MAKALAH

ANALISIS KIMIA TUMBUHAN ALAM

DOSEN PENGAMPU :

apt. Irfan Zamzani, M.Farm

Oleh Kelompok 6 :

Anhar Muflih 1948201110018

Deswina Maharani 1948201110031

Norlaila 1948201110106

Norsalihan 1948201110108

Tiara Ramadhani 1948201110153

PROGRAM STUDI S1 FARMASI

FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH BANJARMASIN
2021/2022
 BAB I

PENDAHULUAN

2,3-Butanedion (diacetyl) digunakan sebagai agen penyedap rasa (bahan tambahan

makanan), dan sebagai komponen wewangian. Juga senyawa terjadi secara alami dalam
minuman beralkohol dan nonalkohol tertentu dan dalam beberapa jenis tembakau.

Nasional Lembaga Keselamatan dan Kesehatan Kerja (NIOSH) juga mengeluarkan

sejumlah laporan mengenai paparan terhadap diasetil dan 2,3-pentanedion (asetilpropionil) pada
tempat kerja. Dalam salah satu prosedur ini, metode Pusat Kerjasama Ilmiah Penelitian Relatif
terhadap Tembakau (CORSTA) digunakan untuk lainnya analisis senyawa karbonil telah
diperluas ke termasuk diacetyl dan acetylpropionyl.

Penelitian ini menjelaskan metode baru yang sangat sensitif untuk analisis diacetyl dan
acetylpropionyl dalam e-vapor produk termasuk beberapa e-liquid yang tersedia secara komersial
(produk isi ulang) serta aerosol yang dikumpulkan (keduanya partikel dan gas pensuspensi) dari
sejumlah perangkat rokok elektronik (e-rokok). Pengukuran (untuk diacetyl) dilakukan pada
berbagai matriks seperti anggur, bir, makanan, urin, dan udara lingkungan. Terkait dengan
analisis diacetyl dalam e-liquid dan produk tembakau, prosedur untuk analisis dapat didasarkan
pada kromatografi gas diikuti dengan spektrometri massa (MS), atau on kromatografi cair kinerja
tinggi (HPLC). NS Prosedur HPLC yang direkomendasikan oleh CORSTA didasarkan pada:
derivatisasi dengan dinitrofenilhidrazin dan deteksi UV.
 BAB II

MATERIAL DAN SAMPEL

A. Preparasi dari pelarut dan larutan

Pelarut dipreparasi dengan menambahkan 10 g p- toluenesulfonic acid monohydrat ke dalam

1000 mL dari etanol (1%). Larutan standart dari formaldehyde, asam format, diethoxymethane,
n- hexane, cylohexane, dan acetone dilarutkan dalam 5 mL dari pelarut yang telah disiapkan di
dalam ukur untuk mendapatkan sebuah konsentrasi dari 1 µL/mL untuk setiap latutan standar.
Stok larutan standard internal dibuat dengan mencampurkan 50 µL acetone dalam 50 mL dari
pelarut. Persiapan larutan sampel dibuat dengan : 0,15 g matrix cream yang telah ditimbang
dimasukkan kedalam vial headspace; kemudian, 70 µL standar internal ditambahkan hingga 5
mL dengan pelarut dan divorteks selama satu menit. Larutan sampel spiked (Berduri) dibuat
menggunakan 0,15 g matriks krim, larutan standar formaldehida, dan 70 µL larutan stok standar
internal. Campuran ini kemudian ditambahkan pelarut hingga 5 mL, kemudian divorteks selama
satu menit. Larutan selektivitas dibuat dengan menyiapkan larutan standar formaldehida, asam
format,n-campuran heksana, sikloheksana, dan aseton dalam konsentrasi 10 µL/mL masing-
masing dilarutkan dengan pelarut hingga 5 mL.

B. Metode Optimasi I dengan Derivatisasi 2,4-Dinitrofenilhidrazin dengan HPLC-

DAD.

Optimasi dilakukan sebagai berikut: pertama, pemilihan kolom C 8,C18, dan kolom fenil 5 µm
(250 mm×4,6 mm) dilakukan untuk mengamati pemisahan optimal antara puncak analit dan
senyawa lain. Kedua, variasi komposisi asetonitril dan air pada fase gerak dilakukan untuk
memberikan respon puncak analit yang optimal. Ketiga, suhu dan waktu inkubasi dimodifikasi
dengan memvariasikan suhu menjadi 30, 40, 50, dan 60 .°C; dan waktu inkubasi 10, 20, 30, 40,
50, dan 60 menit. Setelah itu, ketiga optimasi ini diamati untuk respon area optimum pada
sampel spiked (Berduri).
 C. Metode Optimasi 2 dengan P-Asam Toluenasulfonat dalam Derivatisasi Etanol
dengan GC-MS dan GC-FID.

Berikut optimasi yang dilakukan: pertama, pemilihan kolom menggunakan kolom nonpolar 1
MS, 5 MS, dan kolom polar wax (poli(etilena glikol) 100%) dilakukan untuk melihat pemisahan
optimum antara puncak analit dan senyawa lain. Kedua, suhu yang diprogram dari fase gerak
dioptimalkan sehingga dapat memberikan parameter kesesuaian sistem yang memenuhi
persyaratan dan dapat memberikan data yang konsisten pada laju aliran tetap. Ketiga,
optimalisasi suhu dan waktu inkubasi dengan memvariasikan suhu menjadi 30, 40, 50, dan
60 .°C dan waktu inkubasi 10, 20, 30, 40, 50, dan 60 menit. Setelah itu, respon area optimum
dalam sampel spiked (Berduri) diamati. Kemudian dilakukan optimasi untuk menentukan P-
Konsentrasi asam toluenasulfonat dalam etanol dilakukan dengan menggunakan lima
konsentrasi: 0,1, 0,5, 1,0, 1,5, dan 2,0%, dan diamati area respons puncak pada sampel spiked
(Berduri) yang memberikan respons area optimum.
 D. Metode Validasi

Parameter validasi yang ditentukan adalah selektivitas atau selektivitas, linieritas, jangkauan,
limit of detections (LOD), limit of quantitation (LOQ), presisi intraday dan interday, akurasi,
7-9
dan ketahanan. Uji selektivitas dilakukan dengan menyuntikkan 1% P-asam toluenasulfonat
dalam etanol (pelarut), matriks krim, standar formaldehida, sampel spiked (Berduri), aseton
standar internal, dan senyawa lain dengan sifat fisik dan kimia yang serupa dengan pengotor atau
produk degradasi yang mungkin terkandung dalam produk kosmetik krim seperti: n-heksana,
sikloheksana, dan larutan asam format. Waktu retensi dianalisis dari kromatogram yang
dihasilkan. Persyaratan penerimaan uji selektivitas adalah tidak ada waktu retensi yang tumpang
tindih yang menunjukkan adanya gangguan.

Uji linieritas dan jangkauan dilakukan dengan menginjeksikan tujuh konsentrasi spiked
sampel yang dibubuhi ke dalam sistem kromatografi gas dalam tiga kali pengulangan. Persamaan
regresi linier diperoleh dengan memplot konsentrasi formaldehida dengan rasio luas
formaldehida dengan standar internal aseton untuk mendapatkan persamaan garisb y = bx + a.
Sebagai parameter untuk menganalisis adanya hubungan linier, koefisien korelasi (r) dan
koefisien variasi fungsi regresi (Vx0) telah dipakai. Rentang adalah batas nilai konsentrasi
terendah sampai dengan konsentrasi tertinggi dengan presisi dan akurasi yang memenuhi
persyaratan. LOD dan LOQ dihitung secara statistik melalui persamaan regresi linier yang
diperoleh.

Penentuan presisi intraday (antar hari) menggunakan larutan sampel spiked (Berduri) dengan
konsentrasi 100% dilakukan sebanyak enam kali. Ketepatan intraday (antar hari) juga ditentukan
menggunakan teknik yang sama dengan enam kali pengulangan. Persyaratan penerimaan adalah
% RSD≤ 3,7%, rasio Horwitz < 2,0%, dan interval kepercayaan (CI): 95−105%.

Uji akurasi dilakukan melalui masing-masing tiga seri konsentrasi (80, 100, 120%) yang
disuntikkan tiga kali. Kandungan analit dihitung dengan membandingkan rasio area
formaldehida dan aseton dengan rasio formaldehida dan aseton teoritis dan menghitung akurasi
(persen pemulihan).

Kekokohan dinilai dengan membuat sedikit perubahan pada metode dan mengevaluasi
efektivitas standar deviasi relatifnya, yang diubah menjadi rasio split ±10% dari metode analisis
yang digunakan. Kekokohan diperoleh dengan membuat penyesuaian tambahan pada metode dan
kemudian mengevaluasi pengaruh simpangan baku relatifnya. Penyesuaian ini dilakukan sebagai
berikut: pertama, rasio split±10% metode analisis yang digunakan untuk GC-MS dan GC-FID
diubah dari 1:25 menjadi 1:23 dan 1:27. Kedua, laju aliran dari 1,0 mL/menit disesuaikan
menjadi 0,8 mL/ menit dan 1,2 mL/menit untuk HPLC-DAD.
 E. Penentuan Konsentrasi Formaldehid, Diazolidinil Urea,dan Imidazolidinil Urea

Penentuan formaldehida dilakukan dengan menimbang 150 mg sampel yang telah

dihomogenkan dan dimasukkan ke dalam headspace vial dan ditambahkan 70 µL aseton standar
internal dan 5 mL pelarut. Proses ini dilakukan tiga kali dengan masing-masing injeksi.
Solusinya juga disuntikkan tiga kali. Metode HPLC-DAD digunakan untuk mengukur kadar
diazolidinyl urea (DU) dan imidazolidinyl urea (IU) sebagai pelepas formaldehida dalam
kosmetik krim.

F. Penentuan Pengaruh Etanol Terhadap Konsentrasi Pelepasan Formaldehida

Pengaruh etanol terhadap pelepasan formaldehid dianalisis dengan menambahkan 5 mL

etanol absolut ke dalam 10 g matriks krim dan mengaduk campuran secara homogen. Sejumlah
150 mg matriks sampel spiked (Berduri) ditimbang dan dilarutkan dalam 5 mL pelarut, dan
pemulihan persen dihitung
 BAB III

HASIL DAN DISKUSI

Formaldehida dapat ditentukan dengan kromatografi gas setelah derivatisasi dengan P-asam
toluenasulfonat dalam etanol membentuk dietoksimetana dengan massa molekul 104,15 g/mol. Penelitian
sebelumnya mengembangkan dan memvalidasi metode analisis kontaminasi formaldehida dalam sampel
eksipien obat menggunakan teknik ini dan instrumen GC-MS. Bashir Daoud Agha Dit Daoudy dkk.
mengembangkan lebih lanjut metode ini untuk menganalisis formaldehida dalam eksipien obat
menggunakan GC-FID. Derivatisasi ini dapat memodifikasi gugus fungsi senyawa, meningkatkan
stabilitasnya, dan memungkinkan pendeteksiannya. Skema reaksi derivatisasi antara formaldehida dan
etanol dengan P-asam toluenasulfonat ditunjukkan dalam Gambar 1.

Dalam pengembangan metode analisis formaldehida ini, penggunaan aseton standar internal
dapat meningkatkan perolehan dan presisi akibat kehilangan analit selama proses pengujian. P-Asam
toluenasulfonat dalam etanol dipilih sebagai pelarut dan agen derivatisasi. Formaldehida dapat bereaksi
cepat dengan etanol yang mengandung katalis asam menghasilkan dimetoksimetana asetal yang mudah
menguap dengan titik didih 88°C sehingga kadarnya dapat ditentukan dengan kromatografi gas. Etanol
juga mampu membubarkan matriks krim kosmetik dengan sempurna. Jumlah etanol yang digunakan
harus berlebih agar reaksi derivatisasi dapat berlangsung dengan sempurna. P-Asam toluenasulfonat
adalah katalis baru dalam kimia organik. Ini adalah katalis asam sulfonat komersial dengan pKa-Nilai dari
2,8.

Modifikasi metode dimulai dengan optimasi yang meliputi pemilihan kolom, penentuan suhu dan
waktu inkubasi, penentuan konsentrasi optimum P-asam toluenasulfonat dalam etanol yang digunakan,
dan program suhu yang dapat memberikan hasil uji kesesuaian sistem yang memenuhi kriteria
penerimaan standar deviasi relatif (RSD) dari waktu dan luas retensi, resolusi, faktor tailing, dan nilai
pelat teoritis atau efisiensi kolom.
 Kolom yang digunakan untuk optimasi adalah kolom 1 MS, 5MS, dan Wax 30 m (0,25 mm ×
0,25 mikron). Kolom 1 dan 5 MS yang lebih nonpolar memberikan respons puncak dengan faktor
tailing(TF) lebih dari 2,5 karena terdapat puncak senyawa interferensi yang tidak dapat dipisahkan
sehingga mengganggu analisis. TF mulai dari 0,9 hingga 1,4 dianggap baik. Dengan menggunakan kolom
Rtx-Wax 30 m yang lebih polar, puncak-puncak senyawa interferensi dapat dipisahkan dengan resolusi
(R) lebih dari 1,5 dan a TF dari 0,985. Turunan formaldehida dietoksimetana memiliki titik didih rendah
dan menghasilkan waktu retensi cepat 2,9 menit, tidak ditahan oleh kolom; karenanya, kolom lilin dengan
ketebalan film yang lebih besar dipilih untuk meningkatkan faktor kapasitasnya sesuai dengan
persyaratan umum kromatografi, 1≤ k’ ≤ 10. Kolom lilin yang digunakan pada awal optimasi memiliki
ketebalan film 0,25 m, menghasilkan faktor kapasitas 0,7. Untuk pengujian lebih lanjut, kolom lilin
dengan ketebalan film 0,5 m digunakan dengan faktor kapasitas 1,54. Ketebalan film kolom yang lebih
besar paling cocok untuk analit dengan titik didih rendah (seperti senyawa organik dan gas volatil),
sehingga analit akan tertahan lebih lama.

Optimasi suhu dan waktu inkubasi dilakukan untuk mengetahui kondisi optimum yang
menghasilkan respon area terbaik sehingga diperoleh nilai presisi dan akurasi yang memenuhi
persyaratan. Optimasi dilakukan pada lima konsentrasi p-asam toluenasulfonat dalam etanol, dan hasil
optimasi menunjukkan bahwa peningkatan respon puncak tertinggi terjadi pada konsentrasi 1,0%.
Optimalisasi program temperatur bertujuan untuk menghasilkan data uji kesesuaian sistem yang
memenuhi persyaratan, termasuk TF, R, dan efisiensi kolom atau nilai pelat teoritis (N). Pada elusi suhu
konstan selama proses analisis, respon puncak diperoleh dengan faktor tailing yang besar karena tidak
dapat memisahkan puncak dari beberapa komponen. Oleh karena itu, analisis ini menggunakan suhu yang
diprogram untuk memulai pada 34°C dan tahan selama 15 menit, meningkat 40 °C per menit hingga
mencapai 220 °C lalu tahan selama 5 menit. Hasil optimasi dari P-derivatisasi asam toluenasulfonat
ditunjukkan pada Gambar 2.
 Validasi metode dimulai dengan uji selektivitas untuk memastikan analit tidak terpengaruh oleh
adanya komponen lain dengan membandingkan pelarut, blanko, standar, dan sampel berduri dan senyawa
lain yang memiliki sifat fisik dan kimia yang mirip dengan produk pengotor atau degradasi yang mungkin
terjadi terkandung dalam krim produk kosmetik. Hasil uji selektivitas kromatogram untuk turunan
formaldehida dan senyawa lain yang serupa secara struktural ditunjukkan pada Gambar 3.

Koefisien korelasi (R) dan koefisien regresi varians (Vx0) digunakan untuk menyetujui uji
linieritas. Linearitas metode DNPH-HPLC-DAD diperoleh dengan R dari 0.9999, V x0 0,61%, dan
rentang konsentrasi 0,5− 4,0 g/mL. Linearitas metode derivatisasi menggunakan 1%P-asam
toluenasulfonat dalam etanol statis headspace GC-MS diperoleh dengan r = 1,0000 dan Vx0 = 1,62% dan
konsentrasi berkisar antara 2,0 hingga 20,0 g/mL (Gambar 4 ). Linearitas metode derivatisasi
menggunakan 1.0%P-asam toluenasulfonat dalam etanol GC-FID dengan teknik injeksi cair diperoleh
dengan r = 0,9999 dan Vx0 = 1,35% dan konsentrasi berkisar antara 100,0 hingga 800,0 g/mL.
 LOD dan LOQ dari ketiga metode dihitung dari uji linieritas dan diperoleh sebesar 0,0099 dan
0,0329 g/mL untuk HPLC-DAD; 0,0158 dan 0,0528 g/mL untuk GCMS; dan 1,1287 dan 3,7625 g/mL
untuk GC-FID.

Uji ketelitian dilakukan dengan cara spiking larutan standar formaldehida yang telah diketahui
konsentrasinya ke dalam matriks sampel, dan membandingkan hasil yang diperoleh dari pengujian
dengan konsentrasi standar yang diperoleh secara teoritis. Akurasi dinyatakan sebagai nilai pemulihan,
dan hasilnya ditampilkan di Tabel 1a dan 1b.

Kriteria penerimaan: %Pemulihan: 95−105%; RSD: 3,7%DNPH (2,4-

dinitrofenilhidrazin). DNPH (2,4- dinitrophenylhydrazine). HPLC-DAD (high-
performance liquid chromatography-diode array detector). SHS-GC-MS (static
headspace-gas chromatography-mass spectrometry). GC-FID (gas
chromatography-flame ionization detection). RSD (relative standard deviation).

DNPH (2,4-dinitrophenylhydrazine). HPLC-DAD (high-performance liquid

chromatography-diode array detector). SHS-GC-MS (static headspace-gas
chromatography-mass spectrometry). GC-FID (gas chromatography-flame ionization
detection). RSD (relative standard deviation), Horwitz and Horrat: kriteria penerimaan
uji akurasi dan presisi (pedoman AOAC).
 Uji presisi dilakukan intraday untuk pengulangan dan interday untuk presisi menengah.
Ketepatan interday dilakukan sebanyak enam kali pengulangan pada tiga hari yang berbeda. Parameter
presisi yang diukur adalah RSD, confidence interval (CI), Nilai Horrat, dan Intensitas Relatif (% puncak
dasar) larutan sampel berduri dibandingkan dengan larutan standar untuk metode GC-MS.
Dietoksimetana memiliki tiga ion konfirmasi m/ z, yaitu 31,0; 59,0 sebagai puncak basa, dan 103,0. Hasil
uji presisi ditunjukkan pada Tabel 2.

Kriteria penerimaan: %Pemulihan: 95−105%; RSD: 3,7% SD = simpangan baku. RSD =

simpangan baku relatif.

Intensitas relatif (%) massa (m/ z) oleh GC-MS dapat dilihat di Tabel 3, dan spektrum massa
untuk dietoksimetana sebagai produk turunan dari larutan standar, larutan sampel, larutan sampel berduri,
dan dietoksimetana dari perpustakaan ditunjukkan pada Gambar 5.

m/z (rasio massa-untuk-muatan). GC-MS (kromatografi gas-

spektrometri massa). GC-EI-MS (kromatografi gas-elektron
dampak-spektrometri massa).
 Sampel dianalisis ketika metode validasi memenuhi semua persyaratan. Sampel yang diuji adalah
enam sampel yang diperoleh dari post market surveillance sampling untuk kosmetik perawatan kulit di
Badan Pengawas Obat dan Makanan Provinsi Bandung, Indonesia. Kadar formaldehida yang dilepaskan
pada produk krim dianalisis menggunakan metode GC-MS, GC-FID, dan HPLC-DAD, dan kadar
pengawet dianalisis menggunakan metode HPLC-DAD dengan sistem elusi gradien. Kadar pengawet
dalam kosmetik krim berhubungan dengan kadar formalin yang dilepaskan. Hasil pengujian dari enam
sampel krim ditunjukkan pada Tabel 4 telah memenuhi semua persyaratan.

DU (diazolidinil urea). IU (imidazolidinil urea). C (konsentrasi). HPLC-DAD (high-performance liquid

chromatography-diode array detector). GC-MS (kromatografi gas-spektrometri massa). GC-FID (gas
chromatography-flame ionization detector). SD (standar deviasi). RSD (deviasi standar relatif). n.q (tidak
dihitung).

Berdasarkan hasil, metode GC-MS yang diusulkan dapat diterima sebagai metode analisis untuk
analisis rutin. Selain itu, hasil yang diperoleh dari metode GC-MS secara statistik serupa dengan yang
diperoleh dari metode derivatisasi DNPH menggunakan HPLC, yang merupakan metode yang paling
stabil. Senyawa DNPH, seperti yang ditunjukkan pada Tabel 5.
 KESIMPULAN

Metode asli untuk analisis diacetyl dan acetylpropionyl telah dikembangkan dan sebagian
divalidasi. NS Metode ini memiliki nilai LOQ yang sangat baik dan telah berhasil digunakan
untuk pengukuran dua analit dalam partikulat dan fase uap yang dihasilkan oleh beberapa
elektronik perangkat merokok. Selain itu, analit yang menarik adalah juga diukur dalam
sejumlah e-liquid yang tersedia di pasar.
 DAFTAR PUSTAKA

Yuniati, Wiwiet. Amelia, Tasia. Ibrahim, Slamet. Damayanti, Sophi (2021). Analytical
Method Development for Determining Formaldehyde in Cream Cosmetics Using Hyphenated
Gas Chromatography. ACS Omega 2021, (6), 28403−28409. https://pubs.acs.org/journal/acsodf