TUGAS MAKALAH VALIDASI

“DEVELOPMENT AND VALIDATION OF HPLC METHOD FOR

DETERMINATION OF INDOMETHACIN AND ITS TWO DEGRADATION
PRODUCTS IN TOPICAL GEL”
Disusun oleh :
Kelompok 3
Mira Dwinita 10060312173
Ahmad Sofyan 10060316090
Fakhrur Razid 10060316092
Siti Nadhira 10060316095
Via Pujiah 10060316099
Wynthi Agustina C.P 10060316110
Kiti Dovianti 10060316113
Delia Nurul Husna 10060316121
Faishal Ahmad Najib 10060316127
Rani Rahmawati 10060316128

PROGRAM STUDI FARMASI

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS ISLAM BANDUNG
1441 H / 2019 M
I. Pendahuluan

Indometasin merupakan obat inflamasi golongan NSAID, analgetik dan

antipiretik. Kerja dari indometasin adalah menghambat kerja enzim
siklooksigenase (COX). Obat ini biasanya diberikan secara oral, intravena, atau
sebagai suppositoria dan gel topikal. Dekomposisi dari indometasin membentuk
dua produk degradasi yaitu asam 4-kloro-benzoat dan 5-metoksi-2-
metilindoasetat asam. Kedua zat ini harus terus diamati selama proses pembuatan
dan penyimpanan untuk mengontrol kualitas (pengotor yang tidak diinginkan atau
produk degradasi) dan kuantitas(pengujian zat aktif) pada sediaan farmasi.

Menurut farmakope Eropa, penentuan indometasin menggunakan metode

titrasi, dimana indometasin dititrasi dengan menggunakan NaCl 0,1M. Metode
titrasi ini diperlukan waktu yang lama dan metode ini tidak praktis karena untuk
analisis sampel sediaan farmasi yang harus dilakukan secara rutin, terutama
selama penentuan stabilitas dan uji kualitas dalam proses pembuatan, dimana ada
banyak sampel yang harus diuji dan diperiksa.

Pada USP 26 penentuan zat indometasin menggunakan kolom analisis yang

mengandung L1 (ODS yang secara kimia terikat pada silika). Kemudian untuk
penentuan indometasin dalam kapsul dan suppositorian digunakan
spektrofotometer serapan. Pada semua metode tersebut tidak ada metode yang
dapat mengidentifikasi senyawa hasil degradasi dari indometasin. Dalam
penelitian lainnya indometasin pada suspensi oral, sediaan injeksi dilakukan
analisis menggunakan HPLC untuk penentuan zat aktif indometasin dan asam 4-
klorobenzoat sebagai pengotor dalam proses analisis. Kemudian pada sediaan
kapsul lepas lambat zat aktif indometasin ditentukan penyerapannya
menggunakan spektrofotometri dan pemeriksaan 4-klorobenzoat menggunakan
RP-HPLC. Dari beberapa penelitian tersebut tidak ada satupun metode yang dapat
menentukan baik indometasin dan pengotornya.
 Adapun hasil penelitian lain dengan menggunakan teknik modern. Loffler and
Ternes employ LC-APCI-MS-MS menentukan asam yang terdapat dalam
indometasin (pada senyawa lainnya seperti diklofenak, ibuprofen, fenoprofen, dan
gemfibrozil) dengan ionisasi dalam keasaan negatif. Untuk semua obat-obatan
digunakan kolom analitik LiChrospher RP-18 (125mm × 3mm, 5m) dengan batas
kuantitas untuk semua senyawa asam berkisar antara 0,4 hingga 8ng/g.

Obat-obatan asam (indometasin, ibuprofen, diklofenak, bezafibrate, dan

lainnya) juga dianalisis oleh Miao et al. Mereka menggunakan kromatografi cair-
ion ionionisasi spektrometri massa tandem. Analisis dilakukan dengan
menggunakan kolom Genesis C18 (150 mm x 2.1 mm, i.d., 4 µm). Metode ini
memberikan hasil 58,5% untuk indometasin dan batas uji (Limit Of Detection)
untuk senyawa ini adalah 10 ng /l.

Abed-Hamid et al. mengembangkan metode untuk penentuan natrium

diklofenak, asam flufenamat, indometasin dan ketoprofen dengan LC-APCI-MS.
Metode ini memberikan hasil persentase rata-rata 99,5-101,5%. LOD untuk
indometasin adalah 4,0 ng/ml dan batas kadar (Limit Of Quantitation) sebesar 100
ng/ml. Semua metode ini memiliki sensitivitas dan selektivitas yang sangat baik
untuk senyawa yang disebutkan. Kerugian utama mereka adalah kompleksitas
instrumen dan biaya yang mahal. Terdapat banyak metode lain menggunakan
HPLC sederhana dengan deteksi ultraviolet atau fluorimetri.

Mereka biasanya menentukan indometasin bersama dengan obat non-steroid

lain, obat antiinflamasi steroid dalam cairan biologis, penelitian distribusi obat,
dan penentuan residu indometasin pada unggas. Indometasin bersama dengan
hidrokortison, deksametason, fenilbutason dan oksifenbutason dalam serum kuda
ditentukan oleh Grippa et al. Metode ini menggunakan HPLC sederhana dengan
deteksi UV pada 254 nm dengan fase diam C18. Batas kadar untuk indometasin
adalah 0,5 µg/ml. Indometasin dan NSAID lain sering diuji dalam urin manusia,
 serum manusia, aqueous humor dan paling umum dalam plasma manusia
menggunakan metode HPLC.

Hanya terdapat dua metode untuk menentukan zat yang berasal dari
indometasin. Vree et al. menentukan indometasin dan metabolitnya (O-
desmethylindomethacin, deschlorobenzoyl indometasin) dan glukuronida dalam
plasma dan urin manusia. Smith dan Benet menentukan indometasin bersama
dengan dua metabolit primernya (demethylmetabolite dan
dechlorbenzoylmetabolite) dalam urin. Penting untuk menekankan bahwa
terlepas dari banyaknya metode HPLC untuk penentuan indometasin, tidak ada
metode untuk menentukan indometasin dan dua produk degradasinya dalam satu
analisis secara bersamaan termasuk standar internal juga. Untuk mencapai tujuan
ini perlu dikembangkan metode analisis yang baru, sederhana dan cepat untuk
penentuan zat-zat ini secara bersamaan dalam formulasi farmasi. Dalam
penelitian kami, kromatografi cair kinerja tinggi dengan deteksi UV dipilih untuk
pemisahan, identifikasi dan penentuan kadar zat aktif indometasin dan dua produk
degradasinya yaitu asam 4-klorobenzoat dan asam 5-metoksi-2-metilindoleasetat
dalam formulasi indometasin topikal dan gel indobene.

II. Percobaan
2.1 Bahan kimia dan reagen

Standar kerja indometasin, 4-klorobenzoat asam, asam 5-metoksi-2-

metilindoleasetat, flurbiprofen dan ketoprofen (standar internal yang diuji),
digunakan untuk tujuan penelitian ini. Zat aktif indometasin (1-4-chlorbenzoyl) -5-
methoxy-2-methylindoleacetic acid) disediakan oleh Herbacos (Pardubice, Republik
Ceko), seperti sebelumnya asam propionat Ketoprofen (2- (3-benzoilfenil))
digunakan sebagai standar internal. Flurbiprofen (asam 2-fluoro
methylbiphenylacetic) diperoleh dari Sigma-Aldrich (Praha, Republik Ceko).
Kedua pengotor : asam 4-klorobenzoat dan 5-metoksi-2- asam metilindoleasetat
disediakan oleh Sigma Aldrich (Praha, Republik Ceko). Semua senyawa ini diperiksa
terhadap standar European Pharmacopoeia CRS (Strasbourg, Prancis). Asam fosfat
85% diperoleh dari Merck (Darmstadt, Jerman). Asetonitril, Supra-gradien diperoleh
dari Biotech (Scherlau Chemie, Jerman). HPLC grade methanol disediakan oleh
Sigma-Aldrich (Praha,Republik Ceko). HPLC grade air disediakan oleh Milli-Q
reverse osmosis Millipore (Bedford, MA, USA) yang ditemukan dalam Persyaratan
farmakope Eropa
2.2 Pengukuran spektra UV Spektrum

UV dari senyawa yang diuji diukur dengan spektrofotometer Hewlett Packard

8453 dilengkapi dengan perangkat lunak Chemstation (UV-vis untuk biokimia).
Larutan metanol dari senyawa individu disiapkan hingga konsentrasinya mirip
dengan nilai yang diharapkan dalam sediaan farmasi. Akhir konsentrasi kira-kira :
indometasin (250,0 mg / l), asam 4-klorobenzoat (5,0 mg / l), 5-metoksi- 2-
methylindoleacetic acid (5,0 mg / l), ketoprofen (10,0 mg / l) dan flurbiprofen (10,0
mg / l).
2.3 Kromatografi
Sistem Shimadzu LC-2010 C (Shimadzu, Jepang) adalah digunakan untuk
melakukan semua analisis. Deteksi individu senyawa dilakukan dengan detektor UV-
vis bawaan. Instrumen itu juga dilengkapi dengan oven kolom yang memungkinkan
suhu kontrol. Sampler otomatis bawaan dikondisikan pada 25°C. Perangkat lunak
kromatografi Kelas VP 5 digunakan untuk pengumpulan dan pemrosesan data.
Berbagai kolom analitik diuji. Perlengkapan tulis fase berdasarkan
octadecylsilca sorbent Supelco Discovery TM C18 (125mm × 4.0 mm, 5 m) dibeli
dari Sigma-Aldrich (Praha, Republik Ceko) dan Zorbax SB C18 (50mm × 4,6 mm,
1,8 m) tidak berhasil secara analitis pemisahan, sedangkan Zorbax SB-Phenyl (75mm
× 4.6mm, 3,5 m) dan Zorbax SB-CN (150mm × 4,6 mm, 5 m) memberikan hasil yang
baik. Semua kolom Zorbax diperoleh dari Agilent Teknologi (Praha, Republik Ceko).
 2.4 Referensi persiapan standar
Pertama, larutan stok standar internal dan pengotor disiapkan. larutan stok
standar internal disiapkan dengan melarutkan 50 mgof ketoprofen standar dalam 100
ml metanol. Larutan stok pengotor disiapkan dengan melarutkan 5,0 mg 4-
chlorobenzoat asam dan asam 5-metoksi-2-metilindoleasetat, masing-masing, dalam
100 ml metanol. Referensi larutan standar untuk indometasin analisis gel disiapkan
dalam 100 ml volumetrik labu dengan melarutkan 25,0 mg indometasin dalam
metanol.
Setelah itu, 2,0 ml larutan stok ketoprofen standar internal dan 10,0 ml
masing-masing larutan stok pengotor ditambahkan sebelum labu dibuat volume
dengan metanol. Larutan kerja standar internal disiapkan dengan menipiskan 10,0 ml
larutan stok standar internal dalam metanol hingga volume 500 ml. Jadi, konsentrasi
akhir standar ketoprofen internal selalu sekitar 10 mg / l. Itu perlu untuk menjaga
larutan stok dan larutan standar pada suhu kurang dari (4 ◦C) untuk alasan stabilitas.
2.5 Persiapan sampel

0,5 g gel indometasin topikal (yang sesuai dengan 5,0 mg zat aktif
indometasin) secara akurat ditimbang dan dipindahkan ke tabung centrifuge 50,0 ml.
Dua puluh mililiter larutan kerja standar internal di Indonesia metanol (1 mg / 100 ml
ketoprofen dalam metanol) ditambahkan. Campuran ini disonikasi selama 10 menit
dan kemudian sentrifuga selama 15 menit pada 1300 g (centrifuge laboratorium EBA
21, Hettich, Tutlingen, Jerman). Supernatan disuntikkan langsung ke sistem
kromatografi (atau disaring melalui filter 0,45 m terkadang bisa terjadi hasil
supernatan tidak cukup jelas).

2.6 Validasi metode

Tujuan validasi metode adalah untuk menunjukkan metode ini sesuai dengan
tujuan yang dimaksudkan seperti yang dinyatakan dalam Pedoman ICH Q2A dan
Q2B [22]. Rekomendasi validasi karakteristik tergantung pada jenis prosedur analitik.
Bagian penting dari validasi metode adalah uji kesesuaian sistem (SST), perincian
yang biasanya diberikan dalam farmakope. Kami telah menetapkan sejumlah pelat
teoritis, asimetri puncak, resolusi senyawa individu dan kemampuan ulang injeksi
(waktu retensi dan daerah puncak diperiksa).

Karakteristik validasi metode diuji sesuai dengan pedoman ICH dan

persyaratan farmakope. Kami telah menetapkan akurasi metode (% pemulihan dan %
R.S.D. pengukuran individu) dan ketepatan metode (% R.S.D.) Menggunakan enam
sampel dalam tiga ulangan. Linearitas (koefisien korelasi) diuji dalam kisaran 20-
150% untuk zat aktif indometasin (100-500 mg / l). Degradasi produk diuji dalam
kisaran 0,1-5% zat aktif konten (0,25-12,5 mg / l). Enam tingkat konsentrasi
digunakan. Selektivitas metode diverifikasi dengan perbandingan sampel persiapan
farmasi, larutan standar dan plasebo kromatogram. Batas deteksi dan kuantisasi
adalah disediakan untuk dua produk degradasi asam 4-klorobenzoat dan asam 5-
metoksi-2-metilindoleasetat. Perhitungannya adalah dibuat dengan menggunakan
metode rasio signal-to-noise. Standar stabilitas jangka pendek diuji pada suhu sekitar
(25 ◦C) dan pada 4 ◦C. Juga, metode ketahanan sehubungan dengan komposisi fase
seluler dipelajari.

III. Hasil dan Diskusi

3.1 Keadaan Kromatografi

Menurut Farmakope Eropa pengujian indometasin menggunakan metode

titrasi, sedangkan metode analitik yang dijelaskan dalam USP 26, menggunakan
beberapa metode untuk penentuan indometasi, termasuk menggunakan uji
spektrofotometri dan metode HPLC. Beberapa dari uji tersebut dapat ditentukan asam
4-klorobenzoat sebagai pengotor, tetapi tidak untuk menentukan jumlah asam 5-
metoksi-metilindoleasetat secara bersamaan dengan indometasin dan asam 4-
klorobenzoat.
 Metode yang digunakan HPLC dengan menggunakan detector UV. Metode
pemisahan digunakan karena cepat dan efektif untuk penentuan indometasin dan dua
produk degradasinya yaitu asam 5-metoksi-metilindoleasetat dan asam 4-
klorobenzoat. Hasil dari panjang gelombang penyerapan digunakan untuk mendeteksi
senyawa, yang berkaitan dengan spektrum serapan dari produk degradasi
indometasin. asam 5-metoksi-metilindoleasetat dan asam 4-klorobenzoat merupakan
produk degradasi yang terdetekdi oleh detektor lebih rendah dibandingkan dengan
zat aktif indometasin dan, Hasil dari spektrum UV senyawa individu dapat dilihat
pada Tabel 1.

( Tabel 1: data spectro UV dari senyawa individu)

Pengujian menggunakan kolom analitik. Diawali dengan penyiapan fase diam

konvensional berdasarkan pada octadecylsilica sorbent Supelco DiscoveryTM C18
(125 mm × 4 mm, 5 m). kemudian fase gerak terdiri dari air, metanol, asetonitril, dan
fosfat 0,2% asam dalam berbagai tingkat dan kombinasi, namun hasil yang didapat
masih belum memuaskan. Hal itu dikarenakan adanya gangguan plasebo pada waktu
retensi senyawa. Kemudian dilakukan penggantian kolom analitik menggunakan
Zorbax SB C18 (50 mm × 4,6 mm, 1,8 m), pada senyawa yang diuji, namun hasil
tetap dapat menghilangkan gangguan plasebo. Namun pengujian pada fase stasioner
menunjukan hasil yang lebih baik.
 Pada pengujian kolom analitik menggunakan Agilent Zorbax dengan fase
gerak asetonitril dan asam fosfat 0,2% memiliki hasil yang terbaik dalam
pebandingan dan laju aliran fase gerak yang berbeda. Kemudian dilakukan dengan
pengujian kolom analitik menggunakan Zorbax SB-Phenyl (75 mm × 4,6 mm, 3,5 m)
waktu yang dibutuhkan untuk pemisahan indometasin dan dua produk degradasinya
sekitar 7,5 menit. Kromatografi dilakukan menggunakan elusi isokratik dengan fase
gerak biner, terdiri dari asetonitril dan 0,2% asam fosfat (50:50, v / v) pada laju aliran
0,6 ml / menit.

Pada pemisahan standar yang lebih cepat diperoleh dengan menggunakan

kolom analitik Zorbax SB-CN (150 mm × 4,6 mm, 5 m), dikarenakan pemisahan itu
dipengaruhi oleh adanya fase gerak dari komposisi yang sama, namun untuk laju
aliran ditingkatkan menjadi 1,2 ml / menit, dengan menggunakan panjang gelombang
237 nm dan ketoprofen atau flurbiprofen sebagai standar internal untuk hasil yang
dapat dihitung. Dalam uji analisis salep dan gel, prosedur persiapan sampel
menggunakan metode standar internal yang disimpan pada suhu ruangan.

Metode pertama menggunakan kolom Zorbax SB-Phenyl untuk validasi

karena gangguan plasebo dihilangkan. Pemisahan senyawa pada metode ini
membutuhkan waktu sekitar 7,5 menit.
 (Kromatogram 1: Kromatogram LC-UV (237 nm) diperoleh dari analisis senyawa dalam larutan
standar, indometasin (250,0 mg / l), ketoprofen (10,0 miligram standar internal per liter), asam 4-
klorobenzoat (5,0 mg) / l) dan asam 5-metoksi-2-metilindoleasetat (5,0 mg / l) = pengotor 1).

Parameter kesesuaian sistem dan parameter validasi termasuk ketepatan

metode, akurasi, linieritas, selektivitas dan ketahanan dapat ditetapkan. Metode ini
berhasil diterapkan untuk penentuan indometasin dan produk degradasinya dalam
bentuk sediaan gel topikal dan sebagai kontrol senyawa degradasi selama uji
stabilitas.

3.2 Prosedur Isolasi

Prosedur isolasi telah dikembangkan berdasarkan metode untuk analisis

persiapan topical yang sering digunakan di labolatorium kita, 2 media ekstraksi telah
di uji yaitu asetonitril dan methanol. Akhirnya, methanol yang dipilih karena hasil
placebo yang rendah menggunakan media ekstraksi ini. Standar internal Ketoprofen
ditambahkan seperti yang telah dijelaskan di prosedur yang telah dikembangkan oleh
Abed-Hamid, menghasilkan recovery sebesar 95,05-100,04%.
 (Gambar.3 menunjukan ilustrasi pemisahan semua senyawa yang di uji setelah di isolasi dari
sediaan farmasi).

Berdasarkan hasil dari kromatogram, diperoleh dari analisis senyawa dalam

formulasi indometasin gel, dapat dilihat adanya 2 jenis pengotor yaitu asam 4-
chlorobenzoid dan asam 5-methoxy-2-methylindoleacetic.

3.3 Metode Validasi

Setelah pengembangan dan optimasi metode selesai, perlu untuk

menyelesaikan validasi metode. Mengikuti pedoman ich international untuk analisis
metode validasi. (Q2A dan Q2B) bersama dengan aturan di laboratorium, parameter
SST dan validasi diukur. Karakteristik validasi yang disarankan termasuk ketepatan
metode (%R.S.D), ketepatan metode (%dari pemulihan, %R.S.D.) tentang linier
(koefisien korelasi) dan selektivitas metode menggunakan placebo formulasi farmasi
yang sudah ditetapkan. LOD dan LOQ disediakan untuk produk degradasi asam 4-
klorobenzoat dan asam 5-metoksi-2-metilindoasetat dengan menggunakan metode
sinyal untuk rasio kebisingan.

Stabilitas jangka pendek dari senyawa yang menarik adalah diuji. Larutan
standar disimpan pada suhu sekitar (25oC) dan penurunan suhu (4 oC). Perubahan
dalam isi asam 5-metoksi-2-metilindoasetik, lebih tinggi dari 1%, diamati pada
penyimpanan dalam suhu kamar tabel 2.
 (Tabel 2 pengujian stabilitas senyawa)

Perubahan yang sama tidak diamati pada penurunan suhu, semua senyawa
menunjukkan puncak area berubah hingga 1%. Ini menunjukkan bahwa larutan stok
dan larutan standar harus disimpan pada suhu 4 oC. Pengaruh perubahan kecil dalam
komposisi fase gerak ±10% akan dipelajari untuk kekuatan determinasi dari metode.
Area puncak dan perubahan waktu retensi diamati. Hasil dapat dilihat di table 3.

(Tabel 3 pengamatan waktu retensi)

Nilai daerah puncak dipengaruhi sedikit sampai 2% untuk indometasin dan

asam 4-klorobenzoat. Mengenai asam 5-metoksi-2-metilindoasetat, perubahan lebih
signifikan khususnya dengan 10% perubahan dalam fase gerak. Waktu retensi
senyawa tertarik pengaruh signifikan hanya dalam indometasin. Meskipun perubahan
waktu retensi dalam pemisahan mencukupi, dengan demikian kuantitasi dapat
dimungkinkan. Menunjukan hasil yang sesuai diharapkan dapat dilihat pada tabel 4.
 (Tabel 4: metode validasi senyawa individu)

3.4 Aplikasi Farmasi

Metode analitik baru untuk penentuan zat aktif indometasni dan dua
pengotornya asam 4-klorobenzoat dan asam 5-metoksi-2-metilindolasetat.
Pengembangan ini bekerja efektif, cepat dan memnuhi semua kriteria untuk metode
validasi. Metode ini dapat berhasil diterapkan dengan praktis. Ini digunakan untuk
penentuan indometasin dalam uji sediaan farmasi gel indometasin dan dapat
diterapkan dalam analisis gel indoben. Untuk tujuan, metode belum divalidasi sejauh
ini, tetapi dapat digunakan secara sederhana seperti yang terlihat dari analisis
pendahuluan. Metode ini juga memungkinkan kontrol proses degradasi dalam
penelitian stabilitas formulasi ini, karena batas deteksi dan kuantitas untuk produk
degradasi disediakan. Dari data tabel 4 dapat dilihat bahwa semua senyawa
menujukkan hasil yang di harapakan dimana semua senyawa tidak melebihi batas
yang ditentukan.

IV. Kesimpulan

Kami telah mengembangkan metode analisis yang cepat, sederhana dan

otomatis untuk penetapan simultan indometasin dan 2 pengotor dalam preparasi
farmasi menggunakan HPLC dengan deteksi UV. Metode ini menggunakan
ketoprofen standar internal untuk kuantitatif dan penghapusan penyimpangan selama
prosedur isolasi. Analisis ini memakan waktu < 7,5 menit. Pemisahan senyawa
terjadi sangat cepat dengan resolusi yang cukup, reproduksifitas yang baik dan
puncak yang tidak simetris. Hasil validasi pada metode ini memenuhi semua
persyaratan. Metodenya sederhana, dapat direproduksi dengan keakuratan dan
ketepatan yang baik. Hal ini memungkinkan analisis untuk menarik semua senyawa
dalam simulasi sediaan gel topikal indometasin pada satu proses analisis dalam waktu
yang singkat. Setelah validasi tambahan, seharusnya dapat digunakan juga untuk
formulasi farmasi dan indobene gel lainnya.