampuan linier
tersebut melampaui ukuran pori-pori gel. Agar dapat terpisah fragmen
harus bergerak dari ujung ke ujung (end-on).
Masalah ini akhirnya dapat diatasi oleh Schwartz dan Cantor (1984)
yang memperkenalkan teknik pulsed field gel electrophoresis (PFGE).
Dengan teknik ini molekul DNA secara periodik merubah arah migrasi
selama elektroforesis. Beberapa teknik PFGE telah diperkenalkan, yaitu
field inversion gel electrophoresis (FIGE), contour clamped homogenous
electric field (CHEF), dan programmable, autonomously controlled
electrode gel electrophoresis (PAGE). Berbeda dengan teknik
elektroforesis lainnya, yang sering mengisolasi DNA dalam cairan, teknik

44
 PFGE ini membutuhkan DNA yang kurang lebih utuh. Isolasi DNA dalam
cairan seringkali menyebabkan DNA terpotong-potong dengan ukuran
rata-rata kurang dari 1000 kb. Untuk keperluan PFGE genom suatu
organisme biasanya diisolasi utuh dengan cara memerangkap sel dalam
agarose. Pemecahan dan pemurnian DNA selanjutnya dilakukan secara in
situ.
Teknik identifikasi dengan PFGE atau MFLP ini sangat
diskriminatif dalam membedakan strain suatu kelompok bakteri dengan
strain bakteri lainnya. Oleh karenanya teknik ini sering digunakan untuk
melihat perbedaan strain-strain bakteri spesies yang sama.

2.5 Teknik Yang Digunakan Dalam Identifikasi RNA

1. Northern Blotting
Blotting merupakan suatu teknik dimana asam nukleat akan di
immobilisasi pada membran nitroselulosa. Blooting asam nukleat adalah
teknik sentral dalam studi hibridisasi dalam pemahaman mengenai ekpresi
gen, organisasi, identifikasi protein terntentu. Metode blotting cukup
sederhana, biasanya terdiri dari empat tahapan: a. pemisahan protein atau
fragmen asam nukleat dalam sampel melalui elektroforesis, b. Kemudian di
transfer ke supporting paper untuk di immobilisasi, c. Berikatan dengan
probe analisis untuk molekul target, d. Visualisasi pengikatan probe. Teknik
blotting yang telah dikembangkan yaitu disebut Southern, Northern,
Western, Estern blotting.26
Northern blotting adalah cara untuk mengidentifikasi spesies RNA
tertentu dalam campuran kompleks RNA. Umumnya digunakan untuk
mengevaluasi secara kualitatif dan kuantitatif ekspresi gen. Northen blotting
melibatkan isolasi RNA, ukuran fraksinasi dari RNA terdenaturasi melalui
elektroforesis gel, transfer RNA dipisahkan melalui membran, hibridisasi
dengan probe yang spesifik, dan deteksi. RNA dipisahkan berdasarkan
ukuran dan kemudian ditransfer ke membran yang kemudian diperiksa
dengan pelengkap berlabel. Hasilnya dapat digambarkan melalui berbagai

45
cara tergantung pada label yang digunakan, intensitas band-band ini
berkaitan dengan jumlah RNA target dalam sampel yang dianalisis.26
Prosedur Northern Blotting umumnya digunakan untuk mempelajari
kapan dan berapa banyak ekspresi gen yang terjadi dengan mengukur
berapa banyak bahwa RNA hadir dalam sampel yang berbeda. Beberapa hal
yang membedakan dengan Southern blotting adalah: (1) RNA jauh lebih
rentan terhadap degradasi dibanding DNA, oleh karena itu elektroforesis
dilakukan dalam bufer yang mengandung zat kimia yang bersifat
melindungi (biasanya formaldehid), (2) RNA sudah berupa untai tunggal
dan membutuhkan kondisi denaturasi yang lebih ringan, (3) RNA biasanya
berukuran tertentu sehingga tidak memelukan digesti enzim untuk
memperoleh pola pita. Kedua prosedur sangat mirip karena setelah
elektroforesis RNA juga ditransfer ke membran melalui difusi kapilaritas.
Biasanya sinar UVdigunakan untuk mengikat (crosslink) RNA pada
membran sehingga tidak bergerak (imobilisasi).27
Prinsip Northern blotting adalah memisahkan RNA berdasarkan
ukurannya dan dideteksi menggunakan probe hybridisasi dengan
komplementary sekuens base untuk semua sekuens atau hanya bagian
sequens target mRNA (Gb.1). Ekstraksi RNA total merupakan tahapan
paling awal sebelum memulai Northern blotting.

46
 Untuk menghasilkan hasil yang baik analisis northern blotting
menggunakan 10 µg sampai 30 µg total RNA dalam formaldehyde gel.
Denaturing gels terdiri dari 1% agarose (molecular biology grade), 7.2%
(v/v) formaldehyde (stock solution is 40%) dalam 1.1 × MOPS buffer pH
7.0. RNA kemudian dimasukkna kedalam 50% deionised formamide
(Sigma), 7.2% (v/v) formaldehyde dan 0.5 × MOPS buffer kemudain
dipanaskan pada suhu 65◦C selama 15 minutes. Sample RNA kemudian
ditambahkan 2 µl loading buffer dan 1 µl ethidium bromide (1 mg/ml),
sampel kemudian di loading dengan electrophoresis pada 20 V/cm dalam 1
× MOPS buffer, sampai bromophenol blue berada 3 cm dari batas bawah
gel elektoforesis. RNA selanjutnya ditransfer ke membrane secara
conventional capillary blotting. Membrane kemudian dihibridisasi selama
semalam pada suhu 42◦C di waterbath.
Ketatnya pasca mencuci hibridisasi harus ditentukan secara
eksperimental untuk setiap probe tertentu. Membran dicuci secara
berurutan, dimulai pada 2 × SSC dan 0,1% SDS tiga kali selama 10 menit
pada suhu kamar, kemudian dua kali selama 15 menit pada 65◦C. Membran
hibrid dengan homolog, panjang (lebih dari 300 bp) probe mungkin akan

47
 memerlukan kondisi pencucian yang sedikit berbeda (yaitu, konsentrasi
garam yang lebih rendah); konsentrasi garam dapat dikurangi dengan
menggunakan 0,1 × SSC dan 0,1% SDS. Membran dicuci dibiarkan basah
dan dibungkus SaranTM, ditempatkan dalam sebuah autoradiografi cassete
yang mengandung layar dengan film sinar-X (HyperfilmTM) dan berada
pada -70◦C, selama 12 jam sampai 5 hari, tergantung pada intensitas sinyal
. Untuk kuantisasi akurat dari spesies mRNA tertentu dan untuk
memverifikasi pemuatan sama, yang terbaik adalah untuk strip dan reprobe
membran dengan gen housekeeping seperti aktin β.28

2.6 Teknik-teknik yang digunakan dalam identifikasi Protein

Dalam ilmu Kimia, pencampuran atau penambahan suatu senyawa
dengan senyawa yang lain dikatakan bereaksi bila menunjukkan adanya
tanda terjadinya reaksi, yaitu: adanya perubahan warna, timbul gas, bau,
perubahan suhu, dan adanya endapan. Pencampuran yang tidak disertai
dengan tanda demikian, dikatakan tidak terjadi reaksi kimia. Ada beberapa
reaksi khas dari protein yang menunjukkan efek/tanda terjadinya reaksi
kimia, yang berbeda-beda antara pereaksi yang satu dengan pereaksi yang
lainnya. Semisal reaksi uji protein (albumin) dengan Biuret test yang
menunjukkan perubahan warna, belum tentu sama dengan pereaksi uji
lainnya.29
Dalam mengidentifikasi protein ada beberapa pengujian yang umum
digunakan, diantaranya :
1. Uji Biuret
Biuret merupakan salah satu larutan yang digunakan untuk uji protein.
Larutan ini merupakan campuran antara ion kupri sulfat yang
dimasukkan dalam suasana basah, contohnya CuSO4. 5H2O yang
dimasukkan atau dicampur dengan NaOH. Larutan ini digunakan untuk
mendeteksi protein dalam jumlah besar yang ditandai dengan adanya
perubahan warna. Jika suatu sampel yang diuji mengandung lebih dari
2 ikatan peptida maka akan muncul warna ungu. Warna ini muncul

48
 karena terbentuknya ikatan koordinasi komplek antara atom Cu dengan
4 atom nitrogen yang berasal dari ikatan peptida. protein dengan
tembaga hidroksida membentuk kompleks berwarna ungu.30
2. Uji Ninhidrin
Selain penggunaan uji biuret, cara yang dapat digunakan untuk deteksi
protein dalam organisme ialah menggunakan uji ninhidrin. Ninhidrin
merupakan reagen pengoksidasi yang cukup kuat. Ninhidrin akan
bereaksi dengan semua asam amino pada pH 4-8 sehingga terbentuk
senyawa berwarna ungu. Reaksi ini merupakan reaksi yang sangat
sensitif dan sesuai untuk penentuan asam amino secara kualitatif.
Sehingga reagen ini dapat digunakan untuk mendeteksi ada atau
tidaknya protein dalam suatu sampel.31
3. Uji Millon
Pereaksi millon adalah larutan merkuro dan merkuri nitrat dalam asam
nitrat. Apabila pereaksi ini ditambahkan pada larutan protein, akan
menghasilkan endapan putih yang dapat berubah menjadi merah oleh
pemanasan. Pada dasarnya reaksi ini positif untuk fenol-fenol, karena
terbentuknya sentawa merkuri gugus hidroksifenil yang berwarna.
Protein yang mengandung tirosin akan memberikan hasil positif. Reaksi
ini tergantung adanya derivat monohidroksi benzen seperti tirosin dan
fenol. Reaksi ini akan terganggu jika ada ion klorida atau amilum32
4. Uji Pengaruh Alkohol terhadap Protein
Protein dapat membentuk presipitat dengan akohol dan beberapa akan
kembali jernih ketika ditambah air. Pada reaksi pengendapan alkohol,
larutan albumin akan membentuk endapan yang disebabkan karena
adanya gugus hidrofobik polar (yang menarik gugus non-polar) didalam
molekul protein dan menghasilkan protein dipol.33
5. Uji Xanthoproteat
Uji xanthoproteat, pengujian ini memberikan hasil positif terhadap asam
amino yang mengandung cincin benzena, seperti Fenilalanin, tirosin,
dan triptofan. Cara pengujiannya yaitu ke dalam protein ini ditambah

49
 asam nitrat pekat sehingga tebentuk endapan putih karena terjadi proses
nitrasi terhadap cincin benzena. Jika dipanaskan, warna putih tersebut
akan berubah menjadi warna kuning.18

2.7 Aspek Fisika Dalam Biomol

2.7.1 Hukum Stoke
Hukum stokes berbunyi : bila sebuah bola bergerak dalam
suatu fluida yang diam maka terhadap bola itu akan bekerja gaya
gesek dalam bentuk gaya gesekan yang arahnya berlawanan dengan
arah gerak bola tersebut.4
Syarat-syarat berlakunya hukum stokes :
1. Ruang tempat fluida terbatas
2. Tidak ada turbulensi di dalam fluida
3. Kecepatan ( v ) tidak besar sehingga aliran masih linear
Persamaan hukum stokes yaitu jika sebuah benda berbentuk
bola ( kelereng ) jatuh bebas dalam sebuah fluida kental,
kecepatannya akan bertambah karena pengaruh gravitasi bumi
hingga mencapai suatu kecepatan terbesar yang tetap. Kecepatan
terbesar yang tetap tersebut dinamakan kecepatan terminal. Pada
saat kecepatan terminal tercapai, berlaku keadaan ∑F=0.4

Persamaan hukum stokes yaitu

2.7.2 Elektroforesis
Elektroforesis adalah suatu cara analisis kimiawi yang
didasarkan pada pergerakan molekul-molekul protein bermuatan di
dalam medan listrik (titik isoelektrik). Pergerakan molekul dalam
medan listrik dipengaruhi oleh bentuk, ukuran, besar muatan dan
sifat kimia dari molekul.34
Teknik elektroforesis dapat dibedakan menjadi dua cara,
yaitu : elektroforesis larutan (moving boundary electrophoresis) dan
elektroforesis daerah (zone electrophoresis). Pada teknik

50
elektroforesis larutan, larutan penyangga yang mengandung makro-
molekul ditempatkan dalam suatu kamar tertutup dan dialiri arus
listrik. Kecepatan migrasi dari makromolekul diukur dengan jalan
melihat terjadinya pemisahan dari molekul (terlihat seperti pita) di
dalam pelarut. Sedangkan teknik elektroforesis daerah adalah
menggunakan suatu bahan padat yang berfungsi sebagai media
penunjang yang berisi (diberi) larutan penyangga.34
Di bidang ilmu biologi ataupun biologi molekuler, metode
elektroforesis banyak digunakan untuk taksonomi, sistematik dan
genetik dari hewan ataupun tumbuhan.34
Elektroforesis adalah suatu teknik yang mengukur laju
perpindahan atau pergerakan partikel-partikel bermuatan dalam
suatu medan listrik. Prinsip kerja dari elektroforesis berdasarkan
pergerakan partikel-partikel bermuatan negatif (anion), dalam hal
tersebut DNA, yang bergerak menuju kutub positif (anode),
sedangkan partikel-partikel bermuatan positif (kation) akan
bergerak menuju kutub negatif (anode).35
Elektroforesis digunakan untuk mengamati hasil amplifikasi
dari DNA. Hasil elektroforesis yang terlihat adalah terbentuknya
band yang merupakan fragmen DNA hasil amplifikasi dan
menunjukkan potongan-potongan jumlah pasangan basanya.35
Teknik elektroforesis mempergunakan medium yang terbuat
dari gel. Perpindahan partikel pada medium gel tersebut
dipengaruhi oleh faktor-faktor seperti ukuran partikel, komposisi
dan konsentrasi gel, densitas muatan, kuat medan listrik dan
sebagainya. Semakin kecil partikel tesebut, maka pergerakan atau
migrasinya akan semakin cepat, karena matriks gel mengandung
jaringan kompleks berupa pori-pori sehingga partikel-partikel
tersebut dapat bergerak melalui matriks tersebut.35
Di dalam elektroforesis digunakan sumber arus listrik searah
(DC), ruang untuk elektroforesis (Comb, Well, platform dan cetakan

51
 wadah gel), larutan buffer (buffer ionik dan loading buffer), matriks
elektroforesis, marker dan gel.35
Elektroforesis digunakan dengan tujuan untuk mengetahui
ukuran dan bentuk suatu partikel baik DNA, RNA dan protein.
Selain itu, elektroforesis juga digunakan untuk fraksionasi yang
dapat digunakan untuk mengisolasi masing-masing komponen dari
campurannya, mempelajari fitogenetika, kekerabatan dan
mempelajari penyakit yang diturunkan.35
Elektroforesis dalam bidang genetika, digunakan untuk
mengetahui ukuran dan jumlah basa yang dikandung suatu sekuen
DNA tertentu.35
Elektroforesis 2 Dimensi adalah suatu teknik analisis
pemisahan protein menggunakan dua dimensi yang diberi arus
listrik. Prinsip dasar dalam elektroforesis 2-D adalah dimensi
pertama dalam pemisahan protein dilakukan berdasarkan titik
isoelektriknya (Isoelectric point, IEP, pI) yaitu pada pH dimana
muatan tiap protein netral atau sama dengan 0. Pada dimensi kedua,
protein akan dipisahkan berdasarkan berat atau massa molekulnya.
Teknik ini sering digunakan untuk studi proteomika (analisis
molekular terhadap keseluruhan protein yang dihasilkan dari
ekspresi gen dalam sel) seperti melihat profil/pola protein, analisis
komparatif ekspresi dari 2 sampel protein atau lebih, lokalisasi dan
identifikasi pos translasi, studi interaksi protein-protein,
pemeriksaan kemurnian dan purifikasi (pemurnian) protein skala
mikro36

2.7.3 Kromatografi
Kromatografi adalah teknik analisis yang pemisahan
komponennya didasarkan pada perbedaan suatu sifat berpindah
antara dua fase, fase yang satu bergerak dan fase yang lain diam.37

52
 Kromatografi terbagi menjadi dua yaitu kromatografi gas
dan kromatografi kolom.37
Kromatografi didefinisikan sebagai prosedur pemisahan zat
terlarut oleh suatu proses migrasi differensial dinamis dalam sistem
yang terdiri dari 2 fase atau lebih, salah satu diantaranya, bergerak
secara berkesinambungan dalam arah tertentu dan diantaranya zat-
zat itu menunjukan perbedaan mobilitas disebabkan adanya
perbedaan dalam adsorpsi, partisi, kelarutan, tekanan uap, ukuran
molekul atau kerapatan muatan ion.38
Tehnik kromatografi umum membutuhkan zat terlarut
terdistribusi diantara dua fase, satu diantaranya fase diam, yang
lainnya fase bergerak. Fase bergerak zat terlarut melalui media,
hingga terpisah dari zat terlarut lainnya, yang tereluasi lebih awal
atau lebih akhir.38
Umumnya zat terlarut dibawa melewati media pemisah oleh
aliran suatu pelarut berbentuk cairan atau gas yang disebut eluen.
Fase diam dapat bertindak sebagai zat seperti penyerap alumina
yang diaktifkan, silikagel, dan resin penukar ion, atau dapat
bertindak melarutkan zat terlarut sehingga menjadi partisi antara
fase diam dan fase gerak. Dalam proses terakhir ini suatu lapisan
cairan pada suatu penyangga yang iner berfungsi sebagai fase diam.
Partisi merupakan mekanisme pemisahan yang utama dalam
kromatografi gas, cair, kertas, dan bentuk kromatografi kolom yang
disebut kromatografi cair-cair. Dalam praktek, seringkali pemisahan
disebabkan oleh suatu kombinasi efek adsorpsi dan partisi.38
Jadi berdasarkan perbedaan fase diam dan fase geraknya,
kromatografi dapat berupa kromatografi kolom, kromatografi gas,
kromatografi kertas, kromatografi lapis tipis dan kromatografi cair
kinerja tinggi. Kromatografi kertas dan kromatografi lapis tipis
umumnya lebih bermanfaat untuk tujuan identifikasi, karena mudah
dan sederhana. Kromatografi kolom memberikan pilhan fase diam

53
 yang lebih luas dan berguna untuk pemisahan masing-masing
senyawa secara kuantitatif. Kromatografi gas dan kromatografi cair
kinerja tinggi keduanya mebutuhkan peralatan yang lebih rumit dan
umumnya merupakan metode dengan resolusi tinggi yang dapat
mengidentifikasi serta menetapkan secara kuantitatif bahan dalam
jumlah yang sangat kecil.38

2.8 Definisi
2.8.1 mRNA
Messenger RNA (mRNA) adalah jenis RNA beruntai tunggal
(single strand) membawa informasi yang digunakan untuk mensintesis
protein.39 Nama messenger RNA diusulkan oleh Jacob dan Monod
(1961). Molekul dari mRNA adalah untai tunggal seperti molekul rRNA
dan komposisi dasar dari mRNA sama dengan DNA sehingga isi GC
mRNA sesuai dengan isi GC dari total genom yang ada, perkecualian
untuk basa nitrogen purin dimana pada DNA basa purin terdiri dari sitosin
(C) dan timin (T) sedangkan pada mRNA terdiri dari sitosin (C) dan urasil
(U).40
Selain untuk menjadi cetakan untuk sintesis untai komplementer
baru saat replikasi DNA, untai DNA juga berperan sebagai cetakan untuk
merakit sekuens nukeotida RNA kompelementer berupa mRNA. mRNA
adalah jenis RNA yang disintesis oleh DNA dalam nukleus sebagai
pembawa informasi genetik yang akan diterjemahkan nantinya pada saat
transkripsi. mRNA dibentuk oleh DNA. mRNA disintesis oleh DNA
template dengan bantuan enzim polymerase III. mRNA hasil transkripsi
pada sel eukariotik tidaklah sama dengan mRNA hasil transkripsi pada sel
prokariotik. Dimana pada eukariotik, mRNA hasil transkripsi di dalam
nukleus sebelum bisa meninggalkan nukleus, transkripsi RNA eukariotik
pada gen pengode protein dimodifikasi dengan berbagai cara untuk
menghasilkan RNA yang fungsional yang bisa terhindar dari degradasi

54
 enzim-enzim hidrolitik yang ada disitoplasma sedangkan pada
prokariotik tidak terjadi modifikasi.41
Messenger RNA adalah komplementer dengan DNA kromosom;
membentuk hibrida RNA-DNA setelah pemisahan dua untai DNA.
Sintesis mRNA dicapai dengan hanya satu dari dua untai DNA, yang
digunakan sebagai template. Enzim RNA polimerase bergabung dengan
ribonucleotides, dengan demikian, menjadi katalis dalam
pembentukan ikatan 3'-5'-fosfodiester yang membentuk tulang punggung
RNA. Dalam hal ini sintesis rasio AU / GC RNA mirip dengan rasio AT
/ GC dari DNA. Sintesis mRNA dimulai pada ujung 5 'dan arah
pertumbuhan adalah dari ujung 5' ke ujung 3 '.40
Sesuai dengan namanya, mesengger RNA (mRNA) berfungsi
sebagai pembawa informasi genetik dari DNA inti yang akan translasi
untuk mensintesis polipeptida. Tempat terjadinya translasi adalah
ribosom.3 Menurut Weaver (2008), mRNA berfungsi sebagai pembawa
sekuens asam amino yang spesifik dari sebuah protein.42

2.8.2 tRNA
tRNA (transfer RNA) adalah RNA yang berperan membawa asam-
asam amino spesifik yang akan digabungkan dalam proses sintesis protein
(translasi). RNA pemindah atau transfer RNA (tRNA), yang strukturnya
mengalami modifikasi hingga berbentuk seperti daun semanggi. Seperti
halnya struktur ujung terminasi mRNA, struktur seperti daun semanggi ini
terjadi karena adanya urutan palindrom yang diselingi oleh beberapa basa.
Pada salah satu kalanya, tRNA membawa tiga buah basa yang
komplemeter dengan triplet kodon pada mRNA. Ketiga basa ini
dinamakan antikodon. Sementara itu, pada ujung 3’-nya terdapat tempat
pengikatan asam amino tertentu. Pengikatan yang membentuk molekul
aminoasil-tRNA ini terjadi dengan bantuan enzim aminoasil-tRNA
sintetase. Dalam hal ini gugus hidroksil (OH) pada ujung 3’ tRNA terikat
sangat kuat dengan gugus karboksil (COOH) asam amino. Macam asam

55
 amino yang dibawa ditentukan oleh urutan basa pada antikodon. Jadi, ada
beberapa macam aminoasil-tRNA sesuai dengan antikodon dan macam
asam amino yang dibawanya. tRNA memiliki panjang 74-94 nukleotida,
tRNA dihasilkan oleh prekusor di nukleus. tRNA befungsi sebagai
adaptor untuk translasi informasi dalam sekuens nukleotida mRNA
menjadi asam-asam amino spesifik. tRNA mempunyai 4 lengan utama
yaitu lengan akseptor, lengan D, lengan T  C dan lengan ekstra
membantu penentuan tRNA spesifik. Selama sintesis protein, molekul
tRNA membawa asam amino ke ribosom dan memastikan bahwa asam
amino tersebut bergabung dengan posisi yang tepat pada rantai
polipeptida yang sedang tumbuh. Oleh karena itu, sel memiliki paling
sedikit 20 molekul tRNA yang berbeda, satu untuk masing – masing asam
amino yang digunakan dalam sintesis protein. Banyak asam amino
memiliki lebih dari satu tRNA. Molekul tRNA mengandung tidak saja
nukleotida yang biasa dijumpai, tetapi juga turunan dari nukleotida
tersebut yang dihasilkan melalui modifikasi pasca transkripsional.4

2.8.3 rRNA
rRNA (ribosome-Ribonucleic Acid) atau Asam Ribonukleat
ribosomal adalah molekul utama penyusun ribosom. rRNA dan protein
secara bersama membangun subunit-subunit ribosom yang terdiri dari
subunit kecil dan subunit besar untuk kemudian bergabung membentuk
ribosom fungsional ketika dua subunit terikat pada mRNA saat translasi.1
rRNA adalah komponen RNA dari ribosom dalam sel. rRNA
berfungsi sebagai katalis namun tidak membawa informasi /pesan genetic
sebagaimana mRNA. rRNA yang merupakan komponen dari Ribosom
juga berfungsi sebagai tempat dimana polipeptida disintesis dalam
mekanisme translasi. Selain itu rRNA juga berperan dalam memvalidkan
kode triplet basa nitrogen yang akan ditranslasi oleh ribosom.43

2.9 Informasi Genetik di Kemas dalam Sel

56
 Proses pengemasan DNA dan protein terjadi pada tahap profase. Proses
yang terjadi adalah sebagai berikut4 :

1. Untai DNA dipintal dalam suatu protein histon. Protein histon ini mengikat
DNA menjadi suatu unit yang disebut nukleosom.
2. Nukleosom satu dengan lainnya bergabung membentuk benang yang lebih
padat dan terpintal menjadi lipatan lipatan yang disebut dengan solenoid.
3. Solenoid satu dengan yang lainnya bergabung dan lebih padat lagi membentuk
benang yang disebut kromatin.
4. Benang benang halus kromatin memadat membentuk lengan kromatid. Lengan
kromatid berpasangan membentuk kromosom.

57
 BAB III

KESIMPULAN

1.1 Kesimpulan

Biologi molekuler berperan dalam identifikasi DNA dan ekspresi gen

melalui teknik PCR-RFLP, PRC-RAPD, PCR-Analisis Sekuen, PCR-DGGE,
MFLP dan Elektroforesis.

58
 DAFTAR PUSTAKA

1. Campbell NA, Reece JB, Urry LA, Cain ML, Wasserman SA, Minorsky
PV, et. al. 2004. Biologi. 5th ed . Jakarta. Penerbit Erlangga

2. Kuchel, P., G. B. Ralston. 2006. Biokimia Schaum. Jakarta : Erlangga.

3. Butler JM. 2005. Forensic DNA typing, Biology, technology and genetics of STR
markers. Second edition. London : Elsevier academic press

4. Murray, Robert K., Granner, D. K., & Rodwell, V. W. 2014. Biokimia Harper
Edisi 29. Jakarta : Penerbit Buku Kedokteran EGC

5. Lubert, Styer. 2000. Biokomia Vol I. Edisi 4. Jakarta: Penerbit Buku Kedokteran
EGC.

6. Stansfield, William D. et. al. 2006. Biologi Molekuler Dan Sel. Jakarta: Erlangga

7. Suryo. 2005. Genetika Manusia. Yogyakarta: Gadjah Mada University Press

8. Rahmawan, dkk. 2011. Makalah Biokimia Asam Nukleat. Malang : Fakultas

Pertanian Universitas Brawijaya

9. Marks, Dawn B., Allan D. Marks, Colleen M. Smith. 2013. Biokimia Kedokteran
Dasar. Jakarta : Penerbit Buku Kedokteran EGC.

10. Yuwono, T. 2009. Biologi Molekular. Laboratorium Mikrobiologi Fakultas

Padjadjaran. Bandung.

11. Jabeen, Asma; Khan, Umar Ali; Lodhi, Ghulam Mustafa. 2011. Effects Of
Simvastatin On Lipid Profile And Nerve Conduction Velocity In Obese Sprague
Dawley Rats. Islamabad: Isra University.

12. Ganong, W. F. 2009. Buku Ajar Fisiologi Kedokteran. Edisi 22. Jakarta: EGC.

59
13. Dorland WAN. Dorland’s Pocket Medical Dictionary. Philadelphia, PA:
Saunders/Elsevier; 2009.

14. Armstrong, Frank B. 1995. Buku Ajar Biokimia. Edisi ketiga. EGC: Jakarta

15. Girindra, A. 1986. Biokimia I. Jakarta: Gramedia Pustaka Utama

16. Sloane, E. Anatomi dan Fisiologi untuk Pemula. Jakarta : Penerbit Buku
Kedokteran EGC:, 2004.

17. Winarno F.G. Kimia Pangan dan Gizi. Jakarta : PT Gramedia Pustaka Utama,
2004.

18. Lehninger, Albert L. 1982.Dasar-dasar Biokimia Jilid 1.Penerjemah: Maggy

Thenawijaya. Jakarta: Erlangga. Terjemahan dari: Principles of Biochemistry

19. Ferreira I. Sequence variation of the Amelogenin gene on the Y-chromosome.

2010

20. Sarmoko. 2011. From Gene To Protein. Department of Pharmacy UNSOED.

21. Ahsan, Muhammad. 2015. Biologi Molekuler : Prinsip Pengurutan DNA.

Makasar : Universitas Hassaudin

22. Southern EM. 1975. Detection of specific sequences among DNA fragments
separated by gel electrophoresis. J Mol Biol 98:503-517.

23. Alwine JC, Kemp DJ, Stark GR. 1977. Method for detection of specific RNAs in
agarose gels by transfer to diazobenzyloxymethyl-paper and hybridization with
DNA probes. Proc Natl Acad Sci 74 (12): 5350–4.

24. Kalanjati, Viskasari Pintoko. 2011. Improving The Quality Of Western Blot
Result. Folia Medica Indonesiana. Vol. 47 : 108-111.

60
25. Rybicky, E.P. 1996. PCR Primer Design and Reaction Optimisation. In
Molecular Biology Techniques Manual. Ed. V.E. Coyne, M.D. James, S.J.
Reid & E.P.Rybicki. Dept.of Microbiology. Univ. Cape Town.

26. Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T.1989. Molecular Cloning. A
Laboratory Manual. Cold Spring Harbor: New York.

27. Trayhurn, P. 1996. Northern Blotting. Proceedings of the Nutrition Society (55):
583-589.

28. Mitchell, T & Morley, B.J. 1988. Isolation of RNA and analysis by Northern
blotting and primer extension. Technical Tips Online vol 3.

29. Wibowo Luqman. 2009. Deskripsi dan Macam-Macam Tingkatan Struktur

Protein. Bandung

30. Clark,John M. 1964. Experimental Biochemistry. WH Freeman and

Company.San Franciso

31. Plummer, D. T. 1978. An Introduction to Practical Biochemistry. McGraw – Hill,

New Delhi.

32. Poedjiadi, Anna dan F.M Titin Supriyanti. 2005. Dasar-Dasar Biokimia. Jakarta:
UI Press

33. Ferjenden, Ralph J. Dasar-Dasar Kimia Organik. Jakarta. Brampa Aksara.1994

34. Bruce, A., D. Bray., J. Lewis, M. Raff., Roberts Dan J.D. Watson 1994. Biologi
Molekuler Sel Mengenai Sel. Edisi kedua PT. Gramedia Pustaka Utama

35. Klug, W. S dan M.R. Cummings. 1994. Concepts Of Genetics. Prentice-Hall

Engle Wood, New Jersey.

36. Chevallet, M., Luche, S., Rabilloud, T. Silver staining of proteins in

polyacrylamide gels. Nature Protocols. 2006.

61
37. Kamus Besar Bahasa Indonesia V (Online). Diakses dari :
kbbi.kemdikbud.go.id, tanggal 23 April 2018

38. Farmakope Indonesia Edisi IV tahun 1995, DEPKES Republik Indonesia

39. Solomon, Eldra P, Linda R.Berg, Diana W.Martin. 2008. Biology 8th Edition.
United States Of America: Thomson Brooks/Cole

40. Verma. P.S. 2005. Cell Biology, Genetic, Moleculer Biology, Evolution and
Ecology. New Delhi: Chand & Company LTD RAM NAGAR.

41. Reece Jane B, Lisa A.Urry, Michael L.Cain, Neil A.Campbell, Peter
V.Minorsky , Robert B.Jackson , Steven A.Wasserman. 2008. Biology 8th
Edition. Jakarta: Erlangga

42. Weaver, Robert T. 2008. Moleculer Biology. New York: McGraw-Hill

43. Solomon, Eldra P, Linda R.Berg, Diana W.Martin. 2008. Biology 8th Edition.
United States Of America: Thomson Brooks/Cole

62