I.

Pendahuluan
Kosmetik, bahan pembersih, dan obat-obatan yang mengandung air memerlukan
perlindungan terhadap pertumbuhan mikroorganisme untuk memastikan keamanan produk dan
memperpanjang umur saat penyimpanan. Pengawet memastikan kualitas produk. Pengawet
yang paling sering digunakan meliputi methylisothiazolinone (MI),
methylchloroisothiazolinone (MCI), benzyl alcohol (BA), sodium benzoate (SB) dan parabens,
khususnya methylparaben (MP). Penentuan zat-zat ini dalam farmasi dan kosmetik penting
dalam kontrol kualitas, terutama mengingat banyak laporan reaksi alergi yang disebabkan oleh
pengawet. Metode deteksi harus secara bersamaan mengekstraksi, memisahkan, dan
menentukan berbagai pengawet dalam berbagai sampel, sambil juga menghilangkan gangguan.
Dari pengawet yang diperiksa dalam penelitian ini, yang paling sering digunakan
adalah MP karena spektrum antimikroba yang luas dan fakta bahwa ia tidak mengubah sifat
fisik produk akhir (yaitu, rasa, bau, warna atau konsistensi). Ini digunakan dalam makanan,
kosmetik dan obat-obatan. Baru-baru ini, lebih banyak perhatian telah diberikan pada analisis
kualitatif dan kuantitatif paraben karena alergi yang ditimbulkannya. Penelitian sebelumnya
menggunakan model hewan in vivo untuk menunjukkan bahwa paraben menunjukkan aktivitas
estrogenik. Mereka memengaruhi produksi testosteron dan fungsi sistem reproduksi wanita.
Selain itu, paparan jangka panjang terhadap paraben bahkan pada konsentrasi rendah,
menyebabkan jaringan biologis menyerap hingga 20,6 + 4,2 ng / g, yang dapat mempengaruhi
pertumbuhan dan perkembangan jaringan kanker (mis., Kanker payudara). European Economic
Community Directive (EEC) mencantumkan paraben yang diperbolehkan dalam kosmetik
yaitu 0,4% untuk senyawa tunggal atau 0,8% untuk total konten semua paraben yang digunakan
dalam sediaan. Namun dalam makanan, kandungan paraben yang diijinkan adalah 0,1%. Total
paparan paraben adalah 76 mg per hari atau 1,3 mg per 1 kg berat badan. Dosis ini
memperhitungkan distribusi berikut: 1 mg setiap hari dari makanan, 50 mg dari kosmetik dan
25 mg dari obat-obatan. MP ditemukan di hampir semua kategori kosmetik (mis., Lotion, krim,
gel, dan cairan) dan di banyak obat-obatan (mis., Salep, gel, sirup, krim, dan aerosol)
BA umumnya digunakan sebagai agen bakteriostatik atau sebagai salah satu komponen
dalam berbagai obat-obatan cair. Pemantauan kandungannya dalam obat-obatan adalah
signifikan karena potensi oksidasi menjadi benzaldehyde beracun. BA juga digunakan sebagai
salah satu bahan pewangi dalam produk parfum. Uni Eropa telah mengeluarkan arahan
(2003/15 / EC) yang mewajibkan paket produk kosmetik akhir untuk memasukkan daftar bahan
dengan konsentrasi lebih besar dari 0,01% untuk produk pembilas dan 0,001% untuk produk
sisa.
Senyawa kelompok Isothiazolinone umumnya digunakan sebagai pengawet dalam

produk berbasis air industri (mis., Deterjen, kosmetik, cat, resin, emulsi, pelunak tekstil dan
produk untuk pemolesan) di industri kosmetik, tekstil dan kertas. MI dan MCI dapat
menyebabkan iritasi dan sensitizer kulit yang kuat. Pengawet ini sangat umum dalam kosmeti.
Batasan spesifik pada konsentrasi maksimumnya yaitu 0,0015% untuk campuran MCI 3: 1: MI
dan 0,01% untuk MI.
SB adalah pengawet yang paling sering digunakan untuk melindungi makanan, tetapi
juga ditemukan dalam kosmetik dan obat-obatan untuk menjaga mereka tetap segar dan
menghambat pertumbuhan ragi, jamur dan bakteri. Ini menunjukkan aktivitas positif dalam
media asam. Menanggapi laporan tentang kepekaan terhadap pengawet ini, American Food and
Drug Administration (FDA) membatasi konsentrasinya dalam produk ke tingkat yang berbeda,
tergantung pada kategori produk: 2,5% pada produk bilas, 1,7% pada produk perawatan mulut
dan 0,5% dalam produk cuci. Teknik yang paling sering digunakan dalam analisis pengawet
adalah kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC) dan sedikit laporan tentang kromatografi cair
kinerja tinggi (UHPLC). Sistem fase terbalik menggunakan fase diam octadecylsilane biasanya
digunakan elusi gradien dengan campuran air dan pelarut organik. Kromatografi gas dan
elektroforesis kapiler telah dilaporkan jauh lebih jarang. Deteksi spektrofotometri paling umum
digunakan dalam kromatografi dan beberapa spektrometri massa atau deteksi
chemiluminescent.
Pengawet paling sering ditentukan dalam sampel obat-obatan, kosmetik, dan makanan.
Namun, ada juga publikasi yang menggambarkan penentuan residu mereka dalam air limbah
 dan air permukaan. Metode sebelumnya telah menentukan pengawet tunggal atau
pengawet campuran dengan obat atau pengawet lain, tetapi tidak pernah penentuan simultan
dari lima pengawet yang disebutkan. Selain itu, metode persiapan sampel yang dijelaskan untuk
analisis kromatografi hanya berfokus pada kategori produk tertentu. Saat ini tidak ada
pendekatan universal untuk jenis analisis ini, baik dalam metode kromatografi yang
dikembangkan atau prosedur persiapan sampel (yaitu, untuk matriks sampel yang berbeda,
seperti cairan, pasta, salep, krim dan gel). Prosedur ini secara bersamaan dapat menentukan MI,
MCI, BA, SB dan MP dalam analisis kromatografi tunggal dalam berbagai jenis matriks
sampel.

II. Prosedur Penelitian

Bahan Kimia dan Reagen
MI (2-metil-2H-isothiazol-3-one, CAS: 2682-20-4), MCI (5-chloro-2-methyl-2H-
isothiazol-3 one, CAS: 26172-55-4), BA (CAS: 100-51-6), SB (CAS: 532-32-1) dan MP (metil
4- hidroksibenzoat, CAS: 99-76-3) dibeli dari Sigma Aldrich (St. Louis, MO). MCI dibeli
sebagai campuran yang terdiri dari 1,14% MCI, 0,38% MI, 21,9% magnesium nitrat (V) dan
air (hingga 100%) dengan nama dagang ProClin 150 (Sigma Aldrich).
Asetonitril (kadar HPLC), air (kadar HPLC) dan asam format (99%) yang digunakan
sebagai fase gerak dibeli dari Merck (Darmstadt, Jerman). Asam format (0,1%) diperoleh
dengan pengenceran yang tepat dari pereaksi pekat dengan air untuk HPLC. Metanol (murni
untuk analisis) yang digunakan dalam persiapan larutan standar dan ekstraksi dibeli dari POCh
(Gliwice, Polandia).
Larutan standar dibuat pada 1 mg / mL dengan melarutkan MI, SB dan MP atau
mengencerkan MCI dan BA dalam metanol. Semua larutan standar disimpan dalam wadah kaca
kuning pada suhu 48C. Larutan standar stabil untuk setidaknya tiga bulan. larutan disiapkan
dengan mengencerkan larutan standar dengan metanol segera sebelum digunakan dalam
analisis kromatografi.
Apparatus
Analisis kromatografi dilakukan pada kromatografi La Chrom ULTRA (Hitachi,
Merck) yang dilengkapi dengan dua pompa (L-2160U), autosampler (L-2200U), detektor
ultraviolet (UV) dengan panjang gelombang variabel (L-2400U) dan termostat (L-2350).
Analisis dilakukan pada suhu 128C pada kolom RP 18e Chromolith Gradient fase terbalik (50
2 mm i.; Merck) dengan elusi gradien dalam asetonitril dan larutan 0,1% larutan asam format.
(Program elusi ditunjukkan pada Tabel I )
 Preparasi Sample

Sampel dibeli di pasar lokal di Polandia. Produk kosmetik termasuk tonik wajah, obat
kumur, pasta gigi, krim, lotion tubuh, gel cukur, gel mandi, minyak tubuh, semprotan tubuh dan
masker wajah. Produk-produk ini berasal dari berbagai perusahaan, termasuk Avon Cosmetics,
Ziaja Ltd., Nivea BeisdorfLechia, Pemasaran Internasional Adidas, Unilever Poland,
Laboratorium Kosmetyczne Dr. Irena Eris, L'Oreal Poland, Oseanik, Colgate-Palmolive dan
Johnson & Johnson Poland.

Produk farmasi termasuk larutan injeksi, sirup, aerosol, gel dan salep dari berbagai
perusahaan: Lek Pharmaceuticals, Medagro International, Biofarm, PLIVA Krako, Gedeon
Richter, Warszawskie Zaklady Farmaceutyczne Polfa, ICN Polfa Rzeszo'w, Aziende Chimiche
Riunite, KRKA Nove Mesto, Astra Zeneca AB, Ilirijad, Natur Produkt Zdrovit dan Farmasi
GlaxoSmithKline. Agen pembersih dan disinfektan rumah tangga dari ColgatePalmolive dan
Reckitt-Benckiser (Polandia) juga dianalisis.

Produk cairan berwarna bening dianalisis secara langsung atau, jika perlu, setelah
pengenceran yang sesuai dengan air suling. Sampel dan cairan padat dengan kepadatan tinggi
atau viskositas diperlukan ekstraksi ultrasonik dengan metanol sebelum analisis.

Sekitar 1 g sampel ditimbang (mis., Pasta gigi, krim, gel atau salep), dan 6,0 mL
metanol ditambahkan. Larutan ini dicampur dan ditempatkan dalam rendaman ultrasonik
selama 15 menit. Larutan kemudian secara kuantitatif dipindahkan ke labu ukur 10 mL dan
diselesaikan sampai volume akhir dengan metanol. Selanjutnya, larutan disaring melalui filter
nilon dengan diameter pori 0,20 mm, dan filtrat yang diperoleh dianalisis dengan metode yang
dikembangkan. Jika perlu, sampel diencerkan lebih lanjut.

III. Hasil dan Diskusi

1. Pengembangan metode kromatografi
Metode kromatografi dikembangkan untuk menentukan lima pengawet secara
simultan dan cepat dalam berbagai produk konsumen. Dua kolom kromatografi telah
diperiksa yaitu, Hypersil EMAS (50 2,1 mm i.d., 1,9 mm; Thermo Scientific, Palo Alto,
 CA) dan Chromolith Fast Gradient RP 18e (50 2 mm i.d.; Merck). Kolom Chromolith
dipilih untuk penelitian atau studi lebih lanjut karena parameter kromatografi yang lebih
baik. Komposisi fase gerak yang berbeda, laju aliran dan Metode elusi (mis., isokratik,
gradien)juga diperiksa. Komponen fase gerak termasuk air, metanol, asetonitril, larutan
0,05% asam trifluoroasetat, 0,1% larutan asam formiat dan campurannya. Hasil paling baik
didapatkan pada gradien elusi dengan asetonitril dan asam format 0,1% dengan laju alir
0,7 mL / menit. Program elusi gradien ditunjukkan pada Tabel I. Kolom suhu juga
dioptimalkan. Suhu yang diuji adalah: 30, 25, 20, 15 dan 120C. Suhu 120C (suhu ini dapat
mmisahkan SB dan MP dengan sangat baik, yang memiliki waktu retensi sama). Pada
kondisi ini secara efektif, dapat memisahkan lima senyawa dalam waktu kurang dari 3
menit dengan pengulangan yang baik, resolusi dan puncak simetri.
Kromatogram standar ditunjukkan pada Gambar 2. Untuk mendapatkan sinyal yang
cukup kuat, berbagai panjang gelombang yang telah dideteksi kemudian dievaluasi. Untuk
analisis kuantitatif, panjang gelombang analitis dipilih pada titik penyerapan maksimum
untuk masing-masing senyawa: 237 nm untuk SB, 257 nm untuk BA dan MP dan 274 nm
untuk MI dan MCI.

2. Validasi metode analitik

Kurva kalibrasi yang dihasilkan berdasarkan analisis pada serangkaian campuran

yaitu pengenceran larutan standar yang diinginkan dengan metanol. Analisis di masing-
masing campuran ditentukan enam kali.

Senyawa yang ditentukan diperiksa pada konsentrasi: MI pada 13,33, 10,00, 6,67,
3,33 dan 0,33 μg / mL; MCI pada jam 10.00, 7.50, 5.00, 2.50 dan 0.25 μg / mL; BA pukul
100.00, 75.0, 50.00, 25.00 dan 15.00 μg / mL; SB pukul 10.00, 7.50, 5.00, 2.50 dan 1,00
μg / mL; MP pada jam 10.00, 7.50, 5.00, 2.50 dan 0.25 μg / mL. Konsentrasi berkisar dari
konsentrasi minimal hingga maksimal ditunjukkan tambahan pada Tabel II.

Waktu retensi, panjang gelombang analitis, batas deteksi (LOD) dan kuantitasi
(LOQ), kurva kalibrasi dan validasi parameter dari metode yang dikembangkan
ditunjukkan pada Tabel II. Koefisien korelasi yang tinggi (0.9989 –0.9999) menunjukkan
linearitas dari kurva kalibrasi yang ditentukan pada rentang pengujian konsentrasi. LOD
dihitung berdasarkan parameter kurva kalibrasi menggunakan rumus berikut: LOD ¼ (3,3
x Sxy) / Sa; di mana Sxy adalah standar deviasi residu kalibrasi kurva, dan Sa adalah
kemiringan. LOQ ditentukan sebagai LOQ = 3 x LOD.
 Gambar 2. RP-UHPLC-UV kromatogram larutan standar dengan konsentrasi: 5 μg
/ mL (MP), 10 μg / mL (MI, SB), 25 μg / mL (MCI), 600 μg / mL (BA); dan pada panjang
gelombang: 274 nm (0,0-1,1 mnt) dan 237 nm (1,1-3,0 mnt) (ditunjukan oleh garis), dan
274 nm (0,0-1 mnt) dan 257 nm (1,1-3,0 mnt) (ditunjukan oleh garis titik-titik).

Presisi Intra-day ditentukan dengan menyiapkan enam campuran larutan standar

pada tiga tingkat konsentrasi: pada batas bawah, batas atas dan nilai tengah dari kurva
kalibrasi. Untuk menentukan presisi Intra-day, larutan yang sama disiapkan dan dianalisis
selama lima hari (tiap hari, disiapkan seperangkat larutan standar baru pada tiga tingkat
konsentrasi). Presisi didasarkan pada standar deviasi (SD) dan koefisien variasi (CV). Nilai-
nilai ini adalah kurang dari 6% (Tabel III), menunjukkan ketepatan metode yang
dikembangkan. Keakuratan metode ditentukan berdasarkan kesalahan relatif yang telah
dihitung (Tabel III).

3. Persiapan sampel untuk analisis

Dilakukan pengenceran untuk sampel cair dengan menggunakank mengencerkan.
Sampel cairan dapat berupa tonik wajah, obat kumur, tonik tubuh dan semprotan, solusi
injeksi, jelas sirup, aerosol, dan bahan pembersih. Pengenceran sampel yang dilakukan
dengan tiga replikasi, dan selanjunya dilakukan analisis dua replikasi dengan kromatografi.
Sedangkan sampel yang tidak dilarutkan dilakukan analisis sebanyak enam replikasi.
Sampel padat seperti pasta gigi, krim, masker dan salep serta sampel cairan dengan
kepadatan dan viskositas tinggi seperti gel, sirup padat dan minyak harus diekstraksi secara
kuantitatif dari matriks mereka. Banyak metode uji yang dilakukan, termasuk pengocokan
sampel dengan pelarut yang berbeda selanjutnya sentrifugasi. Namun, ekstraksi ultrasonik
adalah yang paling efektif. Banyak pelarut diuji dengan metode ini yaitu metanol, etanol,
 etil asetat, aseton, asetonitril dan metilen klorida, penambahan dengan tingkat pH medium
yang berbeda (pH 1, 5, 7 dan 10) dan waktu ekstraksi yang berbeda (5, 15, 45 dan 90 menit).
Prosedur menghasilkan nilai perolehan kembali (recovery) tertinggi sebelum
diuraikan. Tabel IV menyajikan nilai perolehan kembali (recovery) dari berbagai matriks
(pasta gigi, krim dan gel) dengan komposisi yang sama untuk sampel yang diperiksa, tetapi
tidak mengandung analit. Untuk menentukan nilai perolehan kembali (recovery) untuk
masing-masing matriks yang diuji, masing-masing matriks ditimbang sekitar 1 g dan
ditambahkan standar. Sampel-sampel tersebut selanjutnya dicampur secara menyeluruh dan
ditambahkan 6,0 mL metanol. Selanjutnya dilakukan pencampuran kembali dan dilakukan
sonikasi selama 15 menit. Lalu, sampel secara kuantitatif dipindahkan ke labu volumetrik
10 mL, ditambah dengan metanol hingga tanda dan dicampur. Sampel kemudian disaring
melalui filter nilon (0,20 mm) sebelum analisis kromatografi, yang dilakukan dengan dua
replikasi. Dalam analisis sampel, tiga alikuot (1,0 g) dari masing-masing sampel dilakukan
metode yang dioptimalkan. Sampel dengan konsentrasi analit tinggi diencerkan dengan baik
air (pasta, gel dan sirup) atau metanol (krim dan body lotion). Sampel yang tidak dilarutkan
dianalisis dua replikasi, dan dua pengenceran paralel dianalisis secara terpisah untuk sampel
encer.
4. Hasil analisis sampel
Prosedur analitik yang dioptimalkan digunakan untuk menganalisis semua sampel
kosmetik, sedian farmasi dan bahan pembersih. Identifikasi senyawa didasarkan pada
metode penambahan standar dan pada perbandingan waktu retensi analit dalam sampel
dengan standar. Gambar 3 dan 4 menyajikan kromatogram yang diperoleh dari analisis
sampel atau ekstrak yang sesuai. Tabel V menunjukkan hasil analisis untuk sampel yang
dipilih. Hasil dari semua sampel yang diuji disajikan sebagai data tambahan, tersedia online.
Data untuk kosmetik dan produk-produk kebersihan pribadi ditunjukkan pada Tabel
Tambahan I, obat-obatan dalam Tabel Tambahan II dan agen pembersih dalam Tabel
Tambahan III.
 Konsentrasi analit individu dalam sampel komersial tidak melebihi batas
peraturan. Konsentrasi bahan pengawet yang tertinggi terdapat dalam sampel air yaitu empat
kali lebih banyak daripada sampel dengan alkohol sebagai bahan utama; sebagai contoh.

MP dan SB adalah bahan pengawet yang paling umum digunakan dalam kosmetik,
sedangkan bahan pengawet lainnya hanya ditentukan dalam beberapa produk. Sebaliknya,
obat-obatan terutama mengandung BA sebagai bahan pengawet dan jarang menggunakan
MP. Kelima bahan pengawet terdeteksi dalam produk pembersih. Metode yang dijelaskan
sebelumnya dapat dianggap kompetitif dengan metode yang dijelaskan oleh Wu et al. karena
memungkinkan penentuan SB dan MP secara simultan. Wu et al. juga secara bersamaan
menentukan kandungan empat pengawet yang diperiksa dalam penelitian ini, tetapi tidak
menentukan SB. Sinyal analitik SB sendiri sebagian tumpang tindih dengan sinyal untuk
MP, tetapi dengan menggunakan metode ini memungkinkan pemisahan dan penentuan
simultan; Selain itu, metode ini juga memungkinkan untuk penentuan kandungan MI, MCI
dan BA.

Terlebih lagi, prosedur ekstraksi diverifikasi untuk produk dengan lebih banyak
matriks seperti gel dan pasta gigi; tidak hanya menyangkut krim dan lotion. Banyak sampel
dianalisis untuk mengkonfirmasi penerapan yang luas dari metode yang diuraikan. Untuk
sampel dengan daftar kuantitatif bahan (Papaverinum, Heparinum WZF, Cavinton dan
Biseptol), perbedaan dihitung antara konsentrasi yang dinyatakan pada paket pabrikan dan
yang ditentukan oleh metode yang dioptimalkan. Perbedaan antara jumlah BA yang
dinyatakan dan jumlah yang berlabel sebesar beberapa persen (dari –8 ke 4).

5. Kesimpulan
Prosedur analitik ini menggunaka fast liquid chromatography untuk menentukan
kandungan MI, MCI, BA, SB dan MP secara bersamaan dalam kosmetik dan sediaan
farmasi. Senyawa tersebut merupakan pengawet yang paling umum digunakan di pasaran.
Metode yang dioptimalkan dapat mengurangi biaya dan meningkatkan efisiensi yaitu
dengan waktu analisis 3 menit. Selain itu, prosedur persiapan sampel tidak memakan
banyak waktu dan memanfaatkan aplikasi instrumentasi standar. Prosedur yang
dioptimalkan dapat digunakan untuk mengontrol kualitas kosmetik, sediaan farmasi dan
agen pembersih dan untuk memperkirakan stabilitas produk jangka pendek dan jangka
panjang.
IV. Daftar Pustaka
Baranowska, I., Wojciechowska, I., Solarz, N. and Krutysza, E., 2013. Determination of
preservatives in cosmetics, cleaning agents and pharmaceuticals using fast liquid
chromatography. Journal of chromatographic science, 52(1), pp.88-94.

Lee, M.-R., Lin, C.-Y., Li, Z.-G., Tsai, T.-F.; Simultaneous analysis of antioxidants and
preservatives in cosmetics by supercritical fluid extraction combined with liquid
chromatography–mass spectrometry; Journal of Chromatography A, (2006); 1120:
244–251. 4.

Li, X.Q., Zhang, F., Sun, Y.Y., Yong, W., Chu, X.G., Fang, Y.Y., et al.; Accurate screening for
synthetic preservatives in beverage using high performance liquid chromatography
with time-of-flight mass spectrometry; Analytica Chimica Acta, (2008); 608: 165–177.
3.

Kazemifard, A.G., Moore, D.E., Mohammadi, A.; Polarographic determination of

benzaldehyde in benzyl alcohol and sodium diclofenac injection formulations; Journal
of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, (2002); 30: 257–262. 5.

Pylypiw, H.M., Jr., Grether, M.T.; Rapid high-performance liquid chromatography method for
the analysis of sodium benzoate and potassium sorbate in foods; Journal of
Chromatography A, (2000); 883: 299–304.

Rafoth, A., Gabriel, S., Sacher, F., Brauch, H.J.; Analysis of isothiazolinones in environmental
waters by gas chromatography–mass spectrometry; Journal of Chromatography A,
(2007); 1164: 74–81. 7.

Villa, C., Gambaro, R., Mariani, E., Dorato, S.; High-performance liquid chromatographic
method for the simultaneous determination of 24 fragrance allergens to study scented
products; Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, (2007); 44: 755–762. 6.

Zhang, Q., Lian, M., Liu, L., Cui, H.; High-performance liquid chromatographic assay of
parabens in wash-off cosmetic products and foods using chemiluminescence detection;
Analytica Chimica Acta, (2005); 537: 31–39. 2.