MODUL PRAKTIKUM

KULTUR JARINGAN

Dosen:

Pebrywati Watimury, M.Pd

JURUSAN PENDIDIKAN BIOLOGI

FAKULTAS ILMU TARBIYAH DAN KEGURUAN

INSTITUT AGAMA ISLAM NEGERI AMBON

2017

PEMBUATAN MEDIA, STERILISASI DAN PENANAMAN

DALAM KULTUR JARINGAN

TUJUAN

Mahasiswa mapu membuat media pada, Terilisasi dan penanaman untuk kultur jaringan

Dasar Teoritis

Kultur jaringan merupakan suatu metode atau teknik perbanyakan aseksual secara in vitro
mengguanakan sebagian kecil dari bagian tumbuhan atau hewan, seperti mislnya jaringan atau
organ, dan dilakukan pada kondisi aseptik. Agar kondidi aseptik atau bebas kontaminan
diperoleh maka kultur jaringan dilakukan di dalam ruangan khusus, yaitu laboratorium kultur
jaringan.

Untuk melakukan kultur jaringan komponen utama yang dibutuhkan adalah media.
Media merupakan wadah/tempat dimana bahan yang akan di tanam (di sebut explan)
ditumbuhkan hingga menjadi kalus atau menjadi individu yang lengkap. Agar eksplan dapat
tumbuh dan berkembang maka media harus mengandung nutrisi, baik nutrisi makro dan mikro.
Sumber karbon, vitamin dan zat nutrisi lainnya.

Media pada kultur jaringan terdiri atas tiga jenis: media padat, media semi-padat, dan
media cair. Media padat dan semi-padat pada dasarnya sama, bedanya terletak pada konsentrasi
bahan pemadat (gelling agent) yang digunakan. Biasanya untuk menghasilkan medi yang
berbentuk padat/semi-padat ditambahkan 0,5 – 1,0 % gelling agent dengan Ph 5,5 – 6,0. Bahan
pemadat yang dipakai biasanya adalah gelrit, agarosa, agar bakto atau agar-agar biasa. Pada
media cair sepenuhnya berupa cairan yang berisi zat-zat nutirisi, tanpa ada penambahan gelling
agent.

Media berguna untuk sumber nutrisi untuk pertumbuhan dan perkembangan explan
selama kultur, di samping sebagai medi pemopong fisik bagi explan setelah berkembang,
misalnya membentuk akar, komposisi utama nutrisi yang terkandung didalam media kultur
jarinagn adalah: Nutrisi mineral, Sumber karbon, Hormon, Vitamin, dan Zat nutrisi lainnya.

Nutrisi yang digunakan sebagai penyusun media kultur jaringan mencakup unsure makro
dan unsure mikro, unsure makro diperoleh dari senyawa kimia seperti NH4NO3 dan MgSO4.
7H2O dan unsure mikro diperoleh dari senyawa CoCl2.6H2O. Sebagai sumber karbon di
gunakan sukrosa atau gula. Dan untuk mendukung proses fisiologis selama jaringan tumbuh dan
berkembang di butuhkan hormone yang dalam hal ini berupa Zat pengatur Tumbuh (ZPT).
Diantar ZPT yang lazim dipakai dalam kultur jaringan adalah Auksin dan Sitokinin. Air kelapa
sebagai sumber hormone juga seringkali dipakai untuk membantu keberhasilan kultur jaringan
dengan memberikan pada konsentrasi 5-20%.

Horm Contoh Singka Keterangan

on tan
Auksin Indole-3-acetic IAA Untuk induksi kalus,
acid diberikan pada
konsentrasi 10-30
µM. Konsentrasi
rendah, yaitu 1-10 µM
mampu mendorong
organogenesis.
Indole-3-butyric IBA Untuk induksi akar,
acid diberikan pada
konsentrasi rendah,
1-50 µM.
2,4- 2,4-D Induksi kalus dan
Dichlorophenox mempertahankan
yacetic acid kalus. Konsentrasi
yang dipakai 1-50
µM.
p- pCPA Mirip 2,4-D, tetapi jarang
Chlorophenoxy NAA dipakai.
acetic acid Digunakan pada
1- konsentrasi 2-20 µM
Naphthaleneac untuk induksi kalus
etic acid dan pertiumbuhan
kalus dan kultur
suspensi pada
konsentrasi 0,2-2 µM
untuk induksi akar.
Sitokin 6- K Digunakan untuk induksi
in Furfurylaminop kalus, pertumbuhan
urine (kinetin) kalus dan untuk
suspensi sel, serta
induksi morfogenesis.
Diberikan pada
konsentrasi 1-20 µM.
Pada konsentrasi
yang lebih tinggi (20-
50 µM dapat
menginduksi
 perbanyakan secara
cepat tunas atau
meristem.
6- BAP, BA Untuk induksi kalus,
Benzylaminopu pertumbuhan kalus
rine dan suspensi sel;
diberikan pada
konsentrasi 0,5-5.0
µM, dan untuk
induksi morfogensis
diberikan pada
konsentrasi 1-10 µM.
Untuk induksi cepat
pembentukan tunas,
daun atau meristem
dipakai konsentrasi 5-
50 µM.
Zeatin Zea Jarang dipakai dalam
media untuk induksi
kalus atau suspensi
sel. Diipakai untuk
induksi morfogensis
pada pada
konsentrasi 0,05-10
µM. Hormon ini
mudah rusak oleh
suhu tinggi sehingga
tidak boleh
diautoclav.
Untuk membantu keberhasilan kultur jaringan, vitamin seperti tiamin (B1),
piridoksin (B6), asam nikotinat, atau mio-inositol biasanya ditambahkan ke dalam
media.

Langkah-langkah yang perlu dilakukan dalam peyiapan media kultur

jaringaan adalah:

– Membuat larutan stok

– Menyiapkan wadah media (tabung reaksi, cawan petri atau botol)
– Sterilisasi media

Larutan stok dibuat sebelum bahan tanam atau eksplan disiapkan, dan
biasanya konsentrasinya 10 sampai 100 kali konsentrasi larutan yang dipakai dalam
media.
 Larutan stok untuk nutrisi disiapkan dua jenis dengan botol yang terpisah,
botol pertama adalah larutan stok nutrisi mikro, dan botol stok kedua berisi nutrisi
makro. Kedua larutan stok nutrisi ini dibuat pada kepekatan 10 hingga 20 kali.
Larutan stok nutrisi ini disimpan di lemari pendingin sampai saatnya digunakan.
Satu hal penting lainnya mengenai pembuatan larutan stok yang perlu
diketahui ialah satuan konsentrasi yang dipakai, dalam hal ini adalah bisa %, ppm,
atau molar disingkat M.

% = persen atau seperseratus bagian (% v/v atau % g/v) .

ppm = part per million atau sepersejuta bagian, 1 mg /L = 1 ppm
mol = gram mol per liter larutan.

Untuk menggunakan satuan konsentrasi molar, berat molekul zat atau

senyawa nutrisi yang akan dipersipkan untuk bahan media harus diketahui (ini
biasanyanya sudah tercantum padalabel kemasan za kimia tersebut).
Stok vitamin dibuat pada konsentrasi 100 x dan disimpan pada suhu beku (-20
oC). Jika lemari dingin tidak tersedia, maka larutan vitamin harus disiapkan setiap
kali media dibuat.Jika disimpan pada suhu beku (-20 0C), larutan stok vitamin ini
dapat bertahan 2-3 bulan, setelah itu harus diganti dengan yang baru.
Untuk stok ZPT, seperti NAA dan 2,4-D penyimpanannya harus pada suhu
dingin sekitar 4 oC agar dapat bertahan hingga beberapa bulan. Sedangkan untuk
larutan IAA harus disimpan pada suhu beku -20 oC. Larutan stok hormon dibuat
pada konsentrasi 100 x.

Contoh larutan stok Murashige Skoog (MS) 100x

Larutan Stok/Komposisi Konsentrasi (g/liter stok)
A. Stok Nitrat
Amonium nitrat (NH4NO3) 165,0
Kalium nitrat (KNO3) 190,0
B. Stok Sulfat
Magnesium sulfat (MgSO4.7H2O) 37,0
Mangan sulfat (MnSO4.H2O) 1,69
Seng sulfat (ZnSO4.7H2O) 0,86
Tembaga sulfat (CuSO4.5H2O) 0,0025
C. Stok Halida
Kalsium klorida (CaCl2.2H2O) 44,0
Kalium iodida (KI) 0,083
Kobalt klorida (CoCl2.6H2O) 0,0025
D. Stok PBMo
Kalium fosfat (KH2PO4) 17,0
Asam borat (H3BO3) 0,62
Natrium molibdat (Na2MoO2.2H2O) 0,025
E. Stok NaFeEDTA
Besi sulfat (FeSO2.7H2O) 2,784
 Natrium EDTA (Na2EDTA) 3,724

Bahan Dan Alat

No Bahan Alat
1 Air Kelapa Muda Ketas Aluminium/Plastik tahan Cawan Petri
Panas
2 Toge Botol Kultur Karet gelang
3 Pisang Ambon Gelas Piala Hot Plate
4 Gulah/Sukrosa Neraca Kertas Label
5 AQuades Autoclav Gelas Ukur
6 Agar-Agar/Agarosa PH meter Tabung Reaksi
7 Nutrisi /Gandasil D Pipet Mikro

I. Prosedur Sterilisasi Alat

a. Sterilisasi Alat ( Karet,Plastik, Logam)
1. Siapkan alat yang akan di sterilkan dalam praktikum
2. Cuci semua peralatan dengan menggunakan detergen sampai benar-benar bersih,
kemudian bilas dengan air keran yang tersedia
3. Taruh alat Petridis yang telah di cuci pada rak alat dengan posisi terbalik agar cepat
atus
4. Bersihkan alat-alat yang telah atus tersebut dengan kain lap, kemudian bungkus
dengan kertas minyak sehingga permukaan alat tertutup seluruhnya, semua alat-alat
dimasukan dalam autoclave.
5. Tambahkan air di dalam Autoclave
6. Sterilkan alat-alat tersebut dalam Autoclave pada suhu 1210C dengan tekana 17,5 psi,
Selama minimal 1 jam
b. Steril Alat Botol Kultur
1. Cuci Gelas, Cawan Petris/ bahan kaca dengan detergen menggunakan sikat atau busa
kemudian bilas dengan air kerang bingga bersih
2. Atuskan gelas dengan posisi mulut botol ke bawah
7. Setelah atus masukan botol kutrur kedalam autoclave pada suhu 1210C dengan
tekana 17,5 psi, Selama minimal 1 jam pada oven panaskan selama 2 Jam dengan
temperature 1400C
3. Setelah botol dingin siap di gunakan.
II. Prosedur Pembuatan Media
1. Siapkan Air dalam gelas piala sebanyak 500 ml
2. Timbang toge 150 gr, timbang pisang 300 gr ambil dagingnya
3. Haluskan Toge ambil sarinya
4. Haluskan Pisang Ambil Sarinya
5. Tambahkan Air Kelapa sebanyak 150 ml/ Liter
6. Timbang gula pasir 20 gr
7. Timbang agar-agar 7-8 gr/liter
8. Timbang Hyponex 2 gr/ Liter
9. Masukan seluruh bahan yang di timbang kedalam gelas piala yang berisi air 500 ml
10. Masak Hingga mendidih
11. Tuangkan Media secara merata kedalam botol Kultur
12. Botol- Botol yang sudah terisi media Di tutu dengan Plastik dan Karet
13. Media siap di sterilkan dalam Autoclave
14. Setelah di sterilkan media di simpan di dalam Laminar/Ruang penanaman
Catatan:

1. Untuk Botol kecil sebanyak 10 ml

2. Untuk botol selei Sebanyak 20 ml
3. Untuk Botol Saus sebanyak 35 ml
III. Prosedur Sterilisasi Explan
1. Siapkan Explan yang akan di gunakan
2. Cuci explan pada air mengalir
No Jenis Konsentrasi Lama Perendaman
1 Alkohol 70% 1 1 – 2 menit
2 Betadhin 2,5- 10 % 5- 10 menit
3 Bayclin 5-30% 5-20 menit
4 Mercury klorit (HgCl2) 0,1-0,2% 10-20 menit
5 Natrium Hipoklrorit 1-2% 7-15 menit
6 Kalsium Hipoklorit 1-10% 5-30 menit
7 Perak Nitrat 1% 5-30 menit
8 Fungisida 2g/l ½-1 jam
 3. Explan yang sudah di bersihkan dikecilkan sampai ukuran tertentu dengan
mengikutkan ibu tulang pada daun dengan ukuran panjang 1-2 Cm
4. Bahan kemudian di rendam dalam larutan Betadhin setelah waktu perendaman
tercapai explan di cuci bersih.
5. Masukan explan dalam laminar
6. Explan direndam dalam alcohol 70 % selama 1- 2 menit
7. Bilas dengan air steril sekali selama 5 menit
8. Rendam larutan dalam explan bayclin selama 5 menit
9. Bilas dengan air steril sekali selama 5 menit.
10. Letakan cawan petri yang telah dialasi tisu steril, explan siap di tanam
11. Untuk buah anggrek, di cucci dan di sterilisadi dengan membakar buah anggrek
IV. Prosedur Penanaman
1. Hidupkan sinar UV selama 30 menit dan hidupkan blower, kemudian matikan
segera sebelum digunakan
2. Matikan lampu UV Nyalakan Lampu Neon dan Vilter Hepa selama 5 Menit
matikan
3. Usapkan Meja dan dinding dengan alkohal 70 %
4. Pastikan kaca penutup terkunci pada posisi terendah
5. Cuci tangan dengan sabun/alcohol 70% sebelum bekerja
6. Masukan Alat dan Bahan yang akan di gunakan dalam penanaman
7. Masukan Bunsen dan nyalakan
8. Setiap kali alat yang berupa pinset dan skapel akan dipakai di celupkan didalam
larutan alcohol 70% lalu di bakar
9. Untuk Petridis di bakar sebelum menanam explan
10. Setiap botol kultur yang di buka mulut bitol harus selalu berdekatan dengan api,
setelah menanam, mulut botol di panaskan dengan arah putaran, kemudian botol
di tutup kembali.
11. Setelah bekerja alat-alat di kelurkan
Pertanyaan

1. Mengapa bahan eksplan harus disterilisasi, dan mengapa menggunakan

bayclyn atau semacamnya?
2. Pencemar apa saja yang biasa ada pada bahan eksplan.
3. Apakah fungsi alkohol (etanol) dalam sterilisasi eksplan.
4. Mengapa pH penting di atur pada penyiapan media kultur jaringan?
5. Apa kegunaan agar-agar dalam pembuatan media kultur jaringan?
6. Apa manfaat hormon yang terdapat dalam media?
7. Apa kesimpulan utama Anda?